張秀霞　汪蕾　張澤龍　李軍濤　王冬梅　冼健安

摘要：為探討鎘（Cd）脅迫下凡納濱對(duì)蝦（Litopenaeus vannamei）血細(xì)胞的分子響應(yīng)，以不同濃度的Cd2+（0，0.5 mg/L和5 mg/L）進(jìn)行脅迫，于不同脅迫時(shí)間取血淋巴，測(cè)定血細(xì)胞中Trx 2、Grx 2、Grx 3和MGST 3的基因表達(dá)量變化。結(jié)果顯示，Trx 2、Grx 3和MGST 3表達(dá)量在脅迫的中后期顯著上調(diào)，Grx 2表達(dá)量在5 mg/L Cd2+脅迫6 h開始即有顯著的升高，并持續(xù)至48 h。結(jié)果表明在Cd脅迫作用下，對(duì)蝦血細(xì)胞中上調(diào)這四個(gè)氧化還原與抗氧化相關(guān)基因的表達(dá)水平，以進(jìn)行脅迫防御;Grx 2對(duì)Cd脅迫較為敏感，在整個(gè)脅迫過程發(fā)揮作用，Trx 2、Grx 3和MGST 3主要在脅迫的中后期發(fā)揮作用;基因的表達(dá)響應(yīng)具有一定濃度效應(yīng)。

關(guān)鍵詞：凡納濱對(duì)蝦（Litopenaeus vannamei）;鎘;血細(xì)胞;基因表達(dá)

中圖分類號(hào)：X503.225

重金屬是造成自然水體環(huán)境破壞的一類主要污染物。鎘（Cd）是其中主要的重金屬元素，對(duì)水生動(dòng)物的毒性極大，且能夠富集在水生動(dòng)物體內(nèi)，通過食物鏈而毒害人類自身[1]。近年的調(diào)查結(jié)果顯示，海南島近岸海域沉積物中Cd含量較高，存在較高的潛在生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)。海南島東部陸架表層沉積物中Cd在個(gè)別站位達(dá)到了中等潛在生態(tài)危害水平[2]?；▓?chǎng)灣表層沉積物中Cd含量范圍為0.12～0.76 mg/kg，在七種重金屬中潛在生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)最高[3]。清瀾港紅樹林濕地沉積物中，包括Cd在內(nèi)的四種重金屬的生物有效態(tài)含量較高，具有較高的釋放風(fēng)險(xiǎn)[4]。陵水新村港近海區(qū)域海水中Cd范圍分別為0～0.58 μg/L，表層沉積物Cd含量為0.175 mg/kg，潛在生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)屬于中等水平，危害大小僅次于Hg[5]。

凡納濱對(duì)蝦（Litopenaeus vannamei）是海南乃至全國主養(yǎng)的蝦類，水體環(huán)境中的Cd污染對(duì)蝦類養(yǎng)殖及人體健康存在較大的風(fēng)險(xiǎn)。前期的研究結(jié)果顯示Cd脅迫會(huì)造成蝦類血細(xì)胞產(chǎn)生氧化脅迫從而誘導(dǎo)血細(xì)胞凋亡[6]，本研究選取四種重要的氧化還原與抗氧化相關(guān)基因，分析這些基因在Cd脅迫過程中的分子響應(yīng)，初步探討這些基因在應(yīng)對(duì)Cd脅迫的防御機(jī)制中的作用，以期為蝦類的健康養(yǎng)殖提供一定的理論依據(jù)。

1材料和方法

1.1試驗(yàn)材料

試驗(yàn)用凡納濱對(duì)蝦體重7～10 g，在實(shí)驗(yàn)室環(huán)境條件下（鹽度20‰，pH值7.8～8.0，溫度22～24 ℃，一直保持曝氣并進(jìn)行循環(huán)過濾）進(jìn)行馴養(yǎng)，馴養(yǎng)一周后，選取無病患且處于蛻皮間期的對(duì)蝦進(jìn)行脅迫試驗(yàn)。

1.2鎘脅迫試驗(yàn)

以CdCl2·2.5H2O作為Cd2+來源，按照《中華人民共和國漁業(yè)水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)》中鎘標(biāo)準(zhǔn)濃度（Cd2+<0.005 mg/L），設(shè)置2個(gè)Cd2+脅迫濃度組（0.5 mg/L和5 mg/L），不添加Cd2+作為對(duì)照組。試驗(yàn)在塑料箱中進(jìn)行，每箱放水40 L，放養(yǎng)對(duì)蝦20尾，每組3個(gè)平行。試驗(yàn)期間不投喂，保持曝氣，水體鹽度20‰，pH值 7.8～8.0，水溫22～24 ℃。

1.3總RNA提取

于脅迫的0，6，12，24和48 h進(jìn)行取樣，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)每組取9尾。用2.5 mL一次性注射器吸取300 μL預(yù)冷的抗凝劑（葡萄糖20.5 g/L，檸檬酸鈉8 g/L，氯化鈉4.2 g/L，pH值7.5），從對(duì)蝦的腹血竇抽取血淋巴，在800×g、4 ℃條件下離心10 min，棄上清后沉淀即為血細(xì)胞，用于總RNA的提取。應(yīng)用Trizol 法提取血細(xì)胞總RNA，取2 μL利用NanoDrop 2000分光光度計(jì)（Thermo Scientific，USA）測(cè)定RNA濃度和純度，并以1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)完整性。

1.4cDNA合成

應(yīng)用PrimeScriptTM RT reagent Kit With gDNA Eraser試劑盒（TaKaRa）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，根據(jù)RNA濃度用DEPC水進(jìn)行稀釋，在10 μL的反轉(zhuǎn)錄體系中加入500 ng RNA作為反轉(zhuǎn)錄模板，按照說明書步驟進(jìn)行操作。cDNA樣本-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5表達(dá)定量分析

根據(jù)本研究組克隆的cDNA序列，分別設(shè)計(jì)熒光定量PCR引物（表1）。熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)使用SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒（TaKaRa），試驗(yàn)步驟按照說明書進(jìn)行，每個(gè)樣品做3個(gè)重復(fù)。以β-actin作為內(nèi)參，根據(jù)目的基因和β-actin的Ct值用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.6統(tǒng)計(jì)分析

結(jié)果顯示為平均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)差（Mean ± SD），試驗(yàn)數(shù)據(jù)利用SPSS 19.0進(jìn)行單因素方差分析（One-Way ANVOA），P<0.05表示差異顯著。

2結(jié)果

2.1Cd脅迫對(duì)Trx 2基因表達(dá)量的影響

Cd脅迫下對(duì)蝦血細(xì)胞Trx 2表達(dá)量變化如圖1所示。當(dāng)Cd脅迫濃度為0.5 mg/L時(shí)，Trx 2表達(dá)量在脅迫的24 h和48 h顯著上調(diào)（P<0.05）;在24 h時(shí)達(dá)到峰值，約為對(duì)照組6.0倍。當(dāng)Cd脅迫濃度為5 mg/L時(shí)，Trx 2表達(dá)量在脅迫的6 h開始顯著提高（P<0.05）;在24 h時(shí)達(dá)到峰值，約為對(duì)照組9.4倍，顯著高于對(duì)照組和0.5 mg/L脅迫組（P<0.05）;在48 h時(shí)下降，但仍顯著高于對(duì)照組和0.5 mg/L脅迫組（P<0.05）。

2.2Cd脅迫對(duì)Grx 2基因表達(dá)量的影響

Cd脅迫下對(duì)蝦血細(xì)胞Grx 2表達(dá)量變化如圖2所示。當(dāng)Cd脅迫濃度為0.5 mg/L時(shí)，Grx 2表達(dá)量在脅迫的12 h開始顯著上調(diào)（P<0.05）;在24 h時(shí)達(dá)到峰值，約為對(duì)照組3.1倍。當(dāng)Cd脅迫濃度為5 mg/L時(shí)，Grx 2表達(dá)量在脅迫的6 h開始顯著提高（P<0.05）;在12 h時(shí)達(dá)到峰值，約為對(duì)照組4.9倍，顯著高于對(duì)照組和0.5 mg/L脅迫組（P<0.05）;在24 h和48 h時(shí)，0.5 mg/L脅迫組和5 mg/L脅迫組之間沒有顯著差異（P>0.05）。

2.3Cd脅迫對(duì)Grx 3基因表達(dá)量的影響

Cd脅迫下對(duì)蝦血細(xì)胞Grx 3表達(dá)量變化如圖3所示。當(dāng)Cd脅迫濃度為0.5 mg/L時(shí)，Grx 3表達(dá)量在脅迫的48 h顯著上調(diào)（P<0.05），約為對(duì)照組的2.5倍。當(dāng)Cd脅迫濃度為5 mg/L時(shí)，Grx 3表達(dá)量在脅迫的24 h和48 h有顯著提高（P<0.05），在48 h時(shí)達(dá)到峰值，約為對(duì)照組2.4倍，與0.5 mg/L脅迫組沒有顯著差異（P>0.05）。

2.4Cd脅迫對(duì)MGST 3基因表達(dá)量的影響

Cd脅迫下對(duì)蝦血細(xì)胞MGST 3表達(dá)量變化如圖4所示。當(dāng)Cd脅迫濃度為0.5 mg/L時(shí)，MGST 3表達(dá)量在脅迫的12 h顯著上調(diào)（P<0.05），在24 h有所下降（P>0.05），在48 h再次上升（P<0.05）。當(dāng)Cd脅迫濃度為5 mg/L時(shí)，MGST 3表達(dá)量在脅迫的12 h開始有顯著上調(diào)（P<0.05），在24 h時(shí)達(dá)到峰值，約為對(duì)照組4.4倍，并且顯著高于0.5 mg/L脅迫組（P<0.05）。

3討論

以往的研究顯示Cd脅迫對(duì)蝦類血細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞毒性影響，當(dāng)Cd達(dá)到一定濃度時(shí)，可誘導(dǎo)蝦類血細(xì)胞ROS的大量產(chǎn)生，造成血細(xì)胞的氧化損傷，從而誘導(dǎo)血細(xì)胞的凋亡和數(shù)量下降[6-8]。在甲殼動(dòng)物的鰓、肝胰腺等其它組織中，Cd脅迫也有產(chǎn)生氧化脅迫繼而造成損傷和凋亡的毒性機(jī)制。Cd脅迫作用會(huì)造成凡納濱對(duì)蝦肝胰腺的DNA損傷[7]。河南華溪蟹（Sinopotamon henanense）在Cd脅迫作用下，鰓組織產(chǎn)生大量H2O2，繼而激發(fā)了鰓組織的凋亡過程[9]。在生理生化水平發(fā)現(xiàn)，在Cd脅迫作用下，一些抗氧化酶的活力產(chǎn)生了顯著的響應(yīng)。Cd脅迫對(duì)河南華溪蟹鰓和肝胰腺的超氧化物歧化酶（SOD）同工酶活力具有激活作用，但對(duì)過氧化物酶（POD）具有抑制作用[10]。長江華溪蟹（Sinopotamon yangtsekiense）在Cd脅迫下，肝胰腺的SOD、過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（GPx）均呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì)[11]。Cd（10 mg/L）脅迫狀態(tài)下克氏原螯蝦（Procambarus clarkii）肝胰腺和觸角腺中的SOD和CAT活力先被激活后被抑制[12]。這些研究結(jié)果表明在Cd脅迫作用下甲殼動(dòng)物機(jī)體通過調(diào)節(jié)抗氧化系統(tǒng)進(jìn)行抗氧化防御。

本研究針對(duì)四個(gè)氧化還原與抗氧化相關(guān)基因，研究它們?cè)贑d脅迫作用下的分子響應(yīng)。Trx和Grx是機(jī)體內(nèi)重要氧化還原系統(tǒng)（Trx系統(tǒng)和Grx系統(tǒng)）的核心組成部分，是蛋白質(zhì)的二硫鍵還原酶，在機(jī)體蛋白質(zhì)的氧化還原保護(hù)過程中起著重要作用[13]。結(jié)果顯示，Trx 2、Grx 2和Grx 3三個(gè)基因?qū)d脅迫呈現(xiàn)了不同的表達(dá)響應(yīng)模式。Trx 2的表達(dá)量隨著脅迫時(shí)間的延長，呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢(shì)，表明其主要在脅迫后期發(fā)揮作用;Grx 2的表達(dá)量在脅迫的6 h即有顯著上調(diào)，后期的表達(dá)量基本保持在這一水平，表明Grx 2對(duì)Cd脅迫較為敏感，并可能在整個(gè)Cd脅迫過程中均發(fā)揮重要保護(hù)作用;Grx 3的表達(dá)響應(yīng)較遲緩，在脅迫后期才有顯著上調(diào)，表明Grx 3可能在脅迫后期參與針對(duì)Cd脅迫保護(hù)作用。從相對(duì)表達(dá)量峰值來看，Trx 2的最高值可達(dá)到對(duì)照組的9.4倍，Grx 2和Grx 3分別為對(duì)照組的4.9倍和2.4倍，也表明了Trx 2和Grx 2在應(yīng)對(duì)Cd脅迫的防御中發(fā)揮更為重要的作用。Grx 2最為敏感，且響應(yīng)整個(gè)脅迫過程，Trx 2則在脅迫后期有較高的表達(dá)響應(yīng)，Trx 2和Grx 2在應(yīng)對(duì)Cd脅迫的防御中可能存在一定的協(xié)同作用。

谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶（GST）在細(xì)胞解毒、內(nèi)外源性脂類新陳代謝、抗氧化等過程中發(fā)揮著極其重要的生物學(xué)作用。根據(jù)分布位置不同，GST可分為三類，包括胞質(zhì)GST、線粒體GST和微粒體GST（Microsomal GST，MGST）[14]。本研究分析了MGST 3對(duì)Cd脅迫的分子響應(yīng)，結(jié)果顯示MGST 3的表達(dá)響應(yīng)模式與Trx 2相似，隨著脅迫時(shí)間的延長，呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢(shì)，表明MGST 3主要在Cd脅迫的后期發(fā)揮作用。此外，四個(gè)基因?qū)d脅迫的表達(dá)響應(yīng)也存在一定的濃度效應(yīng)，Cd濃度較高時(shí)，基因表達(dá)響應(yīng)更為敏感，且變化程度更為劇烈。

本研究結(jié)果顯示，在Cd脅迫作用下，四個(gè)氧化還原與抗氧化相關(guān)基因均呈現(xiàn)了不同程度的表達(dá)量上調(diào)，表明凡納濱對(duì)蝦血細(xì)胞通過上調(diào)這些功能基因的表達(dá)水平作出應(yīng)對(duì)Cd脅迫的防御響應(yīng)。四個(gè)基因?qū)d脅迫表現(xiàn)出不同的表達(dá)響應(yīng)模式，在應(yīng)對(duì)Cd脅迫的防御過程中可能存在一定的協(xié)同作用。

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Effects of cadmium stress on gene expression in hemocytes of the white shrimp Litopenaeus vannamei

ZHANG Xiuxia1，3，WANG Lei2，ZHANG Zelong1，3，

LI Juntao1，3，WANG Dongmei1，3，XIAN Jianan1，3

（1.Hainan Provincial Key Laboratory for Functional Components Research and Utilization of Marine Bio-resources，Institute of Tropical?Biosciences and Biotechnology，CATAS，Haikou 571101，China;2.Institute of Modern Aquaculture Science and Engineering（IMASE），Guangdong?Provincial Key Laboratory for Healthy and Safe Aquaculture，Guangzhou Key Laboratory of Subtropical Biodiversity and Biomonitoring，Key?Laboratory of Ecology and Environmental Science in Guangdong Higher Education，School of Life Sciences，South China Normal University，Guangzhou，510631，China;3.Hainan Institute of Tropical Agricultural Resources，CATAS，Haikou 571101，China）

Abstract：To investigate the molecular response of haemocytes of the shrimp Litopenaeus vannamei to Cd stress，gene expression levels of Trx 2，Grx 2，Grx 3 and MGST 3 were measured in haemocytes from shrimp exposed to Cd2+ （0，0.5 mg/L and 5 mg/L） for different times.Results showed that the expression levels of Trx 2，Grx 3 and MGST 3 were significantly up-regulated in the middle and late stages of the stress，and the expression level of Grx 2 was significantly increased after 6 h exposure to 5 mg/L Cd2+，and this level continued to 48 h.These results indicate that expression of these four redox and antioxidant related genes in haemocytes of L.vannamei are up-regulated to protect against Cd stress.Grx 2 is sensitive to Cd stress and plays a role in the whole stress process.Trx 2，Grx 3 and MGST 3 mainly play a role in the middle and late stages of the stress.The gene expression response has a certain concentration effect.

Key words：Litopenaeus vannamei; cadmium; hemocyte; antioxidant enzyme; gene expression

（收稿日期：2021-02-24）

基金項(xiàng)目：海南省自然科學(xué)基金（319QN306）;中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金（1630052019013）。

作者簡介：張秀霞（1982.7-），女，助理研究員，研究方向：水產(chǎn)動(dòng)物健康養(yǎng)殖。E-mail：zhangxiuxia@itbb.org.cn。

通信作者：冼健安（1983.2-），男，博士，副研究員，研究方向：水產(chǎn)養(yǎng)殖生態(tài)及毒理學(xué)、水產(chǎn)動(dòng)物營養(yǎng)與飼料學(xué)。E-mail： xian-ja@163.com。DOI：10.3969/j.issn.1004-6755.2021.03.001