賈好東 方昕 張中原 韋巍 趙娜 董江寧

結(jié)直腸癌在惡性腫瘤中的發(fā)病率居第三位［1］。建立適當(dāng)?shù)娜私Y(jié)直腸癌動(dòng)物模型對(duì)結(jié)直腸癌的發(fā)生機(jī)制研究及抗腫瘤研究起到至關(guān)重要的作用［2］。裸鼠因其缺乏T 淋巴細(xì)胞功能，且裸鼠皮下移植瘤模型易于建立和觀察，成瘤率高，是最為常用的腫瘤移植模型材料［3］。MRI 可動(dòng)態(tài)觀察和反映裸鼠的病理學(xué)變化，越來越多的應(yīng)用于動(dòng)物腫瘤模型的研究［4,5］。裸鼠體積小，采用臨床型磁共振所獲得的馳豫信號(hào)弱，圖像質(zhì)量常常不能滿足對(duì)裸鼠模型做深入研究的要求［6］。目前，4.0 T 以上等超高場(chǎng)小孔徑專用磁共振設(shè)備因其價(jià)格昂貴，很難在國(guó)內(nèi)多數(shù)科研機(jī)構(gòu)及醫(yī)院得到普及。研究表明，臨床上應(yīng)用的磁共振儀通過選擇合適的成像線圈、優(yōu)化磁共振掃描序列及掃描參數(shù)，可以提高裸鼠成像質(zhì)量［7］。本研究在前人臨床型磁共振掃描小鼠的基礎(chǔ)上進(jìn)行參數(shù)優(yōu)化，并采用體素內(nèi)不相干擴(kuò)散加權(quán)成像（intravoxel incoherent motion diffusion weighted imaging，IVIM-DWI）結(jié)合三維動(dòng)脈自旋標(biāo)記成像（three-dimensional arterial spin labeling，3D-ASL）評(píng)估裸鼠皮下瘤模型的微觀病理生理學(xué)變化，為實(shí)驗(yàn)性的腫瘤分子影像學(xué)研究提供可行的實(shí)驗(yàn)操作方法、技術(shù)和參數(shù)。

資料與方法

1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與細(xì)胞

本研究經(jīng)安徽省腫瘤醫(yī)院（中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)附屬第一醫(yī)院西區(qū)）醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（2020-YXK-03）。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：嚴(yán)格遵照《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見》妥善處理實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。Balb/c雄性裸鼠20 只（購(gòu)自合肥市廬陽區(qū)義東生物用品經(jīng)營(yíng)部），5 周齡，體重（21±3.0）g，由中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)附屬第一醫(yī)院動(dòng)物中心飼養(yǎng)。飼養(yǎng)條件：恒溫22 ℃，相對(duì)濕度50%，供應(yīng)無特定病原（specific pathogen free，SPF）級(jí)飼料、飲水。SW480 人結(jié)直腸癌細(xì)胞株（購(gòu)自ATCC）。細(xì)胞株采用含有10%胎牛血清和雙抗（100 U/ml 青霉素+SW480 人結(jié)直腸癌細(xì)胞株，100 ug/ml 鏈霉素）的DMEM 培養(yǎng)基，在恒溫37 ℃、飽和濕度、5%CO2的條件下培養(yǎng)，使細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)。采用胰酶消化法進(jìn)行傳代，每3～4 d 傳代一次。

2.人結(jié)腸癌裸鼠皮下移植瘤模型的建立

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期SW480 人結(jié)直腸癌細(xì)胞，用0.25%胰酶制成單細(xì)胞懸液。飼養(yǎng)裸鼠約7 d，待其適應(yīng)飼養(yǎng)環(huán)境后接種細(xì)胞，按2～4×106/只接種于裸鼠右肩胛骨區(qū)皮下。每天由飼養(yǎng)員觀察裸鼠皮下瘤生長(zhǎng)情況，6 周左右，皮下瘤長(zhǎng)徑生長(zhǎng)至1～1.5 cm 時(shí)行MRI 掃描。

3.兩組3.0 T MRI 的掃描序列與參數(shù)

所有裸鼠掃描前均進(jìn)行精確稱重，腹腔注射戊巴比妥鈉（3%，40 mg/kg），待裸鼠被深度麻醉后將裸鼠俯臥位固定于自制固定物上。將固定好的裸鼠頭先進(jìn)俯臥位放入4 通道相控陣MRI 老鼠實(shí)驗(yàn)線圈（上海辰光醫(yī)療科技有限公司，CGMUC22-H300-AG）。在裸鼠表面蓋上棉絮以保暖。定位成功后進(jìn)床至GE Signa HDxt 3.0 T 磁共振儀的掃描位開始掃描。前后兩批裸鼠隨機(jī)分組，分為A、B 兩組，常規(guī)序列參數(shù)見表1。A、B 組的IVIMDWI 掃描序列參數(shù)相同，具體參數(shù)如下：TR 4000 ms，TE 102 ms，視野8 cm×8 cm，層厚2.5 mm，層間距0.5 mm，體素1.5 mm×1.5 mm×2.0 mm。采用9 個(gè)b值，分別為0、20、50、100、150、200、300、500、1000和2000 s/mm2。A、B 組的3D-ASL 掃描序列參數(shù)相同，具體參數(shù)如下：TR 4771.0 ms，TE 14.2 ms，層厚4.0 mm，重復(fù)次數(shù)（NEX）3.0；層數(shù)11，層間距0.5 mm，視野8.0 cm×8.0 cm，矩陣256×224。經(jīng)尾靜脈注射釓噴酸葡胺（Gd-DTPA，北陸藥業(yè)），注射量為0.1 ml/只，之后行增強(qiáng)掃描，掃描參數(shù)同橫斷位T1WI 序列。

表1 A、B 兩組裸鼠3.0 T MRI 常規(guī)掃描參數(shù)

4.圖像質(zhì)量主觀評(píng)價(jià)

由2 名具有實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)的主管技師和主治醫(yī)師各自獨(dú)立對(duì)裸鼠橫斷位T1WI、橫斷位T2WI、增強(qiáng)、IVIM-DWI 及3D-ASL 序列進(jìn)行圖像質(zhì)量評(píng)估，均在不知情前提下，主觀評(píng)估裸鼠圖像質(zhì)量。

5.圖像質(zhì)量客觀評(píng)價(jià)

由兩名經(jīng)驗(yàn)豐富的副主任醫(yī)師分別在裸鼠皮下瘤MRI 平掃與增強(qiáng)圖像上各自選取腫瘤、同層面肌肉組織及背景區(qū)取三個(gè)興趣區(qū)（region of interest，ROI）進(jìn)行信號(hào)測(cè)量，ROI 大小約6 mm2，計(jì)算信噪比（signial to noise ratio，SNR）及對(duì)比噪聲比（contrast-noise ratio，CNR），取平均值。通過計(jì)算組內(nèi)相關(guān)系數(shù)（intraclass correlation coefficient，ICC），評(píng)價(jià)兩位副主任醫(yī)師得到SNR 及CNR 數(shù)據(jù)時(shí)的一致性。公式如下：

注：S瘤為腫瘤組織信號(hào)強(qiáng)度，S背為背景區(qū)域信號(hào)強(qiáng)度，S肌為正常肌肉組織信號(hào)強(qiáng)度，Sd為背景噪聲的標(biāo)準(zhǔn)差。

6.IVIM-DWI 及3D-ASL 數(shù)據(jù)測(cè)量

由兩名副主任醫(yī)師各自在ADW 4.5 工作站上打開Functool 軟件，依次打開要處理的IVIM-DWI及3D-ASL序列，并得到ADC、D、D*、f 及BF（blood flow）值偽彩圖；分別在IVIM-DWI 及3DASL 圖上選取信號(hào)最高處為ROI，并對(duì)每例裸鼠的各偽彩圖測(cè)量三次并取平均值。通過計(jì)算ICC評(píng)價(jià)兩位副主任醫(yī)師在測(cè)量IVIM-DWI 及3DASL 參數(shù)的數(shù)據(jù)時(shí)的一致性。

7.腫瘤組織的病理學(xué)觀察

裸鼠磁共振掃描結(jié)束后，立即處死，剝離皮下瘤，稱取移植瘤重量。將腫瘤組織用4%多聚甲醛固定，制成石蠟切片，組織切片HE 染色觀察結(jié)直腸癌細(xì)胞密度，免疫組化Ki-67 染色觀察結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖情況，免疫組化血管染色觀察皮下瘤微血管生成情況。

8.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 16.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，2組間比較采用獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)。非正態(tài)分布的計(jì)量資料以中位數(shù)M（四分位間距P25，P75）表示，2組間比較采用Mann-Whitney U 檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.裸鼠移植瘤成功率

SW480 細(xì)胞接種后約10 d，裸鼠右肩胛骨區(qū)形成肉眼可見的小結(jié)節(jié)，觸之質(zhì)地較硬。6 周左右，皮下瘤長(zhǎng)徑生長(zhǎng)至1～1.5 cm。本組實(shí)驗(yàn)裸鼠皮下瘤裸鼠成瘤率100%。

2.圖像主觀評(píng)價(jià)

主觀評(píng)估裸鼠圖像質(zhì)量剔除研究標(biāo)準(zhǔn)為：（1）邊界不可辨別或大部分邊界不清；（2）有明顯偽影，圖像顯示信號(hào)不均勻，無法完成參數(shù)值測(cè)量；（3）解剖結(jié)構(gòu)顯示模糊，DWI 圖變形嚴(yán)重。B 組1 只裸鼠有嚴(yán)重運(yùn)動(dòng)偽影被剔除。

3.圖像客觀質(zhì)量

15 只（100%）裸鼠在MRI 上均顯示成瘤，腫瘤信號(hào)與鄰近組織相比，病灶T1WI 上呈均勻等或稍高信號(hào)；在T2WI 上呈較均勻稍高信號(hào)。2 只裸鼠腫瘤中央出現(xiàn)無強(qiáng)化低信號(hào)壞死區(qū)。所有圖像均測(cè)量了要求部位的信號(hào)強(qiáng)度及背景噪聲值。兩位副主任醫(yī)師單獨(dú)描繪的ROI 所得SNR 及CNR 數(shù)值的一致性均達(dá)到良好以上（ICC：0.835～0.945）。將第一位副主任醫(yī)師的數(shù)據(jù)用于隨后的分析，A、B 兩組裸鼠不同序列SNR 與CNR 見表2。A 組橫斷位T1WI 及增強(qiáng)序列SNR 均大于B組，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.836，P=0.014；t=4.339，P<0.01）。A 組增強(qiáng)序列CNR 大于B 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=6.913，P<0.01）。分析結(jié)果顯示A、B 組圖像均可滿足臨床與科研要求，A 組圖像質(zhì)量整體優(yōu)于B 組（圖1、2）。

圖1 A 組4 號(hào)裸鼠，雄性，11 周，體重21.3 g。a)T1WI 橫斷位俯臥位示皮下瘤位于右側(cè)肩胛骨區(qū)，邊界清楚，呈等信號(hào)，皮下瘤組織SNR=58.32，CNR=16.68；b)T2WI 橫斷位；c)T1WI 增強(qiáng)，皮下瘤呈明顯強(qiáng)化，皮下瘤組織SNR=104.83，CNR=58.33 圖2 B組5 號(hào)裸鼠，雄性，11 周，體重18.5 g。a)T1W 橫斷位俯臥位示皮下瘤位于右側(cè)肩胛骨區(qū)，邊界清楚，呈等信號(hào)，皮下瘤組織SNR 為35.29，CNR 為5.62；b)T2WI 橫斷位；c)T1WI 增強(qiáng)，皮下瘤呈輕中度強(qiáng)化，皮下瘤組織SNR 為68.92，CNR 為27.81

表2 A、B 兩組裸鼠不同序列SNR 與CNR

4.IVIM-DWI 及3D-ASL 相關(guān)參數(shù)結(jié)果（圖3、4）

圖3 A組4 號(hào)裸鼠，雄性，11 周，體重21.3 g。a)ADC 偽彩圖，腫瘤組織平均ADC 值0.531×10-3 mm2/s；b)慢速表觀擴(kuò)散系數(shù)D 值的偽彩圖，腫瘤組織平均D 值0.412×10-3 mm2/s；c)快速表觀擴(kuò)散系數(shù)D* 值的偽彩圖，腫瘤組織平均D* 值12.31×10-3 mm2/s；d)灌注分?jǐn)?shù)f 值的偽彩圖，腫瘤組織平均f 值0.15；e)3D-ASL 血流量BF 值的偽彩圖，腫瘤組織平均BF 值15.94 ml·min-1·100 g-1 圖4 B組5 號(hào)裸鼠，雄性，11 周，體重18.5 g。a)ADC 偽彩圖，腫瘤組織平均ADC 值0.482×10-3 mm2/s；b)慢速表觀擴(kuò)散系數(shù)D 值的偽彩圖，腫瘤組織平均D 值0.173×10-3 mm2/s；c)快速表觀擴(kuò)散系數(shù)D* 值的偽彩圖，腫瘤組織平均D* 值1.25×10-3 mm2/s；d)灌注分?jǐn)?shù)f 值的偽彩圖，腫瘤組織平均f值0.473；e)3D-ASL 血流量BF 值的偽彩圖，腫瘤組織平均BF 值16.93 ml·min-1·100 g-1 圖5 a)裸鼠皮下瘤病理學(xué)HE 染色圖（×200），腫瘤細(xì)胞密度高，多呈類圓形，胞漿淡染，細(xì)胞核大小、形態(tài)、染色不一，部分區(qū)域可見雙核；b)裸鼠皮下瘤病理免疫組化染色圖，Ki-67 增殖指數(shù)80%（×200）；c)裸鼠皮下瘤病理血管染色圖（×400），腫瘤內(nèi)部被染成棕黃色的為血管內(nèi)皮或內(nèi)皮細(xì)胞束（+++）

兩位副主任醫(yī)師單獨(dú)描繪的興趣區(qū)所測(cè)得的IVIM-DWI 及3D-ASL 參數(shù)值的一致性均達(dá)到良好以上（ICC：0.767～0.943）。將第一位副主任醫(yī)師的數(shù)據(jù)用于隨后的分析。腫瘤組織ADC、D 及D*值均小于同層面正常肌肉組織，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），腫瘤組織BF 值大于同層面正常肌肉組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），腫瘤組織f 值大于同層面正常肌肉組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（表3）。

表3 裸鼠皮下瘤與同層面肌肉的IVIM-DWI 及3D-ASL相關(guān)參數(shù)指標(biāo)比較

5.病理結(jié)果

皮下瘤病理均診斷結(jié)直腸腺癌；瘤體表面血供較豐富，包膜完整，與鄰近正常肌組織分界較清。鏡下觀察腫瘤細(xì)胞密度高（圖5a），Ki-67 增殖指數(shù)（proliferation index，PI）高（圖5b），免疫組化血管染色（+++）（圖5c）。

討 論

1.裸鼠皮下瘤模型在臨床型MRI 研究中的問題

MRI 具有較好的軟組織分辨率以及較高的時(shí)間、空間分辨力，因此在裸鼠實(shí)驗(yàn)研究中應(yīng)用越來越多。但由于裸鼠體積小、體重輕，與動(dòng)物線圈之間常存在較大縫隙，另外因?yàn)槁闶蟮暮粑筒蛔灾鬟\(yùn)動(dòng)等因素的負(fù)面影響，在臨床型3.0 T MRI 中所做的裸鼠研究圖像質(zhì)量往往不佳［6,7］。針對(duì)這一問題，本研究嘗試對(duì)臨床型3.0 T MRI 掃描進(jìn)行參數(shù)優(yōu)化，以獲得優(yōu)質(zhì)的裸鼠MRI 解剖圖像。目前，裸鼠皮下瘤實(shí)驗(yàn)主要通過病理學(xué)和免疫組織化學(xué)（immunohistochemical，IHC）來驗(yàn)證其內(nèi)部微觀結(jié)構(gòu)變化，但此方法不僅有創(chuàng)且花費(fèi)時(shí)間較長(zhǎng)［8］。因此本研究嘗試采用IVIM-DWI 及3D-ASL 技術(shù)來反映皮下瘤內(nèi)的微血管生成和細(xì)胞密集度的狀況。

2.裸鼠皮下瘤3.0 T MRI 參數(shù)優(yōu)化

要想用臨床型3.0 T MRI 評(píng)估裸鼠皮下瘤模型，不僅需要規(guī)范的檢查技術(shù)，還需通過參數(shù)的優(yōu)化得到高的SNR 及CNR。SNR 越高、正常組織信號(hào)成分占比越多、圖像越清晰。影響SNR 的因素中最常見的是成像參數(shù)的設(shè)置，但高SNR 圖像并不一定具有優(yōu)質(zhì)的圖像對(duì)比度，如果組織對(duì)比度不高，SNR 再高也無法滿足臨床科研要求［9］。本研究在參考孫佳等［10］掃描序列參數(shù)基礎(chǔ)上，根據(jù)小鼠掃描經(jīng)驗(yàn)對(duì)掃描參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，適當(dāng)延長(zhǎng)了T1WI 的TR 值，因?yàn)檫m當(dāng)提高TR 值可使質(zhì)子縱向磁化矢量相對(duì)恢復(fù)較充分從而提高組織的信號(hào)值，同時(shí)還間接提高組織間縱向弛豫的差值從而提高組織的對(duì)比度。本研究A 組裸鼠平掃橫斷位T1WI 序列的SNR 大于B 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。分析原因如下：本研究保持視野不變，A 組裸鼠T1WI 序列矩陣為256×224，小于B 組矩陣256×256，此時(shí)，掃描矩陣與SNR 的關(guān)系是SNR 與相位編碼平方根成反比［11］，所以A 組SNR 較高。雖然A 組矩陣小，空間分辨力略低，但這不僅沒有影響圖像質(zhì)量反而還縮短了掃描時(shí)間。本研究中A 組T1WI 增強(qiáng)序列的SNR 及CNR 均大于B 組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，主要因?yàn)槠綊邥r(shí)A 組的SNR 大于B 組，所以在相同的增強(qiáng)條件及病灶同等強(qiáng)化程度下A 組仍具有較高的SNR。A 組增強(qiáng)序列的CNR 高于B 組，可能由于A 組空間分辨率較小，相應(yīng)獲得噪聲信號(hào)也較少。此外MRI 平掃時(shí)A 組皮下種植瘤灶雖然較B 組具有高的SNR，但其與皮下肌肉均為低信號(hào)，固有差別較小，對(duì)比并不顯著。但增強(qiáng)后皮下瘤明顯強(qiáng)化，皮下肌肉不強(qiáng)化，這導(dǎo)致A 組原本高SNR 的皮下瘤與皮下肌肉固有差別明顯增大，使A 組增強(qiáng)后CNR 值增高。

3.功能成像對(duì)裸鼠皮下瘤評(píng)估的價(jià)值

與馮仕庭等［12］等研究相比，本研究在對(duì)裸鼠常規(guī)平掃和增強(qiáng)的基礎(chǔ)上，增加IVIM-DWI 及3D-ASL 掃描，對(duì)裸鼠皮下瘤模型的病理生理學(xué)變化評(píng)價(jià)更加全面?；陔p指數(shù)模型的IVIM-DWI序列利用多個(gè)b 值采集DWI 序列圖像，可有效分離水分子的擴(kuò)散信息和血流微循環(huán)灌注信息。且通過量化指標(biāo)，能更準(zhǔn)確地反映水分子擴(kuò)散程度［13,14］。單指數(shù)模型的DWI 技術(shù)所獲得的ADC 值并不是裸鼠皮下瘤組織水分子的真實(shí)擴(kuò)散情況，因其還受到微循環(huán)灌注的影響。而雙指數(shù)模型的IVIM-DWI 獲得的D 值代表真正的水分子表觀擴(kuò)散值，剔除了血流灌注的影響，直接反映皮下瘤癌細(xì)胞密集度，從而間接提示結(jié)直腸癌的分化程度［15,16］。本研究腫瘤組織的D 值及ADC 值均明顯低于同層面肌肉組織，筆者認(rèn)為這是因?yàn)楸狙芯科は铝鼋Y(jié)直腸癌細(xì)胞密度大、排列緊密、細(xì)胞間隙小，致使細(xì)胞外間隙內(nèi)水分子擴(kuò)散受到限制，導(dǎo)致ADC 值和D 值的降低。D* 值代表體素內(nèi)微循環(huán)灌注的擴(kuò)散效應(yīng)，反映了毛細(xì)血管的平均血流速度。本研究發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌皮下瘤D* 值小于同層面肌肉組織，可能因?yàn)榉N植瘤內(nèi)雖然出現(xiàn)大量新生毛細(xì)血管網(wǎng)，但是這些血管網(wǎng)生成方式紊亂，血管不成熟，血管內(nèi)易產(chǎn)生脈管癌栓，使瘤體內(nèi)毛細(xì)血管平均血流速度降低［17,18］。f 值代表體素內(nèi)毛細(xì)血管容積占整個(gè)組織容積的比值，反映的是新生的毛細(xì)血管總量。本研究瘤體組織的f 值明顯大于同層正常肌肉組織，表明瘤體組織新生血管較多，血供豐富，本研究皮下瘤細(xì)胞Ki-67 增殖指數(shù)高，表明細(xì)胞增殖能力強(qiáng)，血管染色結(jié)果表明微血管生成豐富，均支持上述結(jié)論。

3D-ASL 作為一種容積灌注成像技術(shù)，突破了信噪比等因素的制約，對(duì)發(fā)現(xiàn)組織血流灌注異常的敏感性更高［19］。本研究還對(duì)裸鼠結(jié)直腸癌皮下種植瘤進(jìn)行了3D-ASL 序列掃描，嘗試在不打?qū)Ρ葎顩r下觀察瘤內(nèi)血流量值的可行性。此次試驗(yàn)采用脈沖式動(dòng)脈自旋標(biāo)記技術(shù)，自心臟上緣向下采集，主要考慮裸鼠較小無需大范圍的掃描覆蓋并降低射頻能量，減少因長(zhǎng)時(shí)間掃描引起死亡的可能性，其次還可以減小磁化轉(zhuǎn)移效應(yīng)并相對(duì)提高SNR。本研究腫瘤組織的BF 值明顯大于同層面肌肉組織，說明皮下瘤組織有較高的血流灌注，反映出本研究裸鼠皮下瘤新生血管較多，腫瘤血供較為豐富，皮下瘤病理學(xué)免疫組化血管染色的結(jié)果也證實(shí)了這點(diǎn)。

研究的不足之處：（1）由于實(shí)驗(yàn)的動(dòng)物模型數(shù)量有限，測(cè)量的數(shù)據(jù)難免存在偏倚；（2）裸鼠結(jié)直腸癌皮下瘤試驗(yàn)后的病理切片與MRI 掃描層面的匹配存在一定誤差。