謝云鵬,胡 軍,柳 新,劉 兵,于 淼,呼鐵民*

(1承德醫(yī)學院附屬醫(yī)院神經(jīng)外科,承德 067000;2承德醫(yī)學院附屬醫(yī)院腫瘤科;*通訊作者,E-mail:cyfysjwk1@163.com)

腦膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最為常見、發(fā)病率最高且預(yù)后最差的原發(fā)性腫瘤之一[1]。臨床上治療手段依然是手術(shù)聯(lián)合放化療為主,切除不徹底和放化療藥物不易通過血腦屏障成為腦膠質(zhì)瘤治療的巨大瓶頸。近年來研究發(fā)現(xiàn),腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展是多因素、多基因共同參與的結(jié)果[2],探究腦膠質(zhì)瘤發(fā)生及發(fā)展的分子機制、尋找新的生物治療靶點已迫在眉睫。Smad7是轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)受體激酶底物[3],是Smads家族中3個亞型中的抑制型Smad,Smad7最主要的作用是作為TGF-β信號通路的負調(diào)控因子[4]。有研究表明,Smad7還能以不依賴TGF-β1的方式去影響一些參與致癌過程調(diào)控的分子的表達和功能[5]。本研究以腦膠質(zhì)瘤細胞系U-87MG為研究對象,獨立于TGF-β信號通路探討Smad7對腦膠質(zhì)瘤細胞增殖與凋亡影響的作用機制,為腦膠質(zhì)瘤的生物靶向治療提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

人腦星形膠質(zhì)母細胞瘤U-87MG細胞(賽百慷上海生物公司)。Smad7 siRNA及轉(zhuǎn)染試劑lipofectamine2000(lipo2000)均為美國Invitroden公司產(chǎn)品。PCR引物由上海生物工程有限公司合成,Trizol總RNA抽提試劑盒、第1鏈cDNA合成試劑盒及PCR擴增試劑盒均購自寶生物工程大連有限公司。Smad7、PCNA、CyclinD1、Bcl-2、Bax、PI3K、Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR及β-actin鼠源單克隆抗體均購于美國Epitomics公司,羊抗鼠二抗購于美國KPL公司。CCK-8購于美國APExBIO公司。細胞凋亡試劑盒購于美國BD公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 腦膠質(zhì)瘤U-87MG細胞于含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基中,置于5%二氧化碳的37 ℃細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將細胞分為干擾組(Smad7-si)轉(zhuǎn)染靶向Smad7的siRNA,陰性對照組轉(zhuǎn)染陰性對照siRNA,空白對照組不做任何處理。轉(zhuǎn)染前24 h取對數(shù)生長期的U-87MG細胞接種于6孔板中,每孔細胞1×105個,完全培養(yǎng)基2 ml,要求細胞在24 h達到45%-70%融合。按照lipo2000說明書推薦最佳比例,每孔siRNA用量為7.5 μl,lipo2000為5 μl,均用無血清培養(yǎng)基稀釋,混合后室溫靜置20 min,將混合物柔和加入6孔板中。輕搖混勻,置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h后更換為完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng),于48 h收集細胞進行后續(xù)相關(guān)檢測。

1.2.2 Western blot檢測各組Smad7蛋白的表達 收集各組U-87MG細胞,每孔加入80 μl細胞裂解液,提取總蛋白,BCA蛋白定量試劑盒檢測總蛋白濃度,與樣品處理液按比例混合后100 ℃處理10 min,每孔加樣30 μg,80 V穩(wěn)壓電泳,轉(zhuǎn)膜,脫脂奶粉室溫封閉2 h,Smad7單抗(1 ∶1 000)室溫孵育2 h,TBST洗膜,二抗(1 ∶5 000)室溫孵育1 h,TBST洗膜,ECL超敏發(fā)光,于化學發(fā)光儀顯影并保存條帶。Quantity One 4.6.2軟件計算條帶灰度值,計算Smad7/β-actin數(shù)值,即Smad7的相對表達量。

1.2.3 細胞計數(shù)并繪制細胞生長曲線檢測各組細胞的增殖 轉(zhuǎn)染6 h用胰酶將細胞消化成細胞懸液,按5×103個/孔的密度接種于96孔板,分別在轉(zhuǎn)染24,48,72 h對各組細胞進行計數(shù),每組取3孔,每孔計數(shù)3次,求平均值,繪制細胞增殖曲線。

1.2.4 CCK-8實驗檢測各組細胞增殖 轉(zhuǎn)染6 h用胰酶將細胞消化成細胞懸液,按5×103個/孔的密度接種于96孔板,每組6個孔,每孔100 μl,在轉(zhuǎn)染48 h每孔加入10 μl CCK-8溶液,將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱中孵育2 h,用酶標儀測定450 nm處的吸光度值。

1.2.5 克隆形成實驗檢測各組細胞增殖 將細胞(5×102/孔)接種于12孔板中,置于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中,37 ℃,5% CO2培養(yǎng)14 d。然后用4%多聚甲醛固定20 min,再用0.1%結(jié)晶紫染色20 min,計數(shù)含有≥20個細胞的菌落數(shù),獲得具有代表性的圖像。

1.2.6 流式細胞術(shù)檢測各組細胞凋亡率 用不含EDTA的0.25%的胰蛋白酶消化轉(zhuǎn)染48 h的細胞,制成單細胞懸液,通過細胞計數(shù)保證每組細胞數(shù)量為5×105個,用PBS洗滌細胞2次,離心重懸細胞,每組加入500 μl結(jié)合緩沖液,加入Annexin Ⅴ-FITC和PI各5 μl,柔和混勻,室溫避光5 min,流式細胞儀上機檢測。

1.2.7 Western blot檢測各組細胞增殖、凋亡及通路相關(guān)蛋白表達情況 收集各組U-87MG細胞,每孔加入80 μl細胞裂解液,提取總蛋白,BCA蛋白定量試劑盒檢測總蛋白濃度,與樣品處理液按比例混合后100 ℃處理10 min,每孔加樣30 μg,80 V穩(wěn)壓電泳,轉(zhuǎn)膜,脫脂奶粉室溫封閉2 h,PCNA、CyclinD1、Bcl-2、Bax、PI3K、Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR單抗(1 ∶1 000)室溫孵育2 h,TBST洗膜,二抗(1 ∶5 000)室溫孵育1 h,TBST洗膜,ECL超敏發(fā)光,于化學發(fā)光儀顯影并保存條帶。Quantity One 4.6.2軟件計算條帶灰度值,計算目的蛋白/β-actin數(shù)值,即目的蛋白的相對表達量。

2 結(jié)果

2.1 靶向Smad7的siRNA抑制效率鑒定

與陰性對照組相比,干擾組Smad7蛋白的表達顯著降低(P<0.05);陰性對照組與空白對照組相比,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05,見圖1)。

與陰性對照組比較,*P<0.05圖1 Western blot檢測Smad7的表達Figure 1 Expression of Smad7 by Western blot

2.2 敲低Smad7對各組細胞生長的影響

細胞生長曲線結(jié)果顯示,與陰性對照組相比,干擾組細胞的增殖速度明顯升高,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。而陰性對照組與空白對照組間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05,見圖2)。

與陰性對照組比較,*P<0.05圖2 敲低對各組細胞生長的影響Figure 2 Effect of Smad7 knockdown on cell proliferation

2.3 敲低Smad7對各組細胞增殖活力的影響

通過CCK-8實驗,分別記錄轉(zhuǎn)染48 h各組細胞的吸光度值,結(jié)果顯示,干擾組吸光度值明顯高于陰性對照組,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。而陰性對照組與空白對照組間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05,見圖3)。

與陰性對照組比較,*P<0.05圖3 CCK-8實驗檢測各組細胞增殖活力Figure 3 Cell proliferation activity in each group by CCK-8 assay

2.4 敲低Smad7對各組細胞克隆形成能力的影響

克隆形成實驗顯示,干擾組克隆形成數(shù)明顯高于陰性對照組,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。而陰性對照組與空白對照組間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05,見圖4,5)。

圖4 克隆形成實驗檢測各組細胞克隆形成數(shù)Figure 4 Numbers of cell clone by clonal formation assay

與陰性對照組比較,*P<0.05圖5 敲低Smad7對各組細胞克隆形成能力的影響Figure 5 Effect of Smad7 knockdown on cell clone formation in each group

2.5 敲低Smad7對各組細胞增殖相關(guān)蛋白PCNA、CyclinD1表達的影響

Western blot結(jié)果顯示,干擾組細胞增殖相關(guān)指標PCNA和CyclinD1蛋白表達水平較其他兩組均升高(P<0.05),而陰性對照組與空白對照組的差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05,見圖6)。

與陰性對照組比較,*P<0.05圖6 Western blot檢測敲低Smad7對PCNA和CyclinD1表達的影響Figure 6 Effect of Smad7 knockdown on expression of PCNA and CyclinD1 proteins by Western blot

2.6 敲低Smad7對各組細胞凋亡的影響

流式細胞實驗結(jié)果顯示,干擾組凋亡率低于陰性對照組和空白對照組(6.41%±0.45%,vs12.34%±0.47%,12.58%±0.28%,P<0.05),陰性對照組和空白對照組間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05,見圖7)。

與陰性對照組比較,*P<0.05圖7 流式細胞術(shù)檢測敲低Smad7對細胞凋亡率的影響Figure 7 Effect of Smad7 knockdown on apoptotic rate of cells in each group by flow cytometry

2.7 敲低Smad7對各組細胞凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax表達的影響

Western blot結(jié)果顯示,細胞凋亡相關(guān)指標Bcl-2蛋白表達水平變化不大,但Bax蛋白表達水平較其他兩組均降低(P<0.05),而陰性對照組與空白對照組間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05,見圖8)。

與陰性對照組比較,*P<0.05圖8 Western blot檢測敲低Smad7對各組細胞凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax表達的影響Figure 8 Effect of Smad7 knockdown on expression of Bcl-2 and Bax by Western blot

2.8 敲低Smad7對各組細胞PI3K/Akt/mTOR通路相關(guān)蛋白表達的影響

Western blot結(jié)果顯示,通路相關(guān)蛋白PI3K、Akt和mTOR的磷酸化表達水平較兩個對照組均升高(P<0.05),而陰性對照組與空白對照組的差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05,見圖9)。

與陰性對照組比較,*P<0.05,**P<0.05圖9 Western blot檢測敲低Smad7對各組細胞PI3K/Akt/mTOR通路相關(guān)蛋白表達的影響Figure 9 Effect of Smad7 knockdown on expression of PI3K/Akt/mTOR-related proteins by Western blot

3 討論

腦膠質(zhì)瘤是臨床最為常見的顱內(nèi)腫瘤,生存期短、復發(fā)率和病死率高[6]。惡性增殖及侵襲性生長是其主要特征[7]。近年來研究顯示,腦膠質(zhì)瘤發(fā)病率逐年上升,約占中樞神經(jīng)系統(tǒng)的50%[8],腦膠質(zhì)瘤的傳統(tǒng)療法即手術(shù)切除輔助放化療并不能有效延長患者的總生存期[9],因此,尋找腦膠質(zhì)瘤生物治療的有效靶點顯得尤為必要。

Smad7最廣為人知的功能是與TβR1結(jié)合,并與Smad2/3競爭磷酸化的催化位點,從而阻止Smad2/3的磷酸化[10],除此之外,Smad7還可以通過招募磷酸酶來促進TβR1的脫磷酸化即失活[11],但關(guān)于Smad7在腫瘤中獨立于TGF-β通路而發(fā)揮作用,在腦膠質(zhì)瘤相關(guān)研究中未有報道。有研究表明,Smad7在腦膠質(zhì)瘤組織中有異常的高表達[12],這是否提示我們Smad7很可能是腦膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展過程中的一個重要靶標呢?本研究在腦膠質(zhì)瘤U-87MG細胞中敲低了Smad7的表達,通過細胞生長曲線、CCK-8實驗及克隆形成實驗發(fā)現(xiàn)細胞的增殖能力增強,我們又進一步采用Western blot從蛋白水平檢測了PCNA和CyclinD1的表達,PCNA是反映細胞增殖狀態(tài)的黃金指標,在細胞增殖的啟動上起重要作用[13],而CyclinD1是細胞周期G1期和S期的轉(zhuǎn)換開關(guān),其增高可通過影響細胞周期而促進細胞的惡性增殖[14]。本研究發(fā)現(xiàn),干擾組PCNA和CyclinD1均出現(xiàn)顯著升高,該結(jié)果進一步說明敲低Smad7會促進腦膠質(zhì)瘤U-87MG細胞的增殖。

本研究通過流式細胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)干擾組細胞凋亡率顯著下降,這說明干擾組抑制了細胞凋亡。我們又檢測了Bcl-2家族蛋白Bcl-2和Bax。Bcl-2家族基因分為促凋亡和抗凋亡基因兩類。其中Bax為促細胞凋亡的基因,Bcl-2為抗細胞凋亡基因。當該家族中促凋亡和抗凋亡基因表達平衡遭到破壞時,則影響細胞的凋亡程度[15]。本研究發(fā)現(xiàn),干擾組Bax表達下降,而Bcl-2的表達未見明顯差異,但干擾組Bax與Bcl-2的比值顯著下降,說明敲低Smad7抑制了腦膠質(zhì)瘤U-87MG細胞的凋亡。

在腦膠質(zhì)瘤等多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中,PI3K介導的Akt/mTOR信號通路往往被激活,對腫瘤細胞的增殖和凋亡發(fā)揮著重要的作用[16]。PI3K是一種存在于細胞質(zhì)的脂質(zhì)激酶,可以催化磷酯酰肌醇(PIP3)D3位的磷酸化,而PIP3是Akt質(zhì)膜轉(zhuǎn)運過程中的第二信使,Akt是PI3K下游的蛋白信號分子,是高度保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,其與PIP3相互作用后,絲氨酸/蘇氨酸位點發(fā)生磷酸化,Akt則被完全激活[17],激活的磷酸化Akt通過將mTOR的Ser-448位點磷酸化而激活mTOR,mTOR屬于PI3K蛋白激酶類家族,是p-Akt的直接底物,也是PI3K信號通路下游分子之一,被激活的mTOR具有調(diào)節(jié)細胞生長、促進細胞增殖、抑制凋亡的功能,在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要的作用。p-Akt和p-mTOR是激活PI3K/Akt/mTOR信號通路的關(guān)鍵分子。研究表明,PI3K介導的Akt/mTOR信號通路的激活可以通過影響B(tài)cl-2家族來抑制細胞凋亡,進而促進細胞增殖[18]。本研究發(fā)現(xiàn),敲低Smad7之后,干擾組腦膠質(zhì)瘤細胞PI3K、Akt、mTOR蛋白的磷酸化水平升高,即敲低Smad7反而使PI3K/Akt/mTOR信號通路更加活躍。因此我們推測,敲低Smad7對腦膠質(zhì)瘤的增殖促進作用和凋亡抑制作用均與激活PI3K/Akt/mTOR信號通路有關(guān)。有研究表明,抑癌基因通過對PI3K/Akt/mTOR信號通路進行負性調(diào)節(jié)而起到抑制腫瘤細胞增殖和促進其凋亡的作用[19],因此,Smad7很可能在腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展過程中扮演抑癌基因的角色。

綜上,敲低Smad7可通過活化PI3K/Akt/mTOR信號通路而促進腦膠質(zhì)瘤U-87MG細胞的增殖并抑制其凋亡,本研究為Smad7作為腦膠質(zhì)瘤生物治療的潛在靶點提供了一定的理論依據(jù)。