宋澤武，王希，趙浥，石晶，李立新

腦損傷后功能性神經(jīng)元的再生仍然是腦修復(fù)的主要挑戰(zhàn)。目前的研究主要集中在使用源自胚胎干細(xì)胞或誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的外源細(xì)胞來(lái)產(chǎn)生神經(jīng)細(xì)胞替代療法[1]。盡管潛力巨大，但這種細(xì)胞移植方法面臨著重大障礙，例如免疫排斥、腫瘤發(fā)生和分化的不確定性[2]。最近的研究已經(jīng)證明星形膠質(zhì)細(xì)胞可以在體外直接轉(zhuǎn)化為神經(jīng)細(xì)胞[3]。我們?cè)诎柎暮Ｄ⌒∈竽Ｐ椭羞M(jìn)一步證明，反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞可以直接重編程神經(jīng)細(xì)胞[3]。星形膠質(zhì)細(xì)胞也可以先轉(zhuǎn)化為神經(jīng)母細(xì)胞，然后再分化為神經(jīng)細(xì)胞[4]。然而，到目前為止，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞向神經(jīng)元的轉(zhuǎn)化主要是使用基于病毒的轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。相比之下，小分子已被用于促進(jìn)神經(jīng)分化，促進(jìn)細(xì)胞重編程[5]，甚至直接將成纖維細(xì)胞重編程為誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPSCs)、神經(jīng)祖細(xì)胞或神經(jīng)元[6]。與基于轉(zhuǎn)錄因子的重編程相比，小分子提供了易用性和更廣泛的下游應(yīng)用。

本研究進(jìn)行體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)小分子化合物Y-27632、VPA、SB431542、RepSox不僅可以將星形膠質(zhì)細(xì)胞直接重編程誘導(dǎo)為神經(jīng)細(xì)胞，細(xì)胞不會(huì)經(jīng)歷去分化步驟，避免了干細(xì)胞誘導(dǎo)的缺陷。并且與以往的研究相比，提高了轉(zhuǎn)化效率，精簡(jiǎn)了小分子數(shù)量，降低了操作難度，使得這一過(guò)程變的更加簡(jiǎn)便、安全；為中樞神經(jīng)損傷后修復(fù)探索新的治療方法。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及試劑 出生1～4 d的SD大鼠幼仔(南京醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)。胎牛血清(CellMax)；青/鏈霉素(Gibco)；多聚-D-賴氨酸(Sigma-Aldrich)；PBS(Hyclone)；2.5%胰酶消化液(含EDTA，Gibco)；堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(basic fibroblast growth factor，bFGF；Hyclone)；Neurobasal培養(yǎng)基(Gibco)；DMEM/HIGHGLUCOSE培養(yǎng)基(Hyclone)；表皮生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor，EGF；Hyclone)；B27(Peprotech)；anti-NeuN, anti-TUJ1,anti-MAP2，anti-GFAP, CY3-羊抗小鼠IgG及CY3-羊抗兔IgG(Abcom)；4%多聚甲醛(Biosharp)；免疫染色封閉液，Triton X-100，抗熒光淬DAPI，DMSO(碧云天)；Y-27632,VPA,SB431542,RepSox(MSE)。10 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿，T75培養(yǎng)瓶，24孔細(xì)胞培養(yǎng)板(Corning)；眼科剪、鑷、手術(shù)剪；體視顯微鏡(LEICA S4E)；倒置相差顯微鏡(Nikon ECLIPSETS100)；倒置熒光顯微鏡(LEICA DMI3000B)。

1.2 方法

1.2.1 星形膠質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)及鑒定 取出生1～4 d的SD大鼠幼仔，用體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇消毒頭頸部；用眼科剪剪開大鼠頭皮及顱骨后，用鑷子小心取出大腦組織，置于盛有6 mL DMEM的10 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中漂洗兩次，并置于冰上。在體視顯微鏡下精細(xì)除去嗅球和小腦，將海馬組織及丘腦等結(jié)構(gòu)剝離去除，并用眼科鑷仔細(xì)將腦膜從大腦皮層半球分離；避免提取的原代星形膠質(zhì)細(xì)胞被腦膜細(xì)胞和成纖維細(xì)胞污染。在無(wú)菌操作臺(tái)中用眼科剪將腦組織剪成直經(jīng)約2 mm大小的碎塊，加入22.5 mL的DMEM，再加入2.5 mL的2.5%胰酶消化液，放入4 ℃孵箱內(nèi)消化30 min，每隔10 min搖晃混勻1次。隨后用移液器將組織轉(zhuǎn)移到含10% FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基的15 mL無(wú)菌離心管內(nèi)，終止消化，以900 r/min離心5 min后棄上清液，加入15 mL含10% FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基重懸沉淀；用5 mL移液器反復(fù)吹打，將組織分離成單個(gè)細(xì)胞懸液(20～30次)。細(xì)胞計(jì)數(shù)后以約4×106/mL個(gè)細(xì)胞的密度接種于T75培養(yǎng)瓶中，并放入37 ℃、5% CO2孵箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)第7 d細(xì)胞密度大于70%，置于搖床分離小膠質(zhì)細(xì)胞(180轉(zhuǎn)，30 min)和少突膠質(zhì)細(xì)胞(240轉(zhuǎn)，6 h)，移除含有小膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞的上清液，并用PBS沖洗T75培養(yǎng)瓶三次；搖床分離結(jié)束后，消化重懸細(xì)胞，并接種在培養(yǎng)皿中進(jìn)行傳代提純，隨著逐次傳代，混雜細(xì)胞(如神經(jīng)元)相繼死亡，隨后細(xì)胞純度不斷提高，細(xì)胞形態(tài)高度統(tǒng)一。取第三代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，并行細(xì)胞免疫熒光染色鑒定。

1.2.2 小分子化合物誘導(dǎo) 分離大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞，并接種在培養(yǎng)皿上傳代提純，在24孔板中將第三代星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)在聚D-賴氨酸(Sigma)涂層的蓋玻片(12 mm)上，并分為誘導(dǎo)組(A組)，對(duì)照組(B組)。鋪板培養(yǎng)2 d后，在光學(xué)顯微鏡下觀察兩組細(xì)胞的生長(zhǎng)情況，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞緊密粘附爬片生長(zhǎng)，折光度好，細(xì)胞形態(tài)舒展，胞質(zhì)飽滿，已生長(zhǎng)至鋪滿孔底70%～80%，有旺盛的生長(zhǎng)活力。此時(shí)仔細(xì)將培養(yǎng)基吸出，用PBS輕柔地洗3次，吸干PBS，每孔加入1 mL含10% FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基。A組細(xì)胞：將Y-27632(0.5 μmol/L)、VPA(0.5 μmol/L)、SB431542(94 nmol/L)、RepSox(25 μmol/L)這4種小分子溶入DMSO中，在24孔板中加入Y-27632、VPA、SB431542、RepSox 4種小分子混合物，連續(xù)刺激星形膠質(zhì)細(xì)胞7 d，顯微鏡下觀察到細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，飽滿的胞質(zhì)變得逐漸細(xì)長(zhǎng)，隨后更換含有生長(zhǎng)因子BDNF、NT-3的神經(jīng)元培養(yǎng)基(B27N2-Neurobasal)。B組細(xì)胞：在24孔板中加入相同體積的DMSO，并于7 d后更換含有生長(zhǎng)因子BDNF、NT-3的神經(jīng)元培養(yǎng)基(B27N2-Neurobasal)。兩組細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)14 d后經(jīng)行免疫熒光染色。

1.2.3 神經(jīng)元軸突及核標(biāo)志物檢測(cè) 采用免疫熒光染色法。小心地將培養(yǎng)基吸出，用PBS洗滌細(xì)胞3次，動(dòng)作輕柔，防止細(xì)胞脫落。每孔加入1 mL 4%多聚甲醛室溫30 min固定細(xì)胞。PBS清洗2次，洗掉4%多聚甲醛，每孔加入500 μL 3‰ Triton X-100室溫孵育20 min，使得細(xì)胞膜形成孔道。PBS清洗2次，洗凈3‰ Triton X-100，每孔加入500 μL QUICKBLOCK免疫染色封閉液，室溫封閉1 h。勿用PBS清洗，用移液器直接吸出封閉液，根據(jù)一抗比例用QUICKBLOCK一抗稀釋液稀釋一抗，每孔加入200 μL一抗NeuN、TUJ1、MAP2、GFAP，置入4 ℃搖床過(guò)夜，或室溫2 h以上孵育一抗。用PBS置搖床上清洗3～5次，每次10 min；此后的步驟均需避光操作，根據(jù)二抗比例使用QUICKLOCK二抗稀釋液稀釋二抗，每孔加入200 μL對(duì)應(yīng)的二抗，CY3-羊抗小鼠IgG及CY3-羊抗兔IgG，室溫孵育2 h。用PBS置搖床上清洗3～5次，每次10 min，加入抗熒光淬滅劑DAPI，室溫孵育5 min，用PBS置搖床上清洗。熒光顯微鏡下觀察并拍照。

2 結(jié) 果

2.1 星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)及鑒定 原代大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞在接種2 h后，細(xì)胞貼壁，折光性好，聚集成團(tuán)。2 d后，細(xì)胞胞體逐漸張開，細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢且細(xì)胞種類較多。早期細(xì)胞胞體明顯、核較大，細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，呈梭形或不規(guī)則形，部分星形膠質(zhì)細(xì)胞長(zhǎng)出足突，小部分圓形、胞體較小、折光性強(qiáng)的細(xì)胞為小膠質(zhì)細(xì)胞或少突膠質(zhì)細(xì)胞。7 d后，置于搖床分離小膠質(zhì)細(xì)胞(180轉(zhuǎn)，30 min)和少突膠質(zhì)細(xì)胞(240轉(zhuǎn)，6 h)，搖床分離結(jié)束后，細(xì)胞鋪滿瓶底，星形膠質(zhì)細(xì)胞的比例明顯提高；光鏡下折光度高、細(xì)胞透明，細(xì)胞聚集生長(zhǎng)，如同神經(jīng)元呈巢狀生長(zhǎng)樣。用移液器加入0.25%的胰蛋白酶2 mL消化細(xì)胞5 min，細(xì)胞變圓，胞漿回縮，細(xì)胞變得透亮。消化重懸后細(xì)胞接種于10 cm培養(yǎng)皿中，顯微鏡下觀察到貼壁時(shí)間縮短，細(xì)胞透亮，未聚團(tuán)，且大小較均一。傳代培養(yǎng)4 d后，星形膠質(zhì)細(xì)胞胞體變大，透光度較低，細(xì)胞生長(zhǎng)迅速、純度增加，基本無(wú)小膠質(zhì)細(xì)胞或少突膠質(zhì)細(xì)胞(圖1)。在24孔板中將第三代星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)在聚D-賴氨酸(Sigma)涂層的蓋玻片(12 mm)上，用星形膠質(zhì)細(xì)胞特異性抗體GFAP染色，熒光顯微鏡下發(fā)綠色熒光(圖1)。

圖1 星形膠質(zhì)細(xì)胞鑒定(免疫熒光染色，×100)

2.2 小分子化合物誘導(dǎo)后星形膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)變化 在24孔板中將第三代星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)在聚D-賴氨酸(Sigma)涂層的蓋玻片(12 mm)上，將Y-27632(0.5 μmol/L)、VPA(0.5 μmol/L)、SB431542(94 nmol/L)、RepSox(25 μmol/L)這4種小分子溶入DMSO中；在24孔板中加入這4種小分子混合物，孵育星形膠質(zhì)細(xì)胞7 d，顯微鏡下觀察到細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，胞體由原來(lái)的飽滿寬大逐漸變得細(xì)長(zhǎng)，兩端伸出較長(zhǎng)的軸突，呈現(xiàn)兩極形態(tài)，相鄰細(xì)胞存在軸突-胞體、軸突-軸突等聯(lián)系。隨著小分子物質(zhì)的持續(xù)刺激，細(xì)胞形態(tài)進(jìn)一步向神經(jīng)元改變。光鏡下見細(xì)胞胞體明顯縮小、細(xì)長(zhǎng)，細(xì)胞發(fā)出兩個(gè)軸突，隨著時(shí)間推移軸突也逐漸變長(zhǎng)。隨后更換含有生長(zhǎng)因子BDNF、NT-3的神經(jīng)元培養(yǎng)基(B27N2-Neurobasal)；21 d后可見大量具有兩極且長(zhǎng)軸突的神經(jīng)元樣細(xì)胞(圖2)。

A：星形膠質(zhì)細(xì)胞；B；誘導(dǎo)7 d；C：誘導(dǎo)21 d

2.3 兩組細(xì)胞的神經(jīng)元軸突及核標(biāo)志物表達(dá) 免疫熒光染色顯示，誘導(dǎo)第7 d，誘導(dǎo)組細(xì)胞中出現(xiàn)早期神經(jīng)元軸突標(biāo)志物TUJ1表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞的比率為15.6%±0.7%，對(duì)照組細(xì)胞為3.2%±0.3%(n=5，陽(yáng)性率=TUJ1陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù))；誘導(dǎo)組細(xì)胞的TUJ1表達(dá)陽(yáng)性率明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。誘導(dǎo)第21 d，誘導(dǎo)組細(xì)胞成熟神經(jīng)元軸突標(biāo)志物MAP及核標(biāo)志物NeuN表達(dá)陽(yáng)性；對(duì)照組細(xì)胞基本無(wú)MAP2及NeuN表達(dá)。見圖3。

A：誘導(dǎo)第7 d，A1：誘導(dǎo)組；A2：對(duì)照組；B：誘導(dǎo)第21 d，B1:誘導(dǎo)組；B2：對(duì)照組

3 討 論

中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后，由于神經(jīng)元變性、壞死[7-8]，星形膠質(zhì)瘢痕的形成[9]及損傷部位的大量炎癥因子浸潤(rùn)[10-11]，造成機(jī)體在自我修復(fù)過(guò)程中，難以恢復(fù)神經(jīng)元的信號(hào)聯(lián)系；從而引起運(yùn)動(dòng)、感覺障礙及自主神經(jīng)功能紊亂，嚴(yán)重的可導(dǎo)致患者偏癱或截癱[12]。近半個(gè)多世紀(jì)以來(lái)，對(duì)于中樞神經(jīng)損傷的治療通常有手術(shù)治療、藥物治療、康復(fù)訓(xùn)練等，但這些方法對(duì)于患者的愈后改善作用有限，腦損傷和脊柱損傷的患者想要自己重新站起來(lái)幾乎難以實(shí)現(xiàn)；因此，探索新的治療方法迫在眉睫。近年來(lái)，隨著細(xì)胞工程技術(shù)的不斷進(jìn)步和發(fā)展，干細(xì)胞移植治療效果得到了較大的提升；在神經(jīng)系統(tǒng)疾病方面如腦癱、帕金森病、腦梗死后遺癥、腦外傷后遺癥都取得了重大進(jìn)步[13-14]。但是移植入損傷部位的細(xì)胞由于空間分布離散及微環(huán)境的抑制作用，導(dǎo)致植入細(xì)胞存活率、功能性遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果；并且內(nèi)源性干細(xì)胞量少、獲取困難，外源性干細(xì)胞存在免疫排斥、存活和倫理的問(wèn)題。既往的研究表明，反應(yīng)性神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞可以通過(guò)單個(gè)轉(zhuǎn)錄因子重編程為神經(jīng)細(xì)胞，但是要通過(guò)慢病毒作為載體才能實(shí)現(xiàn)[15-16]。而慢病毒本身及其轉(zhuǎn)染試劑對(duì)細(xì)胞有一定的毒性作用及腫瘤發(fā)生等問(wèn)題。小分子物質(zhì)將星形膠質(zhì)細(xì)胞直接重編程為神經(jīng)細(xì)胞，細(xì)胞不會(huì)經(jīng)歷去分化步驟，或者在轉(zhuǎn)化過(guò)程中經(jīng)歷的原始干性細(xì)胞階段的時(shí)間很短暫[17]，避免了干細(xì)胞移植存在的缺陷；極大地豐富了移植細(xì)胞的細(xì)胞庫(kù)，并且還具有取材方便、減少免疫排斥、原位移植等優(yōu)點(diǎn)。

Zhang等對(duì)20種小分子化合物進(jìn)行最終篩選，篩選出了多種對(duì)神經(jīng)發(fā)育至關(guān)重要的信號(hào)通路的小分子(總共9個(gè))[18]，包括LDN193189、SB431542、TTNPB、Thiazovivin、CHIR99021、DAPT、VPA、A83-01、RepSox。其調(diào)控星形膠質(zhì)細(xì)胞的關(guān)鍵發(fā)育途徑，成功將來(lái)自大腦皮層和中腦的星形膠質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為神經(jīng)細(xì)胞，并且在轉(zhuǎn)分化過(guò)程中，未檢測(cè)到細(xì)胞干性及細(xì)胞增殖相關(guān)指標(biāo)的表達(dá)，對(duì)比慢病毒介導(dǎo)的重編程模式存在的分化不確定、腫瘤發(fā)生等問(wèn)題，小分子物質(zhì)使得這一過(guò)程變的更加簡(jiǎn)便，安全。但使用9種小分子，涉及分子種類多，實(shí)施復(fù)雜，限制臨床應(yīng)用。本研究在此基礎(chǔ)上，簡(jiǎn)化了小分子的數(shù)量，確定了一組能夠?qū)⒋笫笮切文z質(zhì)細(xì)胞重編程為神經(jīng)細(xì)胞并且誘導(dǎo)效率較高的4種小分子組合(Y-27632，VPA，SB431542，RepSox)。在重編程過(guò)程中，小分子物質(zhì)首先阻斷促進(jìn)細(xì)胞向星形膠質(zhì)細(xì)胞分化的通路：TGFβ信號(hào)通路。RepSox和SB4311542，阻斷TGFβ激活素受體,該通路在細(xì)胞分化過(guò)程中抑制細(xì)胞向神經(jīng)元分化，并促進(jìn)星形膠質(zhì)的分化[19]。Y-27632是Rhor相關(guān)激酶的抑制劑，促進(jìn)細(xì)胞存活，提高重編程效率。VPA是星形膠質(zhì)細(xì)胞生成神經(jīng)母細(xì)胞所必須的，能顯著激活NeuroD1和Neurogenin2的表達(dá)。誘導(dǎo)效率的提高和小分子數(shù)量的精簡(jiǎn)，為此種技術(shù)應(yīng)用于臨床提供了可能。

使用這4種小分子混合物孵育星形膠質(zhì)細(xì)胞7 d，顯微鏡下觀察到細(xì)胞形態(tài)發(fā)生了改變，飽滿的胞質(zhì)變得逐漸細(xì)長(zhǎng)，隨后更換含有生長(zhǎng)因子BDNF、NT-3的神經(jīng)元培養(yǎng)基(B27N2-Neurobasal)。細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)一段時(shí)間后行免疫熒光染色。小分子連續(xù)誘導(dǎo)第7 d，免疫熒光檢測(cè)顯示，誘導(dǎo)組細(xì)胞出現(xiàn)早期神經(jīng)元軸突標(biāo)志物TUJ1表達(dá)，陽(yáng)性率為15.6%±0.7%，而對(duì)照組細(xì)胞僅為3.2%±0.3%；誘導(dǎo)組細(xì)胞的TUJ1表達(dá)陽(yáng)性率明顯高于對(duì)照組(P<0.05)。誘導(dǎo)第21 d，誘導(dǎo)組細(xì)胞可見神經(jīng)元軸突標(biāo)志物MAP2以及神經(jīng)元核標(biāo)志物NeuN表達(dá)[20]，對(duì)照組細(xì)胞基本無(wú)MAP2及NeuN表達(dá)。

本研究表明，Y-27632、VPA、SB431542、RepSox這4種小分子混合物可以在體外將大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞直接重編程誘導(dǎo)為神經(jīng)細(xì)胞。下一步的研究需要在體內(nèi)進(jìn)行驗(yàn)證，為中樞神經(jīng)損傷后修復(fù)提供新的方法。