馮少青,孟 峻

(1內(nèi)蒙古醫(yī)科大學附屬醫(yī)院臨床檢驗診斷學教研室,呼和浩特 010059;2內(nèi)蒙古醫(yī)科大學附屬醫(yī)院檢驗科;*通訊作者,E-mail:nmfrank@163.com)

Cdc25B屬于細胞分裂周期25(cell division cycle 25,Cdc25)磷酸酶家族,它可以通過激活細胞周期依賴性蛋白激酶(CDKs)來驅(qū)動細胞周期,并且可以參與細胞周期檢查點的調(diào)控,其活性與其亞細胞定位和磷酸化狀態(tài)有直接關(guān)系[1,2]。在哺乳動物細胞周期調(diào)控過程中,Cdc25B主要在有絲分裂G2-M過渡階段激活CDK1-cyclin B而發(fā)揮作用[3]。Cdc25B已被證實是調(diào)節(jié)細胞周期進程的關(guān)鍵因子,它作為一種Thr/Tyr雙特異性的保守性磷酸酶,對無活性的前有絲分裂促進因子磷酸酶發(fā)揮雙重特異性作用,使之被修飾為具有活性的去磷酸化形式,進而恢復有絲分裂[4]。Cdc25B也被證實參與中心體復制和調(diào)控微管成核[5],并且是紅細胞前體細胞周期的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子,作為靶基因參與紅細胞的生成和分化[6]。

細胞周期失調(diào)是人類癌癥的一個共同特征,它至少會導致癌癥發(fā)展的兩個特征,即不受控制的細胞增殖和基因組不穩(wěn)定[7,8]。而Cdc25B在細胞周期調(diào)控中發(fā)揮重要作用,并且Cdc25B的過表達已在多種人類癌癥中被觀察到,并與較差的臨床預后相關(guān)[9],這表明對Cdc25B的研究有助于更好地了解癌癥的作用機制及發(fā)現(xiàn)新的癌癥治療靶點。Cdc25B的過表達是一個復雜的過程,其中S15A可能是造成其磷酸化的關(guān)鍵位點。此研究旨在構(gòu)建Cdc25B的突變型Cdc25B(S15A)的熒光質(zhì)粒,為進一步研究Cdc25B及其突變體在小鼠受精卵G2/M期的作用做準備。

1 材料與方法

1.1 儀器與軟件

超凈工作臺(SW-OJ-2F,Airtech公司);超速離心機(Sigma公司);基因擴增儀(9600型,HEMA);電泳儀(JY600E,君意生物科技公司);CmSuite8(加拿大Corel公司);Sequencher(廣州贏森生物科技有限公司)。

1.2 材料與試劑

pcDNA3.1-3xflag-Cdc25B(S15A)載體由本課題組合成;限制性內(nèi)切酶(Thermo Scientific公司);微量瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(B518131-0100,上海生工);質(zhì)粒小提試劑盒(B518191-0050,上海生工);PrimeSTAR Max Premix(2X)(R045A,TaKaRa公司);TaKaRa Taq(R001B,TaKaRa公司);ClonExpress Ⅱ One Step Cloning Kit連接酶(C113-2,諾唯贊公司);真核表達載體pcDNA3.1(+)、Stbl3感受態(tài)細胞(廣州輝駿生物科技有限公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 引物設(shè)計 結(jié)合實驗需求,利用CmSuite8軟件設(shè)計熒光基因EGFP和突變基因Cdc25B(S15A)的引物擴增序列(見表1),為進一步實驗做準備。此引物由鴻訊生物合成。

表1 PCR引物序列Table 1 Primer sequences for PCR

1.3.2 擴增EGFP目的片段 以含目的基因的質(zhì)粒為模板,使用Prime STAR高保真酶,按照TaKaRa Taq試劑盒說明書的操作步驟進行PCR反應(yīng),擴增熒光標簽EGFP,反應(yīng)體系為:含EGFP的質(zhì)粒模板50 ng;EGFP的上、下游引物各1 μl;Prime STAR Max(2×)10 μl,繼續(xù)加入ddH2O定容總體積到20 μl。PCR反應(yīng)的條件為:96 ℃預變性5 min,96 ℃變性20 s;60 ℃退火30 s;72 ℃ 1 min;72 ℃延伸3 min,進行30個循環(huán),在16 ℃下保存擴增的EGFP片段。PCR成功擴增目的片段后,取擴增產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠電泳上擴增驗證,電泳產(chǎn)物通過與DNA marker比對,判斷是否擴增成功。

PCR產(chǎn)物回收:PCR產(chǎn)物經(jīng)1%凝膠電泳后,在紫外燈下回收DNA目的片段,用手術(shù)刀小心地切取含目的基因片段的凝膠條帶,放入1.5 ml EP管中,即得到EGFP熒光基因片段(具體步驟參照微量瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒所附說明書)。

1.3.3 載體雙酶切 向無菌的0.2 ml EP反應(yīng)管中依次加入pcDNA3.1-3xflag-Cdc25B(S15A)載體5 μg;10×Buffer 5 μl;XbaⅠ和BamH Ⅰ各1.5 μl,繼續(xù)注入ddH2O補充總體積到50 μl,于37 ℃下進行酶切反應(yīng)60 min。載體酶切后,進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

酶切產(chǎn)物的回收:酶切產(chǎn)物經(jīng)1%凝膠電泳后,在紫外燈照下,用手術(shù)刀仔細切取瓊脂糖凝膠中所需的載體條帶至1.5 ml干凈的EP管中,按照微量瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒所附實驗步驟回收線性化的載體條帶。

1.3.4 目的片段與載體連接 使用ClonExpress Ⅱ One Step Cloning Kit連接酶,連接目的基因EGFP片段與pcDNA3.1-3xflag-Cdc25B(S15A)酶切載體,向0.2 ml EP管中加入以下反應(yīng)物:EGFP和酶切載體各100 ng;ClonExpress Ⅱ One Step Cloning Kit連接酶2 μl;5×ClonExpress Ⅱ Buffer 4 μl,繼續(xù)加ddH2O使總體積達到20 μl,在37 ℃下進行連接反應(yīng)30 min后,冰浴5 min,即得到連接產(chǎn)物,所得連接產(chǎn)物用于后續(xù)步驟。

1.3.5 感受態(tài)細胞的轉(zhuǎn)化 于冰浴中解凍混勻Stbl3感受態(tài)細胞,用移液槍從中吸取100 μl至干凈的EP反應(yīng)管中,再吸取10 μl連接產(chǎn)物加入管中,將兩者輕輕轉(zhuǎn)動混勻,將管放入冰水中冰浴30 min,之后立即移入42 ℃水箱中水浴熱休克60 s,快速將反應(yīng)管轉(zhuǎn)移至冰浴中2-3 min后將管取出,加入300 μl的LB培養(yǎng)基后混勻菌液,在37 ℃、200 r/min的振蕩培養(yǎng)箱中振蕩培養(yǎng)1 h,于超凈工作臺中,將菌液均勻涂布于含有Amp抗生素(100 μg/ml)的LB平板上,室溫下平放至液體吸收,倒置平板于37 ℃的生化培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)過夜。

1.3.6 陽性克隆菌落的PCR鑒定及測序 于干凈的EP管中配制菌檢PCR混合液,向管中加入菌落1 μl;上、下游引物各1 μl(引物序列見表1);TaKaRa Taq Max 10 μl;加ddH2O 7 μl定容至20 μl。配好混合液后分別加到無菌的八連管內(nèi),于超凈工作臺內(nèi),選取8個單獨的菌落,做好標記,用干凈的小槍頭,輕輕碰下平板內(nèi)菌落的一邊,把粘有菌的槍頭,轉(zhuǎn)移到有混合液的管內(nèi),輕輕搖動槍頭,使菌能分散到液體中,之后棄掉槍頭。進行PCR擴增反應(yīng):94 ℃預變性5 min;94 ℃變性30 s;60 ℃退火30 s;72 ℃1min;72 ℃延伸3 min,進行25個循環(huán),保存于16 ℃。擴增完成后,往PCR管中加入2 μl 10×loading Buffer,取10 μl樣品點樣到1%瓊脂糖凝膠中做凝膠電泳檢測,并加入5 μl Marker做參照,對照Marker大小,選取正確的菌落搖菌以備測序。將菌落PCR鑒定得到的陽性克隆,送測序公司進行質(zhì)粒DNA序列檢測,測序完成后,利用Sequencher軟件比對測序結(jié)果。

1.3.7 質(zhì)粒的提取及酶切鑒定 經(jīng)測序驗證正確的陽性克隆,安排質(zhì)粒小提,具體步驟見試劑盒說明書。配置反應(yīng)液:向反應(yīng)體系中加入10×Buffer 5 μl;熒光質(zhì)粒pcDNA3.1-3xflag-Cdc25B(S15A)-EGFP 2 μg;BamH Ⅰ和XbaⅠ各1 μl;繼續(xù)加入ddH2O將反應(yīng)總體積補充到20 μl,在37 ℃下進行酶切反應(yīng)20 min。取5 μl Marker和25 μl的酶切質(zhì)粒樣品,經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.3.8 細胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 于37 ℃ 5% CO2的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)DMEM培養(yǎng)液(含10 μg/ml鏈霉素,100 U/ml青霉素,10%胎牛血清)中培養(yǎng)HEK293細胞,待細胞密度達到80%以后將HEK293細胞轉(zhuǎn)染至LipofectamineTM2000試劑盒,具體步驟參照說明書。放置24 h后,HEK293細胞可轉(zhuǎn)染5 μg pc-DNA3.1-3xflag-Cdc25B(S15A)-EGFP DNA。

1.3.9 Western blot法檢測pcDNA3.1-3xflag-Cdc25B(S15A)-EGFP在細胞中的表達 于48 h后收集轉(zhuǎn)染細胞中目的細胞并提取蛋白,利用BCA試劑盒檢測蛋白濃度。取50-80 μg的蛋白樣品,再按照比例加入上樣緩沖液,沸水浴10 min,冷卻、離心后在12%的分離膠中進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE),在110 V 90 min下利用濕轉(zhuǎn)法將其電轉(zhuǎn)至PVDF膜。接著在TBST溶解的5%的脫脂奶粉和磷酸鹽緩沖液下室溫封閉1 h,4 ℃孵育一抗[單克隆抗體(1 ∶1 000),兔來源的Anti-Cdc25B單克隆抗體(1 ∶200)以及兔來源的抗β-actin]過夜,次日用TBST洗滌4遍(每次8 min),然后室溫計時2 h孵育HRP標記的二抗(鼠抗兔的單抗IgG 1 ∶5 000),最后檢測PVDF膜上蛋白的表達情況。

2 結(jié)果

2.1 熒光表達載體pcDNA3.1-3xflag-Cdc25B(S15A)-EGFP的構(gòu)建及鑒定

EGFP目的片段與pcDNA3.1-3xflag-Cdc25B(S15A)載體連接,經(jīng)測序公司進行質(zhì)粒DNA序列檢測,結(jié)果顯示目的基因插入正確,部分測序結(jié)果見圖1。將構(gòu)建好的熒光質(zhì)粒pcDNA3.1-3xflag-Cdc25B(S15A)-EGFP用XbaⅠ和BamH Ⅰ限制性內(nèi)切酶鑒定,據(jù)瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果顯示,觀察到的條帶位置與預期位置一致(見圖2)。目的基因EGFP條帶約位于3 300 bp,pCDNA3.1-3xflag-Cdc25b(S15A)載體條帶約位于7 000 bp,與預期相符,進一步證明基因插入正確位置,成功獲得pcDNA3.1-3xflag-Cdc25B(S15A)-EGFP熒光表達載體,可用于體外轉(zhuǎn)錄。

圖1 pcDNA3.1-3xflag-Cdc25b(S15A)-EGFP測序結(jié)果Figure 1 Sequencing results of pcDNA3.1-3xflag-Cdc25b(S15A)-EGFP

M.DL10000 DNA Marker；1.pcDNA3.1-3xflag-Cdc25b(S15A)-EGFP質(zhì)粒DNA雙酶切(BamH Ⅰ和Xba Ⅰ)產(chǎn)物圖2 pcDNA3.1-3xflag-Cdc25b(S15A)雙酶切結(jié)果Figure 2 Double digestion result of pcDNA3.1-3xflag-Cdc25b(S15A)

2.2 熒光表達載體pcDNA3.1-3xflag-Cdc25B(S15A)-EGFP在HEK293細胞中的表達

通過脂質(zhì)體法將擴增好的熒光質(zhì)粒pcDNA3.1-3xflag-Cdc25B(S15A)-EGFP轉(zhuǎn)染至HEK293細胞中,利用Western blot法檢測到,在轉(zhuǎn)染了熒光質(zhì)粒pcDNA3.1-3xflag-Cdc25B(S15A)-EGFP的HEK293感受態(tài)細胞中,熒光標簽-EGFP成功表達(見圖3)。證明Cdc25B突變型S15A的熒光表達載體pcDNA3.1-3xflag-Cdc25B(S15A)-EGFP成功構(gòu)建并能夠正確表達。

1．未轉(zhuǎn)染組;2．空載體組;3．轉(zhuǎn)染3xflag-Cdc25b(S15A)-EGFP組圖3 3xflag-Cdc25b(S15A)-EGFP的HEK293細胞中的表達Figure 3 Expression of 3xflag-Cdc25b(S15A)-EGFP in HEK293 cells

3 討論

Cdc25B是一個高度保守的雙特異性磷酸酶,通過靶向CDK1(Cdc2)的Thr14和Tyr15來激活整個CDK1-Cyclin B復合物,從而驅(qū)動有絲分裂G2/M期的轉(zhuǎn)變[10]。Cdc25B的N端與C端間具有兩種特異性序列,分別是核定位序列和核輸出序列,它們負責調(diào)控細胞周期進程中Cdc25B在胞漿、胞核之間的穿梭,Cdc25B在細胞減數(shù)分裂啟動之前由細胞質(zhì)進入細胞核,減數(shù)分裂啟動后由細胞核重新回到細胞質(zhì)[11]。Cdc25B的N端參與調(diào)控微管動力學和有絲分裂進程,C端最后20個殘基具有很強的柔韌性,部分可以阻斷活性位點并與蛋白核心建立瞬態(tài)接觸[12,13]。此外,Cdc25B可受PKA的磷酸化或去磷酸化,調(diào)節(jié)其靶點CDK1的狀態(tài),從而調(diào)控細胞周期的進程[14]。

Cdc25B磷酸酶在一些人類癌癥中高表達,包括卵巢癌、肝癌、腎癌、乳腺癌和食管鱗癌等[15-19],它參與調(diào)節(jié)細胞周期檢查點,并成為新抗癌藥物開發(fā)的可能靶點,然而,Cdc25B活性的測定方法和靶向Cdc25B的藥物篩選方法仍存在一些問題。目前測定Cdc25B磷酸酶活性常用的方法是使用對硝基苯磷酸鹽或鄰甲基熒光素磷酸鹽作為底物,但是由于這些底物是非特異性的,Cdc25B的活性經(jīng)常被不準確地表達[20]。因此,Cairns等[21]開發(fā)了一種基于Western blotting的非放射性同位素測定方法,用CDK1適當?shù)販y量Cdc25B活性。在篩選抗癌藥物時,為了避免出現(xiàn)假陽性或假陰性的結(jié)果,利用有效的方法檢測Cdc25B的活性是必不可少的。

本課題組前期利用RNA干涉沉默Cdc25B基因后發(fā)現(xiàn)卵母細胞減數(shù)分裂發(fā)生阻滯,受精卵的G1期延長;但是顯微注射Cdc25B mRNA后受精卵的卵裂率明顯提高[22]。這些研究顯示了Cdc25B在細胞周期進程中的重要作用,但其作用機制尚不明確,有待進一步研究。本實驗化學合成Cdc25B突變基因S15A的熒光質(zhì)粒,成功構(gòu)建了熒光表達載體pcDNA3.1-3xflag-Cdc25B(S15A)-EGFP。利用脂質(zhì)體法將構(gòu)建好的pcDNA3.1-3xflag-Cdc25B(S15A)-EGFP載體轉(zhuǎn)染至Stbl3感受態(tài)細胞,通過Western blot法檢測到Cdc25B突變基因S15A的熒光質(zhì)粒成功表達。實驗中合成的S15A熒光質(zhì)粒有益于接下來對Cdc25B基因的研究,有助于更合理的設(shè)計Cdc25B的配體。課題研究成果應(yīng)用于農(nóng)牧業(yè),可以提高動物的繁殖數(shù)量;應(yīng)用于人類生殖輔助,可以提高體外受精成功概率,縮短體外受精時間,盡早植入人體;應(yīng)用于腫瘤治療,可以使腫瘤生長延緩G2期,提高腫瘤患者生存率。查閱文獻發(fā)現(xiàn),目前國內(nèi)外對Cdc25B的了解尚不全面,因此需更深入地探究Cdc25B在細胞中的作用機制。