劉 偉,劉佳佳*,周 楊,鄭利枝,高艷偉

(1內(nèi)蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院放射治療科,呼和浩特 010010;2內(nèi)蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院胃腸外科;*通訊作者,E-mail:samandhua398@126.com)

結(jié)直腸癌是消化系統(tǒng)中常見(jiàn)的惡性腫瘤,發(fā)病率和病死率均較高[1]。結(jié)直腸癌早期癥狀不明顯,發(fā)現(xiàn)時(shí)已處于中晚期,患者往往預(yù)后較差[2]。闡明結(jié)直腸癌發(fā)病的分子機(jī)制對(duì)于尋找新的靶向治療具有重要意義。微小RNA(miRNA)長(zhǎng)度通常為19-25個(gè)核苷酸,是一種非編碼小分子RNA[3]。miRNA主要通過(guò)特異性結(jié)合靶基因信使RNA(mRNA),切割mRNA或抑制其翻譯為蛋白,從而發(fā)揮調(diào)控基因表達(dá)的重要作用[4]。miRNA廣泛參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、侵襲、衰老等活動(dòng)[5]。有研究表明,miR-4496在前列腺癌和膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中可抑制腫瘤細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為[6,7]。miR-4496在結(jié)直腸癌中的作用并不清楚。本研究通過(guò)檢測(cè)結(jié)直腸癌細(xì)胞株中miR-4496的表達(dá)情況,觀察miR-4496對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖和侵襲的影響,探討miR-4496在結(jié)直腸癌細(xì)胞中的分子作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

正常的腸黏膜上皮細(xì)胞HIEC以及結(jié)直腸癌細(xì)胞株SW480、HT-29、LoVo、HCT116均購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所;SYBR Premix Ex Taq試劑盒購(gòu)于日本TaKaRa公司;DMEM/F12培養(yǎng)基和胎牛血清(FBS)購(gòu)自美國(guó)Gibco公司;mimic-NC、miR-4496 mimic、野生型和突變型的LAMP3熒光素酶質(zhì)粒購(gòu)自廣州市銳博生物科技有限公司;MTT試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;雙熒光素酶報(bào)告試劑盒購(gòu)自美國(guó)Promega公司;Trans-well小室購(gòu)自美國(guó)Corning公司;Matrigel膠、Lipofectamine 3000購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司;一抗β-Tubulin、LAMP3、CDK7、Cyclin H、Vimentin、ZEB-2購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司;辣根過(guò)氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)標(biāo)記的二抗羊抗兔購(gòu)自武漢博士德生物公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染

正常的腸黏膜上皮細(xì)胞和結(jié)直腸癌細(xì)胞株在含10% FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基中培養(yǎng),均在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染前24 h,將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HCT116細(xì)胞以5×105個(gè)/孔接種于6孔板,細(xì)胞融合度達(dá)40%時(shí),根據(jù)Lipofectamine 3000試劑盒說(shuō)明書(shū),分別轉(zhuǎn)染mimic-NC(對(duì)照組)和miR-4496 mimic(實(shí)驗(yàn)組)。

1.3 qRT-PCR檢測(cè)miR-4496和LAMP3 mRNA表達(dá)

采用Trizol試劑根據(jù)說(shuō)明書(shū)提取細(xì)胞總RNA,逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。采用SYBR Premix Ex Taq試劑盒定量檢測(cè)miR-4496和LAMP3 mRNA表達(dá),引物序列見(jiàn)表1。反應(yīng)條件:95 ℃ 6 min、95 ℃ 15 s、60 ℃ 32 s、72 ℃ 32 s,共40個(gè)循環(huán)。以U6為內(nèi)參計(jì)算miR-4496表達(dá),以GAPDH為內(nèi)參計(jì)算LAMP3 mRNA表達(dá),所有數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCt方法計(jì)算。

表1 qRT-PCR引物序列Table 1 The primer sequences for qRT-PCR

1.4 四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)法檢測(cè)HCT116細(xì)胞增殖能力

將兩組HCT116細(xì)胞按2 000個(gè)/孔接種至96孔板,每組4個(gè)復(fù)孔。分別在接種后第1,2,3,4,5 d向各孔加MTT試劑,培養(yǎng)4 h。吸去上清液,向各孔加120 μl二甲基亞砜,輕微振蕩20 min,直至晶體充分溶解。采用多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔在450 nm波長(zhǎng)處的吸光度(A)值。

1.5 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HCT116細(xì)胞侵襲能力

在Transwell小室上室加入Matrigel膠,在培養(yǎng)箱內(nèi)凝固后,采用無(wú)血清培養(yǎng)基重懸兩組HCT116細(xì)胞,迅速把200 μl細(xì)胞懸液加到上室,在Trans-well小室下室加入600 μl含10% FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基,在培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h。采用甲醇固定30 min,結(jié)晶紫染色30 min,棉簽輕輕擦去未穿過(guò)微孔膜的HCT116細(xì)胞。在光學(xué)顯微鏡(×100)下,對(duì)侵襲的細(xì)胞計(jì)數(shù),取平均值。

1.6 生物信息學(xué)技術(shù)和雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)預(yù)測(cè)并測(cè)定miR-4496與靶基因的靶向關(guān)系

采用miRecords在線網(wǎng)站預(yù)測(cè)miR-4496的靶基因。構(gòu)建LAMP3野生型和突變型的熒光素酶表達(dá)載體,分別與mimic-NC、miR-4496 mimic共轉(zhuǎn)染至HCT116細(xì)胞,48 h后采用熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)試劑盒測(cè)定每組細(xì)胞的熒光素酶活性,以海參熒光素酶活性為內(nèi)參。

1.7 Western blotting檢測(cè)靶基因蛋白的表達(dá)

采用預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液洗滌兩組HCT116細(xì)胞,使用蛋白裂解液提取總蛋白。蛋白樣品采用SDS-PAGE膠分離,采用濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)至PVDF膜。5%脫脂牛奶封閉1.5 h,按比例稀釋一抗并過(guò)夜孵育,在室溫下孵育HRP標(biāo)記的二抗羊抗兔1.5 h。采用電化學(xué)發(fā)光液進(jìn)行曝光、顯影。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 結(jié)直腸癌細(xì)胞中miR-4496的相對(duì)表達(dá)量

qRT-PCR檢測(cè)顯示,與HIEC細(xì)胞相比,結(jié)直腸癌細(xì)胞株中miR-4496表達(dá)均明顯下降(P<0.05),HCT116細(xì)胞中miR-4496相對(duì)表達(dá)量最低(P<0.01,見(jiàn)圖1),以HCT116細(xì)胞為受試對(duì)象進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

與HIEC細(xì)胞相比,*P<0.05,**P<0.01圖1 qRT-PCR檢測(cè)結(jié)直腸癌細(xì)胞株和正常腸黏膜上皮細(xì)胞中miR-4496相對(duì)表達(dá)量Figure 1 The relative expression of miR-4496 in colorectal cancer cell lines and normal intestinal mucosal epithelial cells by qRT-PCR

2.2 qRT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染后HCT116細(xì)胞中miR-4496相對(duì)表達(dá)量

對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組HCT116細(xì)胞中miR-4496相對(duì)表達(dá)量分別為1.01±0.10和9.12±1.20,差異具有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=6.72,P<0.01),表明轉(zhuǎn)染成功。

2.3 miR-4496對(duì)HCT116細(xì)胞增殖能力的影響

MTT檢測(cè)顯示,與對(duì)照組相比,實(shí)驗(yàn)組轉(zhuǎn)染miR-4496后第2天開(kāi)始,細(xì)胞吸光度明顯下降,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見(jiàn)圖2)。

與對(duì)照組相比,*P<0.05,**P<0.01圖2 MTT檢測(cè)miR-4496對(duì)HCT116細(xì)胞增殖能力的影響Figure 2 Effect of miR-4496 on the proliferation of HCT116 cells by MTT

2.4 miR-4496對(duì)HCT116細(xì)胞侵襲能力的影響

Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)顯示,對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組HCT116細(xì)胞的侵襲細(xì)胞數(shù)分別為(78.67±8.84)個(gè)和(24.94±4.10)個(gè),實(shí)驗(yàn)組侵襲細(xì)胞數(shù)明顯減少,差異具有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=5.51,P<0.01,見(jiàn)圖3),表明miR-4496可導(dǎo)致HCT116細(xì)胞侵襲能力明顯降低。

與對(duì)照組相比,**P<0.01圖3 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-4496對(duì)HCT116細(xì)胞侵襲能力的影響 (結(jié)晶紫染色,×100)Figure 3 Effect of miR-4496 on the invasion ability of HCT116 cells was detected by Transwell assay (crystal violet staining,×100)

2.5 miR-4496與LAMP3基因的靶向關(guān)系

采用miRecords在線網(wǎng)站預(yù)測(cè)結(jié)果顯示,miR-4496的靶基因可能是LAMP3(見(jiàn)圖4)。雙光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)顯示,轉(zhuǎn)染miR-4496 mimic后,野生型LAMP3的熒光素酶活性為1.00±0.03,明顯低于mimic-NC組(0.41±0.05),差異具有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=9.38,P<0.01,見(jiàn)圖5),表明miR-4496可靶向結(jié)合LAMP3。

圖4 miR-4496與LAMP3 mRNA的互補(bǔ)配對(duì)序列Figure 4 The complementary paired sequence of miR-4496 and LAMP3 mRNA

與野生型LAMP3+mimic-NC相比,**P<0.01圖5 雙光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miR-4496與LAMP3 mRNA的靶向關(guān)系Figure 5 The targeting relationship between miR-4496 and LAMP3 mRNA verified by dual luciferase reporter experiment

2.6 qRT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染后HCT116細(xì)胞中LAMP3 mRNA相對(duì)表達(dá)量

對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組HCT116細(xì)胞中LAMP3 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為1.06±0.07和0.29±0.07,差異具有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=6.90,P<0.01),表明miR-4496可抑制LAMP3 mRNA的表達(dá)。

2.7 Westen blotting檢測(cè)LAMP3蛋白及相關(guān)蛋白的相對(duì)表達(dá)

Western blotting檢測(cè)顯示,與對(duì)照組相比,實(shí)驗(yàn)組HCT116細(xì)胞中LAMP3蛋白表達(dá)下降,細(xì)胞增殖蛋白如CDK7、Cyclin H蛋白表達(dá)降低,細(xì)胞侵襲蛋白如Vimentin、ZEB-2蛋白表達(dá)降低(見(jiàn)圖6)。

圖6 Western blotting檢測(cè)LAMP3蛋白及相關(guān)蛋白的相對(duì)表達(dá)Figure 6 The relative expression of LAMP3 protein and related proteins by Western blotting

3 討論

近年來(lái),在結(jié)直腸癌中發(fā)現(xiàn)了許多異常表達(dá)的miRNA如miR-375-3p[8]、miR-27b-3p[9]、miR-802[10]等。miRNA通過(guò)在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達(dá),影響結(jié)直腸癌的發(fā)生和進(jìn)展[11,12]。Wang等[7]研究證明,miR-4496可明顯抑制前列腺癌細(xì)胞的侵襲。Li等[6]研究證明,miR-4496可抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的增殖、遷移、侵襲及上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化。miR-4496屬于腫瘤抑制性miRNA。然而,miR-4496在結(jié)直腸癌中的表達(dá)和作用尚不清楚。本研究顯示與正常腸黏膜上皮細(xì)胞相比,miR-4496在結(jié)直腸癌細(xì)胞系中的表達(dá)顯著下調(diào)。在結(jié)直腸癌細(xì)胞中上調(diào)miR-4496表達(dá)可明顯降低細(xì)胞的增殖和侵襲能力。miR-4496在結(jié)直腸癌中發(fā)揮著腫瘤抑制性miRNA的作用。

采用miRecords在線網(wǎng)站預(yù)測(cè)顯示,miR-4496的靶基因可能是溶酶體膜蛋白3(lysosome associated membrane protein 3,LAMP3)。LAMP3基因位于人染色體3q27,LAMP3蛋白是一種重要的溶酶體膜蛋白,在細(xì)胞溶酶體的形成及維持其穩(wěn)定方面發(fā)揮關(guān)鍵作用[13]。有研究表明,LAMP3蛋白在食管癌、卵巢癌、喉癌等腫瘤中表達(dá)顯著上調(diào),發(fā)揮癌基因作用[14,15]。LAMP3蛋白在結(jié)直腸癌組織表達(dá)明顯增加,LAMP3蛋白較高的患者,臨床分期和總體生存率較差[16]。本研究通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)證實(shí),LAMP3是結(jié)直腸癌HCT116細(xì)胞中miR-4496的直接靶基因。qRT-PCR和Westen blotting進(jìn)一步表明,miR-4496可能與LAMP3 mRNA結(jié)合,促進(jìn)LAMP3 mRNA的降解并抑制LAMP3蛋白的翻譯。LAMP3蛋白表達(dá)降低后,細(xì)胞增殖蛋白如CDK7、Cyclin H蛋白表達(dá)降低,細(xì)胞侵襲蛋白如Vimentin、ZEB-2蛋白表達(dá)降低,表明結(jié)直腸癌HCT116細(xì)胞的增殖和侵襲能力降低。

綜上所述,miR-4496是一種結(jié)直腸癌抑制性的miRNA,miR-4496通過(guò)調(diào)節(jié)LAMP3基因表達(dá),抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖和侵襲。本研究可能為結(jié)直腸癌的診斷和治療提供新的靶點(diǎn)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。