仝澤方，李利軍，盧美歡，馬英輝，吳文朋

(陜西省微生物研究所，西安 710043)

魔芋是天南星科魔芋屬多年生草本植物，魔芋葡甘聚糖是其主要活性成分[1]。魔芋葡甘聚糖為水溶性膳食纖維，有輔助醫(yī)療和保健作用，是一種優(yōu)良的食品添加劑[2]。然而，由于其分子量大，具有遇水后高膨脹、高黏度的特性，過(guò)量攝入將引起抗?fàn)I養(yǎng)作用，從而使其應(yīng)用受到限制[3]。葡甘聚糖酶可以將魔芋精粉中的葡甘露聚糖分解為2～10個(gè)單糖單位，并以β-1,4或β-1,3糖苷鍵連接，生成具有直鏈或支鏈的魔芋葡甘露低聚糖[4-5]。有研究表明，魔芋葡甘露低聚糖除了具有低熱量、穩(wěn)定和安全無(wú)毒等良好的理化性質(zhì)外[6]，對(duì)以雙歧桿菌為代表的有益菌群也有明顯的促生長(zhǎng)作用，不但可以改善腸道內(nèi)菌群結(jié)構(gòu)，還能夠增強(qiáng)機(jī)體免疫力。有試驗(yàn)證明，魔芋葡甘露低聚糖還有明顯的降脂作用，可以作為高血脂糖尿病的輔助治療產(chǎn)品[7-8]。同時(shí)，葡甘露低聚糖還具有清除自由基，吸附病原菌和抑制腸內(nèi)氨的形成和吸收等良好的作用[9]。魔芋葡甘露低聚糖因其諸多優(yōu)良的理化性質(zhì)分別在食品工業(yè)領(lǐng)域、生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域、功能材料領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。

尤其是在食品工業(yè)中，魔芋葡甘露低聚糖不僅可以用于保健食品和食品添加劑，也可作為原材料制成食品保鮮膜[10-11]。文本主要利用酶法生產(chǎn)葡甘露低聚糖，研究了不同因素對(duì)其制備低聚糖工藝的影響，并對(duì)其工藝條件進(jìn)行了優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 材料

葡甘聚糖酶：自制；魔芋精粉：陜西錦泰魔芋產(chǎn)業(yè)發(fā)展有限公司；DNS試劑：配制。

1.2 儀器及設(shè)備

722型分光光度計(jì) 天津市普瑞斯儀器有限公司；PHS-3C精密酸度計(jì) 上海大普儀器有限公司；HH-S4電熱恒溫水浴鍋 北京科偉永興儀器有限公司；電子萬(wàn)用電爐 天津市泰斯特儀器有限公司；JM-B 10002電子天平 余姚市紀(jì)銘稱重校驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.3 葡甘聚糖酶的制備

黑曲霉3758由陜西省微生物研究所菌種資源中心選育和保藏，經(jīng)過(guò)篩選馴化選育出葡甘聚糖酶產(chǎn)量高的黑曲霉菌株。利用麩皮、豆粕、魔芋膠以及少量無(wú)機(jī)鹽組成的固體培養(yǎng)基，接種該黑曲霉菌株在30 ℃發(fā)酵72 h，然后經(jīng)浸泡提取獲得葡甘聚糖酶粗酶液，酶活力可達(dá)到6000 U/mL。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 酶活力測(cè)定

以5.0 g/L魔芋膠為底物溶液。加入適量葡甘聚糖酶，在pH 5.5、50 ℃恒溫水浴鍋中反應(yīng)15 min；采用DNS法測(cè)定酶解液中還原糖的量。在上述條件下，以每1 min酶解底物產(chǎn)生1 μmol還原糖(以甘露糖計(jì))的酶量定義為1個(gè)β-甘露聚糖酶活力單位(U)[12]。

1.4.2 葡甘露低聚糖的制備

配制一定量的pH為5.8的醋酸-醋酸鈉緩沖液，置于250 mL的錐形瓶中，加入一定量的魔芋粉溶液和葡甘聚糖酶，于恒溫?fù)u床中以200 r/min反應(yīng)一定時(shí)間后，測(cè)定酶解液中的甘露糖含量。

1.4.3 單因素試驗(yàn)

按照葡甘露低聚糖的制備方法，以還原糖得率為考察指標(biāo)，依次進(jìn)行12個(gè)魔芋粉濃度5，10，15，20，25，30，40，50，60，70，80，90 g/L；12個(gè)酶添加量36.14，50.04，61.16，75.06，86.18，100.08，113.98，125.1，136.22，150.12，161.24，175.14 U/g；9個(gè)pH值1，2，3，4，5，6，7，8，9；15個(gè)反應(yīng)溫度25，30，35，40，45，50，55，60，65，70，75，80，85，90，95 ℃；9個(gè)反應(yīng)時(shí)間1.00，2.00，3.00，4.00，5.00，6.00，8.00，10.00，24.00 h的單因素試驗(yàn)。每個(gè)水平重復(fù)3次，測(cè)定結(jié)果取平均值。

1.4.4 正交試驗(yàn)

依據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以還原糖得率為考察目標(biāo)，選擇魔芋粉濃度、酶添加量和反應(yīng)時(shí)間，設(shè)計(jì)三因素三水平正交試驗(yàn)L9(34)，并重復(fù)3次，結(jié)果取平均值，最后通過(guò)極差分析和單因素試驗(yàn)結(jié)果確定葡甘露低聚糖制備的最佳工藝。

2 結(jié)果與討論

2.1 魔芋膠酶解條件單因素試驗(yàn)

2.1.1 酶添加量的影響

在pH為5.8、溫度為40 ℃、反應(yīng)時(shí)間為2 h、魔芋膠濃度為10 g/L的條件下探究酶添加量對(duì)還原糖轉(zhuǎn)化率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 酶添加量對(duì)還原糖得率的影響Fig.1 Effect of enzyme additive amount on the yield of reducing sugar

由圖1可知，隨著酶添加量的逐漸增多，還原糖轉(zhuǎn)化率也在提升，但當(dāng)酶的添加量大于150 U/g之后，還原糖轉(zhuǎn)化率趨于平穩(wěn)，不再有明顯的提升。因此，在保證產(chǎn)物中葡甘露低聚糖含量的前提下，要盡量減少葡萄糖和甘露糖等單糖的量，就需控制魔芋膠的酶解程度。

2.1.2 底物魔芋粉濃度的影響

在pH為5.8、溫度為40 ℃、反應(yīng)時(shí)間為2 h、酶添加量為61.16 U/g的條件下探究底物濃度對(duì)還原糖轉(zhuǎn)化率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 底物濃度對(duì)還原糖得率的影響Fig.2 Effect of substrate concentration on the yield of reducing sugar

由圖2可知，隨著底物濃度的逐漸增加，還原糖轉(zhuǎn)化率逐漸升高，但變化趨勢(shì)并不顯著?？梢酝茰y(cè)隨著魔芋膠濃度的增加，底物粘度增大，可能會(huì)影響酶解反應(yīng)的繼續(xù)進(jìn)行。因此選擇底物濃度為10～30 g/L。

2.1.3 酶解pH的影響

在溫度為40 ℃、反應(yīng)時(shí)間為2 h、酶添加量為61.16 U/g、底物濃度為10 g/L的條件下探究酶解pH對(duì)還原糖轉(zhuǎn)化率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 pH對(duì)還原糖得率的影響Fig.3 Effect of pH value on the yield of reducing sugar

由圖3可知，當(dāng)pH值小于4時(shí)，隨著pH值的增大，還原糖轉(zhuǎn)化率逐步提升，在pH為4時(shí)最大。但是當(dāng)pH在4～9區(qū)間時(shí)，還原糖轉(zhuǎn)化率一直是下降的趨勢(shì)。這是由于葡甘聚糖酶的最適pH可能為4左右，pH大于4時(shí)減弱了葡甘聚糖酶的活性，導(dǎo)致酶解反應(yīng)速度減慢，還原糖轉(zhuǎn)化率的降低。

2.1.4 酶解溫度的影響

在pH為5.8、反應(yīng)時(shí)間為2 h、底物濃度為10 g/L，酶添加量為61.16 U/g的條件下探究酶解溫度對(duì)還原糖轉(zhuǎn)化率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 溫度對(duì)還原糖得率的影響Fig.4 Effect of temperature on the yield of reducing sugar

由圖4可知，在25～75 ℃之間，隨著溫度的升高，還原糖轉(zhuǎn)化率整體呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，并在75 ℃時(shí)達(dá)到最高。而當(dāng)溫度一旦高于75 ℃時(shí)，還原糖轉(zhuǎn)化率呈下降趨勢(shì)。這可能是由于溫度過(guò)高破壞了酶的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致了部分變性，故而影響了酶與底物的反應(yīng)，導(dǎo)致還原糖轉(zhuǎn)化率降低。

2.1.5 酶解時(shí)間的影響

在pH為5.8、溫度為40 ℃、底物濃度為10 g/L、酶添加量為61.16 U/g的條件下探究酶解時(shí)間對(duì)還原糖轉(zhuǎn)化率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖5。

由圖5可知，在1～4 h內(nèi)，還原糖轉(zhuǎn)化率隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增加；在4～10 h內(nèi)，還原糖轉(zhuǎn)化率的變化并不明顯，趨于平穩(wěn)；在10 h之后，還原糖轉(zhuǎn)化率又呈下降趨勢(shì)。因此，對(duì)于酶解反應(yīng)存在著最佳反應(yīng)時(shí)間，反應(yīng)時(shí)間一旦過(guò)長(zhǎng)，有可能造成低聚糖進(jìn)一步水解為單糖，導(dǎo)致還原糖轉(zhuǎn)化率降低。

圖5 時(shí)間對(duì)還原糖得率的影響Fig.5 Effect of time on the yield of reducing sugar

2.2 魔芋膠酶解條件正交試驗(yàn)

選擇酶添加量、魔芋膠濃度、酶解時(shí)間3個(gè)因素，利用正交試驗(yàn)表L9(34)進(jìn)行三因素三水平正交試驗(yàn)，見(jiàn)表1。

表1 正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 1 Orthogonal experiment results and analysis

由表1可知,極差RA>RB>RC，因此影響因素底物濃度>酶添加量>酶解時(shí)間。最佳條件為A1B3C2，即酶解最佳條件為：酶添加量80 U/g，底物濃度10 g/L，酶解時(shí)間4 h。而之后所做的酶解最佳條件的驗(yàn)證試驗(yàn)也證明了這一點(diǎn)，在上述條件下，還原糖轉(zhuǎn)化率為93.21%。

2.3 討論

通過(guò)單因素試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)酶添加量、底物濃度、pH值、反應(yīng)時(shí)間和溫度對(duì)還原糖轉(zhuǎn)化率的影響并不只是線性關(guān)系。在此基礎(chǔ)上進(jìn)行的正交試驗(yàn)表明其中影響程度最大的是底物濃度，影響最小的是反應(yīng)時(shí)間，并且進(jìn)一步篩選出酶解最佳條件：pH 5.8，反應(yīng)溫度75 ℃，底物濃度10 g/L，酶添加量80 U/g，反應(yīng)時(shí)間4 h。經(jīng)過(guò)酶解最佳條件的驗(yàn)證試驗(yàn)，還原糖轉(zhuǎn)化率可達(dá)93.21%。

有文獻(xiàn)表明，酸解法和超聲波法分解魔芋葡甘聚糖時(shí)所用物質(zhì)酸度過(guò)高，造成的環(huán)境污染嚴(yán)重，且產(chǎn)物分子量不易控制，相較于酶解法效果不佳[13]。按照上述酶解法來(lái)分解魔芋葡甘聚糖是目前實(shí)驗(yàn)室獲取魔芋葡甘低聚糖的主要方法，李劍芳等利用黑曲霉菌株LW-1所產(chǎn)酸性β-甘露聚糖酶制備魔芋葡甘露低聚糖，該酶制備葡甘露低聚糖的工藝條件為：魔芋膠濃度150 g/L，加酶量50 U/g，50 ℃水解6 h，在上述條件下，酶解產(chǎn)物主要是2～10個(gè)單糖單位的葡甘露低聚糖。許牡丹等利用黑曲霉β-甘露聚糖酶探究了制備葡甘露低聚糖的最佳工藝條件，魔芋粉濃度2.0%，加酶量108 U/g，反應(yīng)溫度65 ℃，pH 4.2，反應(yīng)時(shí)間4.0 h，葡甘露低聚糖產(chǎn)率可達(dá)32.3%，并且本試驗(yàn)方法中還原糖得率也能達(dá)到93.21%，相對(duì)于其他工藝有明顯優(yōu)勢(shì)。但對(duì)于工業(yè)生產(chǎn)來(lái)說(shuō)，固定化酶能顯著縮短水解時(shí)間，降低生產(chǎn)成本，并能實(shí)現(xiàn)連續(xù)化生產(chǎn)[14]，所以固定化酶解工藝還需進(jìn)一步研究。

近年來(lái)，針對(duì)魔芋葡甘露低聚糖的研究已逐漸增多，并且其理化特性也在諸多領(lǐng)域應(yīng)用廣泛，尤其是在食品工業(yè)方面。魔芋葡甘露低聚糖的增稠性能使其常用于肉制品和淀粉制品中提升產(chǎn)品的感官和質(zhì)地，而合理利用魔芋葡甘露低聚糖的流變性能可以提升產(chǎn)品的質(zhì)地和口感，并且其良好的成膜性可用于果蔬涂膜保鮮方面和生物醫(yī)藥領(lǐng)域。但魔芋葡甘露低聚糖在食品、飲料、營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑，生物醫(yī)學(xué)和功能材料方面還需要進(jìn)一步的深入研究，并且也具有廣闊的應(yīng)用前景。