王仁廣 隋欣彤 汪艷群 王鑫榮 鐘修俊 趙天倚 王淑敏

摘 要 目的：優(yōu)化白屈菜的蜜炙工藝。方法∶以水與煉蜜質(zhì)量比、蜜水與白屈菜質(zhì)量比、炒制溫度、炒制時間為考察因素，白屈菜堿、鹽酸黃連堿、血根堿、小檗堿、白屈菜紅堿總含量為響應(yīng)值，采用Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化其蜜炙工藝并驗(yàn)證。結(jié)果：最優(yōu)蜜炙工藝為水與煉蜜質(zhì)量比1 ∶ 1.9（g/g），蜜水與白屈菜質(zhì)量比21 ∶ 100（g/g），炒制溫度122 ℃，炒制時間10.40 min。經(jīng)3次試驗(yàn)驗(yàn)證，5種成分的平均總含量為10.37 mg/g，RSD為0.23%，與預(yù)測值（10.39 mg/g）的相對誤差為0.19%。結(jié)論：優(yōu)化所得白屈菜蜜炙工藝穩(wěn)定、可行。

關(guān)鍵詞 白屈菜;蜜炙工藝;Box-Behnken響應(yīng)面法;含量測定

ABSTRACT ? OBJECTIVE： To optimize the honey-stir-fried technology of Chelidonium majus. METHODS： Taking the mass ratio of water to honey， the ratio of honey water to C. majus， stir-fired temperature， stir-fired time as the factors， the total contents of chelidonine， coptisine hydrochloride， sanguinarine， berberine， chelerythrine as response values， Box-Behnken response surface method was used to optimize the processing technology， and valifation test was conducted. RESULTS： The optimum process conditions were as follows the ratio of water to refined honey 1 ∶ 1.9 （g/g）， the ratio of honey water to C. majus 21 ∶ 100 （g/g）， stir-fried temperature 122 ℃， stir-fried time 10.40 min. After 3 times of validation， average total contents of 5 components was 10.37 mg/g （RSD=0.23%）， relative error of which with predicted value （10.39 mg/g） was 0.19%. CONCLUSIONS： The optimized honey-stir-fried technology of C. majus is stable and feasible.

KEYWORDS ? Chelidonium majus; Honey-stir-fried technology; Box-Behnken response surface method; Content determination

白屈菜為罌粟科植物白屈菜Chelidonium majus L.的干燥全草，味苦，性涼，有毒，具有解痙止痛、止咳平喘的功效[1]。藥理研究表明，白屈菜具有抑制平滑肌、抗菌、抗炎、抗病毒、抗氧化等多種作用，在臨床中被廣泛用于治療潰瘍、痙攣、口腔感染、慢性支氣管炎、肺結(jié)核和哮喘等疾病[2-8]。白屈菜主要含有生物堿類和非生物堿類成分，而生物堿類成分是其主要的藥效成分，包括白屈菜堿、普魯托品、白屈菜紅堿、甲氧基白屈菜堿、血根堿、隱品堿、原阿片堿、小檗堿、鹽酸黃連堿、木蘭花堿等[2，9]。有研究將白屈菜堿、鹽酸黃連堿、血根堿、小檗堿、白屈菜紅堿作為白屈菜化學(xué)分析的指標(biāo)性成分[10-12]。據(jù)文獻(xiàn)報道，白屈菜在治療某些胃和膽道疾病時可引發(fā)急性肝炎，嚴(yán)重者甚至可導(dǎo)致肝衰竭[13]。白屈菜紅堿可劑量依賴性地對大鼠肺組織產(chǎn)生長期毒性作用，并且可在一定劑量下引起大鼠全身性異常反應(yīng)[14-15]。因此，通過炮制降低白屈菜對肝、肺等器官組織的損害，對提高該藥臨床應(yīng)用的安全性和有效性具有重要的意義。

目前，2020版《中國藥典》（一部）中關(guān)于白屈菜炮制的記載僅有凈制方法[1]。有學(xué)者利用醋燜法炮制白屈菜，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，白屈菜醋制品中白屈菜堿等6種生物堿成分的總含量略低于生品[16]。蜜炙是中藥炮制的重要方法之一，其可增強(qiáng)中藥的止咳平喘活性并減少毒副作用[17-18]。現(xiàn)代藥理研究表明，紫菀、麻黃、白花前胡等入肺經(jīng)中藥，經(jīng)蜜炙后可增強(qiáng)其潤肺止咳的功效[19-21]。白屈菜亦為入肺經(jīng)中藥，所含的生物堿成分是其發(fā)揮止咳平喘作用的藥效成分，加之蜂蜜也具有潤肺止咳和一定的解毒作用，因此用蜂蜜炮制白屈菜可能會起到協(xié)同和減毒作用[9，22]。

Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計法適用于多因素、多水平的工藝考察試驗(yàn)，可通過指標(biāo)量化和非線性擬合建立直觀的數(shù)學(xué)模型來篩選最優(yōu)工藝，預(yù)測科學(xué)、客觀且準(zhǔn)確性較高[23]?；诖?，本研究采用高效液相色譜法（HPLC）同時測定白屈菜蜜炙品中白屈菜堿、鹽酸黃連堿、血根堿、小檗堿、白屈菜紅堿的含量;同時以水與煉蜜質(zhì)量比、蜜水與白屈菜質(zhì)量比、炒制溫度、炒制時間為考察因素[17-18，24]，蜜炙品中白屈菜堿、鹽酸黃連堿、血根堿、小檗堿、白屈菜紅堿總含量為響應(yīng)值，采用Box-Behnken響應(yīng)面法對其蜜炙工藝進(jìn)行優(yōu)化，以期為白屈菜的炮制加工生產(chǎn)提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究主要所用儀器有LC-2030型HPLC儀及配套的四元梯度泵、紫外檢測器、自動進(jìn)樣器、化學(xué)工作站（日本Shimadzu公司），HH-6型數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州市江南實(shí)驗(yàn)儀器廠），MS-5型炒貨機(jī)（常州市金壇邁斯機(jī)械有限公司），DE-100型高速萬能粉碎機(jī)（浙江紅景天工貿(mào)有限公司），EL-204萬分之一型電子分析天平、AB135-S型十萬分之一電子分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）等。

1.2 藥材與試劑

白屈菜飲片（批號C18112303）購自河北仁心藥業(yè)有限公司，經(jīng)長春中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院姜大成教授鑒定為 C. majus L.的干燥全草;白屈菜堿對照品（批號DST190911-079）、鹽酸黃連堿對照品（批號DST190913- 003）、血根堿對照品（批號191115-002）、小檗堿對照品（批號DST180603-009）、白屈菜紅堿對照品（批號34316-15-9）均購自成都德思特生物技術(shù)有限公司，純度均不低于98%;椴樹蜂蜜（批號SC12622242612379）購自吉林汪氏蜜蜂園有限公司;乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 煉蜜的制備

取蜂蜜適量，用中火加熱至微沸后再用文火加熱，使溫度達(dá)116～118 ℃;加熱至滿鍋起魚眼泡、手捻有黏性、兩指間尚無長白絲出現(xiàn)，即得煉蜜。每10.00 g蜂蜜可得煉蜜8.01 g[25]。

2.2 白屈菜蜜炙品的制備

取“2.1”項下所得煉蜜，用適量沸水稀釋后，加入白屈菜飲片50.0 g，拌勻，悶潤20 min，待蜜汁滲入飲片組織內(nèi)部后，置于炒貨機(jī)內(nèi)炒至顏色變深、不粘手時取出，放晾，即得白屈菜蜜炙品。

2.3 白屈菜蜜炙品中白屈菜堿等5種成分的含量測定

2.3.1 色譜條件 以Waters T3-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）為色譜柱，以乙腈（A）-1%三乙胺溶液（用磷酸調(diào)節(jié)pH至3.0，B）為流動相進(jìn)行梯度洗脫（0～5 min，19%A;5～15 min，19%A→23%A;15～45 min，23%A→25%A），柱溫為40 ℃，流速為1.0 mL/min，檢測波長為269 nm，進(jìn)樣量為5 μL。

2.3.2 混合對照品溶液的制備 取白屈菜堿、鹽酸黃連堿、血根堿、小檗堿、白屈菜紅堿對照品各適量，精密稱定，加甲醇溶解并定容至25 mL量瓶中，搖勻，制得上述5種成分質(zhì)量濃度分別為501.00、1 163.80、200.60、50.10、100.50 μg/mL的混合對照品溶液。

2.3.3 供試品溶液的制備 取“2.2”項下所得白屈菜蜜炙品粉末（過三號篩），約1 g，精密稱定，置于圓底燒瓶中，精密加入鹽酸-甲醇混合溶液（0.5 ∶ 100，V/V）20 mL，稱定質(zhì)量，加熱回流1 h，放冷，再次稱定質(zhì)量，用鹽酸-甲醇混合溶液（0.5 ∶ 100，V/V）補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液10 mL，蒸干，殘渣加50%甲醇使溶解，轉(zhuǎn)移至10 mL量瓶中，加入50%甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.3.4 陰性對照溶液的制備 以50%甲醇為陰性對照溶液。

2.3.5 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 取上述混合對照品溶液、供試品溶液、陰性對照溶液各適量，按“2.3.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖，詳見圖1。由圖1可知，在該色譜條件下，各成分色譜峰分離度均大于1.5，理論板數(shù)均大于3 000，且陰性對照對待測成分的測定無干擾。

2.3.6 線性關(guān)系考察 取“2.3.2”項下混合對照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL，分別置于10 mL量瓶中，加甲醇定容，搖勻，制得系列質(zhì)量濃度的線性關(guān)系溶液，按“2.3.1”項下色譜條件進(jìn)樣，以各待測成分質(zhì)量濃度（x，μg/mL）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，結(jié)果見表1。

2.3.7 精密度試驗(yàn) 精密吸取“2.3.2”項下混合對照品溶液適量，加甲醇稀釋4倍后，按“2.3.1”項下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測定6次，記錄峰面積。結(jié)果，白屈菜堿、鹽酸黃連堿、血根堿、小檗堿、白屈菜紅堿峰面積的RSD分別為0.23%、0.23%、0.25%、0.26%、0.32%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.3.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.3.3”項下供試品溶液適量，分別于室溫下放置0、3、6、12、24 h時按“2.3.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，白屈菜堿、鹽酸黃連堿、血根堿、小檗堿、白屈菜紅堿峰面積的RSD分別為1.04%、1.12%、0.94%、1.25%、0.83%（n=5），表明供試品溶液于室溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.9 重復(fù)性試驗(yàn) 取“2.2”項下白屈菜蜜炙品粉末（過三號篩），約1 g，精密稱定，共6份，按“2.3.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.3.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并按標(biāo)準(zhǔn)曲線法計算樣品中5種待測成分的含量。結(jié)果，白屈菜堿、鹽酸黃連堿、血根堿、小檗堿、白屈菜紅堿含量的RSD分別為1.42%、1.57%、1.32%、1.64%、1.76%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

2.3.10 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取已知含量的“2.2”項下白屈菜蜜炙品粉末（過三號篩），約0.5 g，精密稱定，共6份，分別按各成分的已知量精密加入相同質(zhì)量的“2.3.2”項下混合對照品溶液，按“2.3.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.3.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計算加樣回收率，結(jié)果見表2。

2.3.11 樣品含量測定 取白屈菜蜜炙品粉末（過三號篩）適量，按“2.3.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.3.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并按標(biāo)準(zhǔn)曲線法計算樣品中5種待測成分的含量。

2.4 單因素實(shí)驗(yàn)

在參考文獻(xiàn)[17-18，24]的基礎(chǔ)上，選擇悶潤時間、水與煉蜜質(zhì)量比、蜜水與白屈菜質(zhì)量比、炒制溫度、炒制時間進(jìn)行單因素考察。

2.4.1 悶潤時間 取白屈菜飲片，每份約50.0 g，共6份，按“2.2”項下方法炮制，在水與煉蜜質(zhì)量比1 ∶ 1.5（g/g）、蜜水與白屈菜質(zhì)量比20 ∶ 100（g/g）、炒制溫度110 ℃、炒制11 min的條件下，考察不同悶潤時間（10、20、30、40、50、60 min）對白屈菜蜜炙品中白屈菜堿等5種成分總含量的影響，結(jié)果見圖2A。由圖2A可知，當(dāng)悶潤時間為20 min時，5種成分總含量最高且保持穩(wěn)定;且當(dāng)悶潤時間>20 min時，5種成分總含量趨于穩(wěn)定，故選擇悶潤時間為20 min。

2.4.2 水與煉蜜質(zhì)量比 取白屈菜飲片，每份約50.0 g，共6份，按“2.2”項下方法炮制，在悶潤時間20 min、蜜水與白屈菜質(zhì)量比20 ∶ 100（g/g）、炒制溫度110 ℃、炒制11 min的條件下，考察不同水與煉蜜質(zhì)量比（1 ∶ 0.5、1 ∶ 1、1 ∶ 1.5、1 ∶ 2、1 ∶ 2.5、1 ∶ 3，g/g）對白屈菜蜜炙品中白屈菜堿等5種成分總含量的影響，結(jié)果見圖2B。由圖2B可知，隨著水與煉蜜質(zhì)量比增加，5種成分的總含量呈先升高后降低的趨勢;當(dāng)水與煉蜜質(zhì)量比為1 ∶ 2（g/g）時，5種成分的總含量最高，故選擇水與煉蜜質(zhì)量比為1 ∶ 1.5～1 ∶ 2.5（g/g）。

2.4.3 蜜水與白屈菜質(zhì)量比 取白屈菜飲片，每份約50.0 g，共6份，按“2.2”項下方法炮制，在悶潤時間20 min、水與煉蜜質(zhì)量比1 ∶ 2（g/g）、炒制溫度110 ℃、炒制11 min的條件下，考察不同蜜水與白屈菜質(zhì)量比（10 ∶ 100、15 ∶ 100、20 ∶ 100、25 ∶ 100、30 ∶ 100、35 ∶ 100，g/g）對白屈菜蜜炙品中白屈菜堿等5種成分總含量的影響，結(jié)果見圖2C。由圖2C可知，隨著蜜水與白屈菜質(zhì)量比增加，5種成分的總含量呈先升高后降低的趨勢;當(dāng)蜜水與白屈菜質(zhì)量比為20 ∶ 100（g/g）時，5種成分的總含量最高，故選擇蜜水與白屈菜質(zhì)量比為15 ∶ 100～25 ∶ 100（g/g）。

2.4.4 炒制溫度 取白屈菜飲片，每份約50.0 g，共7份，按“2.2”項下方法炮制，在悶潤時間20 min、水與煉蜜質(zhì)量比1 ∶ 2（g/g）、蜜水與白屈菜質(zhì)量比20 ∶ 100（g/g）、炒制11 min的條件下，考察不同炒制溫度（90、100、110、120、130、140、150 ℃）對白屈菜蜜炙品中白屈菜堿等5種成分總含量的影響，結(jié)果見圖2D。由圖2D可知，隨著炒制溫度升高，5種成分的總含量呈先升高后降低的趨勢;當(dāng)炒制溫度為120 ℃時，5種成分的總含量最高，故選擇炒制溫度為110～130 ℃。

2.4.5 炒制時間 取白屈菜飲片，每份約50.0 g，共7份，按“2.2”項下方法炮制，在悶潤時間20 min、水與煉蜜質(zhì)量比1 ∶ 2（g/g）、蜜水與白屈菜質(zhì)量比20 ∶ 100（g/g）、炒制溫度120 ℃的條件下，考察不同炒制時間（8、9、10、11、12、13、14 min）對白屈菜蜜炙品中白屈菜堿等5種成分總含量的影響，結(jié)果見圖2E。由圖2E可知，隨著炒制時間延長，5種成分的總含量呈先升高后降低的趨勢;當(dāng)炒制時間為11 min，5種成分的總含量最高，故選擇炒制時間為10～12 min。

2.5 Box-Behnken響應(yīng)面優(yōu)化白屈菜蜜炙工藝

2.5.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計與結(jié)果 在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，以水與煉蜜質(zhì)量比（A）、蜜水與白屈菜質(zhì)量比（B）、炒制溫度（C）、炒制時間（D）為考察因素，以白屈菜蜜炙品中5種成分總含量為響應(yīng)值，采用4因素3水平設(shè)計實(shí)驗(yàn)。白屈菜蜜炙工藝的實(shí)驗(yàn)因素與水平見表3，實(shí)驗(yàn)設(shè)計方案與結(jié)果見表4。

2.5.2 模型擬合與方差分析 采用Design-Expert 12軟件對表4的總含量數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合并建立二次多元回歸模型，得方程為Y=10.26-0.02A-0.38B-5.06×10-3C-0.08D-0.19AB+0.03AC-0.49AD-0.13BC-6.60×10-3BD-0.20CD-0.56A2-0.34B2-0.50C2-0.42D2。方差分析結(jié)果顯示，模型的P值小于0.000 1，表明二次方程擬合極顯著;擬合方程的相關(guān)系數(shù)（R 2）為0.980 5，表明響應(yīng)值的變化有98.05%來自于所選自變量，模型誤差較小，可用于預(yù)測5種成分總含量;失擬項P值為0.106 5>0.05，表明該模型擬合程度較好。4個因素對白屈菜蜜炙品中白屈菜堿等5種成分總含量影響的顯著性由高到低為B>D>A>C。其中，因素B、D的影響顯著（P<0.05），而因素A、C的影響不顯著（P>0.05）;其余各項因素AD、A2、B2、C2、D2、AB、BC、CD的影響亦顯著（P<0.05），而因素AC、BD影響不顯著（P>0.05），詳見表5。

2.5.3 響應(yīng)面分析 為進(jìn)一步評價各因素交互作用對白屈菜蜜炙品中白屈菜堿等5種成分總含量的影響，本研究采用Design-Expert 12軟件分別繪制響應(yīng)曲面和等高線圖，結(jié)果見圖3。由圖3可知，因素A與因素B、因素A與因素D、因素B與因素C、因素C與因素D交互作用較為明顯，而因素A與因素C、因素B與因素D交互作用不明顯。

2.5.4 最佳炮制工藝的確定及驗(yàn)證 基于Design-Expert 12軟件優(yōu)化得到最優(yōu)炮制工藝為水與煉蜜質(zhì)量比1 ∶ 1.89（g/g），蜜水與白屈菜質(zhì)量比20.62 ∶ 100（g/g），炒制溫度121.91 ℃，炒制時間10.37 min，白屈菜蜜炙品中5種成分總含量的預(yù)測值為10.39 mg/g。

結(jié)合生產(chǎn)實(shí)際，確定最優(yōu)炮制工藝為水與煉蜜質(zhì)量比1 ∶ 1.9（g/g），蜜水與白屈菜質(zhì)量比21 ∶ 100（g/g），炒制溫度122 ℃，炒制時間10.40 min。按此最優(yōu)炮制工藝進(jìn)行3次試驗(yàn)驗(yàn)證。結(jié)果，5種成分總含量分別為10.37、10.40、10.35 mg/g，平均值為10.37 mg/g，RSD為0.23%（n=3）;與預(yù)測值的相對誤差為0.19%，表明模型優(yōu)化所得蜜炙工藝穩(wěn)定、可行。

3 討論

本研究參考文獻(xiàn)[10-12]的方法，選擇乙腈和1%三乙胺溶液（用磷酸調(diào)節(jié)pH至3.0）作為流動相，在前期進(jìn)行的等度洗脫考察中發(fā)現(xiàn)，不同比例的流動相均無法使5個待測成分色譜峰的分離度與拖尾因子同時符合要求，因此選擇梯度洗脫進(jìn)行分離。結(jié)果顯示，采用“2.3.1”項下的洗脫條件時，5個待測成分色譜峰峰形良好，均可實(shí)現(xiàn)基線分離，且分離度均大于1.5。同時，課題組又對不同色譜柱（Waters T3-C18、Inertsil ODS-SP- C18、Diamonsil ODS-C18、Waters CSH-C18、Agilent SB-C18;規(guī)格均為250 mm×4.6 mm，5 μm）進(jìn)行了比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)色譜柱為Waters T3-C18時，5個待測成分色譜峰的分離度良好且峰形對稱，故選擇Waters T3-C18為色譜柱。

在單因素實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，白屈菜蜜炙品中5種成分總含量在炮制過程中主要受悶潤時間、水與煉蜜質(zhì)量比、蜜水與白屈菜質(zhì)量比、炒制溫度、炒制時間的影響;但當(dāng)悶潤時間達(dá)到20 min后，其對5種成分總含量的影響較小，故采用Box-Behnken響應(yīng)面法對其余4個因素進(jìn)行工藝優(yōu)化。傳統(tǒng)的蜜炙過程采用炒制法，炒制時火候難以掌握，太過易焦化，不及則不能達(dá)到炮制的要求，易造成炮制品質(zhì)量不穩(wěn)定，從而影響臨床應(yīng)用效果[26]。為此，本研究采用炒貨機(jī)進(jìn)行蜜炙，機(jī)器的溫度以數(shù)顯形式展示，可以精確控制炮制溫度，優(yōu)化所得工藝參數(shù)屬于小試范圍，可通過中試放大進(jìn)行參數(shù)修正以適應(yīng)工業(yè)大生產(chǎn)。

在炮制過程中，中藥化學(xué)成分會在輔料、溫度等多方面的作用下發(fā)生量變和質(zhì)變，使得其藥效及藥性發(fā)生改變[18]。本課題組后期將通過藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)比較白屈菜蜜炙前后止咳平喘作用的差異，通過毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)比較其蜜炙前后毒性的變化;同時，采用超高效液相色譜-飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)法對白屈菜蜜炙前后的化學(xué)成分進(jìn)行分析，以確定蜜炙增效減毒的物質(zhì)基礎(chǔ)。

本研究所得最優(yōu)蜜炙工藝為水與煉蜜質(zhì)量比1 ∶ 1.9（g/g），蜜水與白屈菜質(zhì)量比21 ∶ 100（g/g），炒制溫度122 ℃，炒制時間10.40 min。在此工藝條件下，5種成分的平均總含量為10.37 mg/g。優(yōu)化所得蜜炙工藝預(yù)測性良好且穩(wěn)定、可行，可為規(guī)范白屈菜飲片蜜炙工藝、成品質(zhì)量及其工業(yè)化生產(chǎn)加工提供參考。

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（收稿日期：2021-02-02 修回日期：2021-05-24）

（編輯：陳 宏）