劉林新 ，王修俊 ，張二康 ，于 沛 ，楊麗平 ，陳顏紅

（1.貴州大學(xué) 釀酒與食品工程學(xué)院，貴陽(yáng) 550025；2.貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴陽(yáng) 550025）

0 引言

泡菜是在發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生獨(dú)特風(fēng)味同時(shí)又保留了蔬菜本身營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的特色發(fā)酵食品，目前以自然發(fā)酵為主，存在機(jī)械化低、NIT含量偏高等問(wèn)題［1］，直投式發(fā)酵劑應(yīng)用于發(fā)酵蔬菜可減少食品安全隱患、保證發(fā)酵品質(zhì)穩(wěn)定，有助于發(fā)酵蔬菜規(guī)范化發(fā)展；而其中固定發(fā)酵劑因其體積小、含水量低，便于貯藏運(yùn)輸而成為研究熱點(diǎn)。固定化細(xì)胞技術(shù)是由固定化酶技術(shù)發(fā)展而來(lái)，最早由千畑一郎提出并應(yīng)用到發(fā)酵產(chǎn)業(yè)［2］，固定化可使菌種長(zhǎng)期穩(wěn)定保存，并可反復(fù)利用，減少二次污染，且固定化細(xì)胞具有更好的抗逆性，因其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，固定化技術(shù)現(xiàn)已在環(huán)保、化工、食品、制藥等領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用［3-6］。陳濤等研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過(guò)固定化的菌體在冷凍干燥過(guò)程中其存活率比菌泥直接凍干要高得多且發(fā)酵更好［7］，其中包埋法因其可以保護(hù)菌體且操作簡(jiǎn)單，穩(wěn)定性高，成本低等優(yōu)點(diǎn)，是近年來(lái)發(fā)展較為迅速的一種固定化方法［8-9］，而海藻酸鈉［10］、聚乙烯醇［11］、羧甲基纖維素鈉等都是常用的包埋載體［12-14］，因此可將固定化細(xì)胞技術(shù)作為制備直投式發(fā)酵劑的輔助技術(shù)。

本研究采用前期篩選的一株具有高降解NIT含量的發(fā)酵乳桿菌之一LF-8001濃縮菌液，探究其最適宜的固定化條件，以探究成球性、固定化溫度、固定化混合比例、密度、力學(xué)強(qiáng)度等為指標(biāo)，以發(fā)酵乳桿菌菌種存活率、亞硝酸鹽降解率作為判定依據(jù)，試驗(yàn)得出最佳固定化方式，為菌種包裝貯藏，制備直投式發(fā)酵劑提供有力的技術(shù)條件支撐。

1 試驗(yàn)材料與設(shè)備

1.1 菌種與試劑

試驗(yàn)菌種：發(fā)酵乳桿菌LF-8001（Lactobacillus fermentum strain），貴州大學(xué)發(fā)酵工程與生物制藥省級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

試驗(yàn)試劑：C3H6O3、NaNO3、NaCl、NH3·H2O、NaOH、KOH、Na2CO3、K2HPO4·3H2O，均為分析純，天津科密歐有限公司；海藻酸鈉、羧甲基纖維素鈉、氯化鈣，均為食品級(jí)，上海申光食用化學(xué)有限公司；牛肉膏、蛋白胨、酵母膏，生化試劑，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.2 主要儀器與設(shè)備

TMS-Pro物性測(cè)定儀（北京盈盛恒泰科技責(zé)任有限公司）；YX280B手提式不銹鋼蒸汽滅菌鍋（上海三申醫(yī)療器械）；VORTEX渦旋混合器（上海達(dá)姆有限公司）；722分光光度計(jì)（上海佑科儀表）；GZX-GF101-3-BS-II電熱鼓風(fēng)恒溫干燥箱（上海賀德）；GL-20G-II高速冷凍離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）。

1.3 試驗(yàn)方法及內(nèi)容

1.3.1 試驗(yàn)方法

1.3.1.1 發(fā)酵乳桿菌菌體分離濃縮

發(fā)酵乳桿菌的分離濃縮采用離心分離，將菌濃度達(dá)到1.08×1010CFU/ml的菌液于5 000 r/min、4 ℃、離心10 min的條件下進(jìn)行分離濃縮。

1.3.1.2 固定化細(xì)胞的制備

將固定化液高溫滅菌，冷卻至室溫后與分離濃縮后的菌液以一定比例混勻，然后逐滴緩慢滴入一定濃度的氯化鈣溶液中，25 ℃恒溫固定2 h，形成3.5±0.2 mm的固定化顆粒，將顆粒取出，用無(wú)菌生理鹽水沖洗，后置于無(wú)菌生理鹽水中4℃保存?zhèn)溆茫?5］。

1.3.2 發(fā)酵乳桿菌固定化單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.2.1 發(fā)酵乳桿菌固定化混合比例的確定

將菌液和固定化液分別以 1：3、1：4、1：5、1：6、1：7的比例混合，以1.3.1.3中方法制備固定化小球，以固定化小球的包埋率、NIT降解能力為指標(biāo)，結(jié)合固定化小球的密度、直徑和力學(xué)強(qiáng)度等物理參數(shù)，探究不同混合比例對(duì)固定化的影響。

1.3.2.2 發(fā)酵乳桿菌固定化溫度的確定

將菌液和固定化液按篩選得到的比例混合，然后逐滴緩慢滴入4%氯化鈣溶液中，分別于20、25、30、35、40、45 ℃恒溫固定2 h，形成固定化小球顆粒，將顆粒取出用無(wú)菌生理鹽水沖洗，同1.3.2.1中指標(biāo)參數(shù)，探究不同溫度對(duì)固定化的影響。

1.3.2.3 發(fā)酵乳桿菌固定化氯化鈣濃度的確定

將菌液和固定化液按篩選得到的比例混合，然后分別逐滴緩慢滴入1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%氯化鈣溶液中以篩選后的溫度恒溫固定，形成固定化小球顆粒，將顆粒取出用無(wú)菌生理鹽水沖洗，同1.3.2.1中指標(biāo)參數(shù)，探究不同氯化鈣濃度對(duì)固定化的影響。

1.3.3 指標(biāo)測(cè)定

（1）機(jī)械強(qiáng)度：即硬度，用質(zhì)構(gòu)儀進(jìn)行測(cè)定，測(cè)試條件為：Test Speed = 60 mm/min，Trigger Force= 0.2 N，%Deformation=50.00，Hold Time Between Cycles=0.00。

（2）NIT降解能力：取重量相同的固定化小球投入含亞硝酸鹽100 mg/L的無(wú)菌生理鹽水中適溫靜置8 h，按照如下亞硝酸鹽測(cè)定方法測(cè)定發(fā)酵液中剩余亞硝酸鹽含量，計(jì)算亞硝酸鹽降解率，以亞硝酸鹽降解率來(lái)反映其NIT降解能力。

（3）亞硝酸鹽測(cè)定方法：根據(jù)文獻(xiàn)［16］中方法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。發(fā)酵辣椒中的亞硝酸鹽的測(cè)定采用分光光度計(jì)法，參照食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 5009.33—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測(cè)定》中的鹽酸萘乙二胺比色法測(cè)定發(fā)酵辣椒中的亞硝酸鹽含量［17］。

亞硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定為y=40.465X-0.272，得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線其R2為0.999 53，即所有觀測(cè)點(diǎn)中有99.953%的點(diǎn)落在這條直線上，因此標(biāo)準(zhǔn)曲線具有較高的可信度。

1.3.4 發(fā)酵乳桿菌固定化正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

為了研究各影響因素對(duì)發(fā)酵乳桿菌固定化的影響，探究出發(fā)酵乳桿菌最適宜的固定化方式，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取固定化液與菌液的混合比例、固定化溫度、氯化鈣濃度3個(gè)因素按L9（34）進(jìn)行正交試驗(yàn)，以固定化小球的菌濃度、NIT降解能力為指標(biāo)進(jìn)行優(yōu)化，菌株的因素水平見(jiàn)表1。

表1 正交試驗(yàn)因素水平Tab.1 Factors and levels of orthogonal test

2 結(jié)果與分析

2.1 混合比例對(duì)發(fā)酵乳桿菌固定化的影響

發(fā)酵乳桿菌固定化液與菌液混合比例的不同，不僅會(huì)導(dǎo)致混合液中海藻酸鈉、羧甲基纖維素鈉濃度發(fā)生變化，影響最終成球效果和固定化小球的性能，而且會(huì)導(dǎo)致發(fā)酵乳桿菌的包埋率發(fā)生改變。按照1.3.2.1的試驗(yàn)方法，探究不同混合比例對(duì)LF-8001發(fā)酵乳桿菌固定化的影響，結(jié)果如表2。

由表2可以看到，發(fā)酵乳桿菌LF-8001的包埋率呈現(xiàn)先增加后趨于穩(wěn)定的趨勢(shì)，且在混合比例為1：4時(shí)達(dá)到最高的包埋率，其原因可能是在混合比例為1：3時(shí)，混合液內(nèi)海藻酸鈉和羧甲基纖維素鈉的濃度較低，導(dǎo)致固定化液粘度較低，形成的固定化小球強(qiáng)度不高，在沖洗的時(shí)候菌體有可能隨生理鹽水流出，導(dǎo)致小球內(nèi)包含的菌濃度降低，而隨著混合比例的變化，海藻酸鈉和羧甲基纖維素鈉的濃度逐漸升高，固定化液粘度更大，形成的固定化小球強(qiáng)度也更高，固定在小球內(nèi)的菌體不易流出，包埋率因此上升至穩(wěn)定，但海藻酸鈉和羧甲基纖維素鈉濃度過(guò)高時(shí)，由于混合液粘度較高使得固定化小球不易成型，或造成拖尾等成球效果不佳的現(xiàn)象［18］。

表2 混合比例對(duì)固定化小球參數(shù)影響Tab.2 Effect of mixing ratio on parameters of immobilized pellets

由表2可以看到發(fā)酵乳桿菌LF-8001的亞硝酸鹽降解率均呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢(shì)，且在混合比例為1：4時(shí)達(dá)到最高的降解率，原因可能是低濃度的海藻酸鈉和羧甲基纖維素鈉，形成的固定化小球孔隙較大，物質(zhì)交換速率較快，沖洗時(shí)菌體有可能隨生理鹽水流出，導(dǎo)致小球內(nèi)包含的菌體濃度降低，致使亞硝酸鹽降解率降低；而過(guò)高濃度的海藻酸鈉和羧甲基纖維素鈉，形成的固定化小球其內(nèi)部孔隙較小，菌體被牢牢固定在孔隙中，不易流出，但是由于孔隙較小，物質(zhì)交換速率較低，導(dǎo)致亞硝酸鹽降解率較低，當(dāng)菌液與固定化液的比例為1：4時(shí)，恰好使海藻酸鈉和羧甲基纖維素鈉達(dá)到適宜的濃度，此時(shí)菌體不會(huì)在沖洗時(shí)過(guò)分流出，也不會(huì)導(dǎo)致孔隙較小，因此混合比例為1：4時(shí)達(dá)到最高的亞硝酸鹽降解率。綜合考慮成球效果、包埋率和亞硝酸鹽降解率，發(fā)酵乳桿菌LF-8001最佳的混合比例1：4。

2.2 固定化溫度對(duì)發(fā)酵乳桿菌固定化的影響

在相同的固定化時(shí)間內(nèi)，溫度不同，固定化的效果也不盡相同，溫度通過(guò)影響固定化液與氯化鈣的反應(yīng)速率使固定化小球的成球性能發(fā)生變化，并且會(huì)對(duì)發(fā)酵乳桿菌的包埋率產(chǎn)生一定的影響。按照1.3.2.2的試驗(yàn)方法，探究不同固定化溫度對(duì)發(fā)酵乳桿菌LF-8001固定化的影響，結(jié)果如表3。由表3可以看到，發(fā)酵乳桿菌LF-8001的包埋率和NIT降解率總體呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，其原因可能是不同固定化溫度下混合液與氯化鈣的反應(yīng)速度有差別，導(dǎo)致在相同的固定化時(shí)間內(nèi)，形成的固定化小球完成度不同，即固定化溫度通過(guò)影響固定化小球完成度使包埋率和NIT降解率發(fā)生變化，在適宜的固定化溫度下，混合液與氯化鈣反應(yīng)完全，其包埋率及NIT降解率較高，反之則受影響。

表3 不同溫度下固定化小球參數(shù)Tab.3 Parameter changes of immobilized beads at different temperatures

LF-8001在20～25 ℃進(jìn)行固定時(shí)，其包埋率隨溫度升高而增加，形成固定化小球的NIT降解能力也隨固定化溫度的升高而增強(qiáng)，在25 ℃進(jìn)行固定時(shí)，其包埋率和形成固定化小球的NIT降解能力達(dá)到最高，而后包埋率和固定化小球的NIT降解能力隨溫度升高逐漸下降。綜合考慮成球效果、包埋率和NIT降解能力，LF-8001最佳的固定化溫度為25 ℃。

2.3 氯化鈣濃度對(duì)發(fā)酵乳桿菌固定化的影響

氯化鈣與固定化液反應(yīng)生成海藻酸鈣，過(guò)高的濃度會(huì)導(dǎo)致固定化小球的通透性降低，從而影響小球內(nèi)外物質(zhì)交換，降低其亞硝酸鹽降解率；而較低的濃度會(huì)減弱固定化小球的機(jī)械強(qiáng)度，導(dǎo)致其不宜成形或形狀不規(guī)則。按照1.3.2.3的試驗(yàn)方法，探究不同氯化鈣濃度對(duì)發(fā)酵乳桿菌LF-8001固定化的影響，結(jié)果如表4。

表4 不同氯化鈣濃度下固定化小球參數(shù)Tab.4 Parameter changes of immobilized beads under different calcium chloride concentrations

由表4可以看到，LF-8001的包埋率均呈現(xiàn)先增加后趨于穩(wěn)定的趨勢(shì)，隨著氯化鈣濃度的升高，LF-8001在氯化鈣濃度達(dá)到5%時(shí)其包埋率趨于穩(wěn)定。原因可能是在相同的固定化時(shí)間內(nèi)，氯化鈣濃度越高，混合液跟氯化鈣反應(yīng)越快，當(dāng)氯化鈣達(dá)到一定濃度之后，在2 h的固定化時(shí)間內(nèi)，形成的固定化小球結(jié)構(gòu)緊密，力學(xué)強(qiáng)度較高，孔隙較小，菌體已經(jīng)基本不會(huì)再在沖洗的過(guò)程中隨生理鹽水流出，此時(shí)盡管氯化鈣濃度繼續(xù)升高，其對(duì)包埋率并不會(huì)產(chǎn)生顯著影響。

由表4可以看到LF-8001的亞硝酸鹽降解率呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢(shì)。隨著氯化鈣濃度的升高，LF-8001在氯化鈣濃度達(dá)到5%時(shí)其亞硝酸鹽降解率達(dá)到最高，而后逐漸下降。原因可能是低濃度的氯化鈣，形成的固定化小球因菌體流出導(dǎo)致包埋率較低，因而亞硝酸鹽降解率較低，隨著氯化鈣濃度的升高，形成的固定化小球強(qiáng)度逐漸增加，孔隙逐漸變小，菌體流出率逐漸降低，在某一濃度其包埋率達(dá)到峰值，且孔隙大小適宜，不影響其物質(zhì)交換速率，此時(shí)亞硝酸鹽降解率最高，而后隨著氯化鈣濃度的繼續(xù)升高，形成的固定化小球的其孔隙也越來(lái)越小，導(dǎo)致影響其物質(zhì)交換速率，從而影響亞硝酸鹽降解率。綜合考慮成球效果、包埋率和亞硝酸鹽降解率，菌株LF-8001最佳的氯化鈣濃度為5%。

2.4 發(fā)酵乳桿菌固定化正交試驗(yàn)的優(yōu)化結(jié)果

根據(jù)1.3.4固定化正交優(yōu)化設(shè)計(jì)，對(duì)LF-8001的優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表5，方差分析見(jiàn)表6。

表5 正交試驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果Tab.5 The Optimized results orthogonal test

表6 正交實(shí)驗(yàn)方差分析Tab.6 Variance analysis orthogonal test

從表5的正交試驗(yàn)結(jié)果可以看出，以菌濃度為評(píng)價(jià)指標(biāo)，根據(jù)極差R1可以得出上述3個(gè)因素影響發(fā)酵乳桿菌LF-8001固定化的主次關(guān)系為A＞B＞C，即對(duì)發(fā)酵乳桿菌LF-8001固定化影響最大的是混合比例，其次是固定化溫度，影響最小的是氯化鈣濃度，由表6的方差分析可知，混合比例對(duì)發(fā)酵乳桿菌LF-8001固定化的影響有顯著差異，而固定化溫度、氯化鈣濃度對(duì)發(fā)酵乳桿菌LF-8001固定化的影響不顯著，因此較優(yōu)固定化方法組合為A1B1C1，為正交表中1號(hào)試驗(yàn)；以亞硝酸鹽降解率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，根據(jù)極差R2可以得出上述3個(gè)因素影響發(fā)酵乳桿菌LF-8001固定化的主次關(guān)系為C＞A＞B，即對(duì)發(fā)酵乳桿菌LF-8001固定化影響最大的是氯化鈣濃度，其次是混合比例，影響最小的是固定化溫度，由表6的方差分析可知，氯化鈣濃度對(duì)發(fā)酵乳桿菌LF-8001固定化的影響有顯著差異，而固定化溫度、混合比例對(duì)發(fā)酵乳桿菌LF-8001固定化的影響不顯著，因此較優(yōu)固定化方法組合為A1B2C1，此試驗(yàn)組合未在正交表中出現(xiàn)，對(duì)該組合進(jìn)行三次平行實(shí)驗(yàn)，得到該條件下菌濃度為1.49×1011CFU/g，亞硝酸鹽降解率為91.23%，稍優(yōu)于1號(hào)試驗(yàn)的結(jié)果，因此綜合考慮菌株濃度和亞硝酸鹽降解率這兩個(gè)指標(biāo)，發(fā)酵乳桿菌LF-8001最佳固定化方法組合為A1B2C1，即混合比例1：4，固定化溫度25 ℃，氯化鈣濃度4%。

3 結(jié)語(yǔ)

研究確定了LF-8001最佳固定化方法，以含1.2%海藻酸鈉 0.5%羧甲基纖維素鈉的溶液為固定化液，菌液和固定化液以1：4的比例混合均勻，然后逐滴緩慢滴入4%的氯化鈣溶液中，恒溫25 ℃固定2 h，在此條件下包埋率較高，固定化小球的活菌數(shù)達(dá)1.49×1011CFU/g，亞硝酸鹽降解率達(dá)到91.23%，該固定化技術(shù)可獲得具有菌種存活率高、便于運(yùn)輸貯藏，方便使用于工業(yè)化生產(chǎn)當(dāng)中的固定化小球。