閆宇涵，王占黎，胡海，劉秀芬

繼發(fā)性高血壓是病因明確的高血壓，腎性高血壓為繼發(fā)性高血壓的組成部分［1］。高血壓是許多疾病包括心血管疾病、糖尿病、腦卒中等的危險因素且影響著人類的身心健康［2］，國際上罹患腎性高血壓的人數(shù)占高血壓總?cè)藬?shù)的百分比呈逐年上升趨勢［3-4］。近年臨床上關(guān)于腎性高血壓的研究較多，兩腎一夾（2K1C）腎性高血壓大鼠模型作為最常使用的繼發(fā)性高血壓動物模型對于腎性高血壓的研究尤為重要［5］。近年糞便代謝組學的研究逐漸興起，糞便內(nèi)源性代謝物的變化與許多疾病的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)，代謝物被認為可直接反映個體生理和病理狀況，已有研究表明，糞便內(nèi)源性代謝物的改變與糖尿病、高脂血癥等存在緊密聯(lián)系［6-8］，此外其還可能與高血壓的發(fā)病有關(guān)［9-10］。但目前關(guān)于高血壓大鼠腸道糞便內(nèi)源性代謝物的研究，特別是腎性高血壓大鼠腸道糞便內(nèi)源性代謝物的研究鮮有報道。本研究構(gòu)建2K1C腎性高血壓大鼠模型并通過氣相色譜-飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用（gas chromatography-time-of-flight mass spectrometry，GC-TOFMS）技術(shù)檢測大鼠糞便代謝產(chǎn)物的變化，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 本實驗時間為2019-08-15至2019-09-30。選取4周齡SPF級SD雄性大鼠20只，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司〔許可證號：SCXK（京）2016-0006〕，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機分為假手術(shù)組（n=10）和模型組（n=10）。

1.2 實驗方法

1.2.1 主要儀器 BP-300A全自動大小鼠無創(chuàng)血壓測量系統(tǒng)購自成都泰盟軟件有限公司，7890氣相色譜-飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用儀購自Agilent，質(zhì)譜儀購自LECO，離心機購自Thermo Fisher Scientific，超低溫冰箱購自Thermo Fisher Scientific，分析天平購自Sartorius，研磨儀購自上海凈信科技有限公司，超聲儀購自深圳市方奧微電子有限公司，烘箱購自上海一恒科學儀器有限公司，真空干燥儀購自太倉市華美生化儀器廠。

1.2.2 模型制備方法 常規(guī)無菌操作，兩組大鼠均給予3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，打開腹腔。模型組大鼠構(gòu)建2K1C腎性高血壓大鼠模型［5］，具體如下：在大鼠左腎動脈中段夾閉一個內(nèi)徑為0.2 mm的銀夾，以造成腎臟缺血；假手術(shù)組大鼠打開腹腔后進行左腎動脈分離但不夾閉。密切關(guān)注大鼠生命體征36 h，術(shù)后72 h內(nèi)每只大鼠每天給予青霉素0.5萬U，共計3 d。造模成功標準：大鼠尾動脈收縮壓較造模前升高30 mm Hg（1 mm Hg=0.133 kPa）視為造模成功。術(shù)后4周處死大鼠，并在無菌條件下收集兩組大鼠糞便樣本及左、右腎，采用濾紙吸干左、右腎表面水分，采用直尺測量左、右腎寬，觀察腎臟體積。

1.2.3 血壓、體質(zhì)量測量方法 每周固定時間采用尾套法測量兩組大鼠尾動脈收縮壓并記錄，測量血壓時提前將大鼠放入固鼠器中固定完畢，并放于提前預熱的血壓測量系統(tǒng)中，待大鼠預熱完畢后，即大鼠血壓波形穩(wěn)定后測量尾動脈收縮壓3次并記錄，每次間隔1 min，隨后測定大鼠體質(zhì)量并記錄。血壓測量完畢待大鼠體溫恢復正常后，放回飼養(yǎng)間。記錄兩組大鼠術(shù)后即刻、術(shù)后4周尾動脈收縮壓、體質(zhì)量。

1.2.4 代謝組學檢測方法

1.2.4.1 代謝物提取 采用GC-TOFMS技術(shù)檢測大鼠糞便代謝物，具體如下：取樣本（50±1）mg放入EP管（2 ml）中，加入500 μl預冷提取液（甲醇與氯仿的體積比為3∶1），再加入核糖醇10 μl，渦旋30 s；加入鋼珠，將研磨儀調(diào)至45 Hz處理4 min，冰水浴超聲5 min；將樣本放入離心機中離心15 min；小心移取200 μl上清液于1.5 ml EP管中，從每個樣本中取60 μl混合制成QC樣本；于真空干燥儀中干燥處理提取物；然后加入40 μl甲氧胺鹽試劑（甲氧胺鹽酸鹽溶于吡啶20 mg/ml）并輕輕搖勻，并放入80 ℃烘箱中孵育30 min；向每個樣品中加入50 μl BSTFA〔含有1%三甲基氯硅烷（trimethylchlorosilane，TMCS），v/v〕，然后將得到的混合物于70 ℃孵育1.5 h后冷卻至室溫，再向混合的樣品中加入5 μl可溶于氯仿的脂肪酸甲酯（fatty acid methyl esters，F(xiàn)AMEs）；隨機順序上機檢測差異糞便代謝物。

1.2.4.2 上機檢測 氣相色譜-飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用儀具體上機檢測參數(shù)見表1。

表1 氣相色譜-飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用儀檢測參數(shù)Table 1 Test parameters for GC-TOFMS instrument

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 23.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)處理。本研究中計量資料均符合正態(tài)分布，以（±s）表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，組內(nèi)比較采用配對t檢驗；采用正交偏最小二乘法-判別分析（orthogonal partial least squares discrimination analysis，OPLS-DA）模型檢驗兩組樣本組間和組內(nèi)差異，采用置換檢驗分析OPLS-DA模型的可靠性及是否存在過擬合現(xiàn)象。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠腎臟體積、尾部動脈壓及體質(zhì)量 模型組大鼠均建模成功。術(shù)后4周，與假手術(shù)組大鼠相比，模型組大鼠左側(cè)腎臟體積明顯縮小、且形態(tài)萎縮。術(shù)后即刻兩組大鼠尾動脈收縮壓和體質(zhì)量比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；術(shù)后4周模型組大鼠尾動脈收縮壓高于假手術(shù)組，體質(zhì)量低于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。術(shù)后4周模型組大鼠尾動脈收縮壓高于術(shù)后即刻，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；術(shù)后4周假手術(shù)組和模型組大鼠體質(zhì)量分別高于本組術(shù)后即刻，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表2。

表2 兩組大鼠術(shù)后即刻和術(shù)后4周尾動脈收縮壓和體質(zhì)量比較（±s）Table 2 Comparison of systolic blood pressure of tail artery and body mass between the two groups immediately after operation and 4 weeks after operation

表2 兩組大鼠術(shù)后即刻和術(shù)后4周尾動脈收縮壓和體質(zhì)量比較（±s）Table 2 Comparison of systolic blood pressure of tail artery and body mass between the two groups immediately after operation and 4 weeks after operation

注：實驗過程中模型組1只大鼠死亡

組別 只數(shù) 尾動脈收縮壓（mm Hg） 體質(zhì)量（g）術(shù)后即刻 術(shù)后4周 t配對值 P值 術(shù)后即刻 術(shù)后4周 t配對值 P值假手術(shù)組 10 100±14 104±8 -1.460 0.178 213.8±12.6 284.9±26.9 -11.002 ＜0.001模型組 9 106±12 195±14 -13.629 ＜0.001 209.7±15.6 256.4±46.5 -5.146 ＜0.001 t值 1.276 -14.510 1.453 2.609 P值 0.178 ＜0.001 0.137 0.043

2.2 OPLS-DA結(jié)果 OPLS-DA結(jié)果顯示，兩組樣本區(qū)分非常明顯，均在95%CI內(nèi)，見圖1。置換檢驗結(jié)果顯示，構(gòu)建的OPLS-DA模型符合真實情況，無過擬合現(xiàn)象，見圖2。

圖1 兩組OPLS-DA模型得分散點圖Figure 1 Scatter plot of OPLS-DA model score of the two groups

圖2 構(gòu)建的OPLS-DA模型的置換檢驗結(jié)果Figure 2 Permutation test result of OPLS-DA model constructed

2.3 差異糞便代謝物 基于GC-TOFMS技術(shù)及多元變量統(tǒng)計分析方法［11］，共篩選出11種差異糞便代謝物：與假手術(shù)組相比，模型組葡萄糖酸、肌醇、壬酸、癸酸呈低表達，葡萄糖-1-磷酸、麥芽三糖醇、異麥芽酮糖、馬來酸、2-甲基戊二酸、2-單棕櫚酸甘油酯、L-犬尿氨酸呈高表達，見表3、圖3。

表3 兩組差異糞便代謝物篩選結(jié)果Table 3 Screening results of different fecal metabolites of the two groups

圖3 兩組差異糞便代謝物層次聚類分析熱力圖Figure 3 Heatmap of hierarchical clustering analysis of different fecal metabolites of the two groups

3 討論

腎性高血壓主要由腎動脈及腎實質(zhì)性病變引起，而腎動脈病變主要為腎動脈內(nèi)壁發(fā)生的一系列病變，如肌纖維增生、小動脈瘤形成，進而使腎動脈內(nèi)壁突出，造成腎動脈狹窄、缺血，最終導致腎性高血壓［12-13］。高血壓常與代謝異常并存，二者可能存在共同的潛在機制，包括腸道激素改變、腸鈉吸收和腸道菌群改變［14-15］。因此，改善胃腸系統(tǒng)可能是糾正代謝異常、降低血壓的選擇。

本研究基于GC-TOFMS技術(shù)及多元變量統(tǒng)計分析方法，共篩選出11種差異糞便代謝物：與假手術(shù)組相比，模型組葡萄糖酸、肌醇、壬酸、癸酸呈低表達，葡萄糖-1-磷酸、麥芽三糖醇、異麥芽酮糖、馬來酸、2-甲基戊二酸、2-單棕櫚酸甘油酯、L-犬尿氨酸呈高表達。

肌醇主要存在于肌肉、心臟和肝臟中，CHANG等［16］通過動物模型證實高血壓大鼠腎臟中肌醇含量下降。OMORI等［17］比較冠心病與正常受試者血清代謝組學，發(fā)現(xiàn)冠心病患者血清壬酸水平低于正常受試者。葡萄糖-1-磷酸是葡萄糖上1'-碳原子磷酸化作用的結(jié)果，在高血壓病理生理過程中常伴隨能量的消耗、體內(nèi)儲存糖原的分解，而葡萄糖-1-磷酸是糖原消耗反應(yīng)的產(chǎn)物［18-19］。麥芽三糖醇可被腎臟中的α-葡萄糖苷酶水解為葡萄糖［20］，而血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（angiotensin converting enzyme，ACE）可抑制腎臟中的α-葡萄糖苷酶水解成為葡萄糖［21-22］、促進血管緊張素Ⅰ（angiotensin I，AngⅠ）生成，而AngⅠ又是腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)（renin-angiotensinaldosteronesystem，RAAS）調(diào)節(jié)血壓的重要一環(huán)。異麥芽酮糖是由葡萄糖和果糖單體組成的二糖，其可為機體代謝提供能量。DE GROOT等［23］研究證實，異麥芽酮糖可以保留動脈內(nèi)皮功能的潛力，在心血管健康中發(fā)揮有利作用，而高血壓等心血管疾病的早期征兆與動脈內(nèi)皮功能受損有關(guān)。L-犬尿氨酸是色氨酸代謝產(chǎn)物的一種，也是有效的血管舒張劑，在高血壓發(fā)病機制中其可使血管舒張、血管通透性增加，促進血管因子釋放［24］。目前，葡萄糖酸、癸酸、馬來酸、2-甲基戊二酸、2-單棕櫚酸甘油酯與高血壓的關(guān)系尚不清楚，仍有待進一步研究。

綜上所述，腎性高血壓大鼠糞便代謝物與假手術(shù)組明顯不同，本研究初步證明了腎性高血壓對腸道內(nèi)源性代謝物的影響，提示腸道菌群或可以作為治療腎性高血壓的新選擇，同時對后續(xù)研究腸道菌群和內(nèi)源性代謝物的關(guān)系提供了有力依據(jù)。

作者貢獻：閆宇涵進行文章的構(gòu)思與設(shè)計，研究的實施與可行性分析，結(jié)果分析與解釋，撰寫論文；王占黎、胡海進行數(shù)據(jù)收集、整理、分析；劉秀芬進行論文的修訂，負責文章的質(zhì)量控制及審校，并對文章整體負責、監(jiān)督管理。

本文無利益沖突。