慕鈺文 ，黃玉龍 ，張輝元

（1.甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工研究所，蘭州 730070；2.甘肅省果蔬貯藏加工技術(shù)創(chuàng)新中心，蘭州 730070；3.蘭州大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，蘭州 730000）

0 引言

花椒（Zanthoxylum bungeanum Maxim.）屬蕓香科花椒屬，是重要的食用香辛料［1-2］。花椒作為一種重要的經(jīng)濟(jì)作物，在四川省和重慶市、甘肅省等地廣泛種植［3-4］。目前，花椒果皮90%以上以整粒散裝形式加工銷售，而花椒籽作為花椒生產(chǎn)過程中的主要副產(chǎn)物，約占花椒總量的60%左右，部分作為種子育苗和榨油，大部分作為肥料或當(dāng)作廢料丟棄，造成極大的浪費(fèi)，嚴(yán)重影響花椒產(chǎn)業(yè)的健康持續(xù)發(fā)展［5-6］?；ń纷阎兄饕杏椭?、粗纖維、蛋白質(zhì)和多酚等有效成分，目前對于花椒籽的研究主要集中于花椒籽油及黑色素等方面的提?。?-9］。其中利用堿提酸沉法提取、大孔樹脂純化得到花椒籽黑色素，證明該黑色素即為酚類物質(zhì)，具有一定的抗氧化性［10］。但是對其中總多酚、黃酮等活性物質(zhì)的研究較少。而多酚、黃酮作為植物體內(nèi)的主要活性成分，具有較高抗氧化能力，已在食品、衛(wèi)生和醫(yī)藥等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用［11-13］。

本文以花椒籽為原料，采用不同極性溶液對其中總多酚和黃酮等活性成分的提取效果進(jìn)行評價(jià)，明確花椒籽中活性成分及抗氧化能力的相關(guān)性，旨在綜合利用花椒籽資源，擴(kuò)大花椒產(chǎn)品應(yīng)用范圍，提高經(jīng)濟(jì)效益，開發(fā)天然抗氧化劑，為花椒籽資源的開發(fā)利用提供必要的數(shù)據(jù)支撐及理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

材料：供試材料為甘肅天水地區(qū)主栽品種“大紅袍”，將新鮮花椒果實(shí)放入恒溫鼓風(fēng)干燥箱中于45 ℃下烘干至殼籽分離，取花椒籽為試驗(yàn)樣品。

試劑：蘆丁和沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品、福林酚、DPPH試劑、無水乙醇、丙酮、三氯乙酸、鐵氰化鉀、氯化鐵、鹽酸、亞硝酸鈉、氫氧化鈉、硝酸鋁、碳酸鈉等均為國產(chǎn)分析純。

儀器：Cary-100紫外分光光度計(jì)（美國瓦里安中國有限公司）；TGL-16LM冷凍離心機(jī)（湖南星科科學(xué)儀器有限公司）；BT224S分析天平（德國賽多利斯有限公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 活性成分的提取

以體積分?jǐn)?shù)分別為0（水）、30%、50%、70%的乙醇溶劑和30%、50%、70%的甲醇溶劑，按料液比 1：10（g/mL）浸提 30 min，然后 10 000 r/min離心10 min，上清液用來進(jìn)行活性成分及抗氧化性的測定。

1.2.2 總多酚含量的測定

采用Folin-Ciocalteu比色法測定總酚含量［14］。取1 mL提取液與1 mL的Folin-Ciocalteu試劑混合，靜置5 min后，加入3 mL濃度為7.5%的碳酸鈉溶液，于40 ℃避光反應(yīng)30 min，于765 nm波長處測定反應(yīng)液的吸光值?？偠喾雍恳詻]食子酸當(dāng)量表示（mg/g）。

在未來的幾十年里，我們不太可能會(huì)遇到有意識機(jī)器的反叛，但我們可能不得不面對成群結(jié)隊(duì)的機(jī)器人。這些機(jī)器人比我們的母親更懂得如何觸發(fā)我們的情感，并在人類精英的命令下，利用這種不可思議的能力，試圖向我們推銷某種東西，無論是汽車、政治家，還是整個(gè)意識形態(tài)。機(jī)器人可能會(huì)識別我們最深的恐懼、仇恨和渴望，并利用它們來對付我們。我們已經(jīng)在近期世界各地的選舉和公民投票中領(lǐng)略到了這一點(diǎn)，黑客學(xué)會(huì)了如何通過分析有關(guān)選民的數(shù)據(jù)并利用他們的偏見來操縱個(gè)體選民。雖然科幻驚悚片中的末日伴隨著大火和濃煙，但在現(xiàn)實(shí)中，我們可能只會(huì)面對一個(gè)由鼠標(biāo)點(diǎn)擊帶來的乏味末日。

1.2.3 總黃酮含量的測定

采用三氯化鋁法測定總黃酮的含量［15］。取1 mL提取液，加入0.3 mL 5%亞硝酸鈉溶液搖勻，靜置5 min后加入0.3 mL 10%三氯化鋁溶液，靜置5 min后再加入2.0 mL 10%氫氧化鈉溶液，定容至10 mL，在510 nm 波長處測定反應(yīng)液的吸光度值?？傸S酮含量以蘆丁當(dāng)量表示（mg/g）。

1.2.4 DPPH 自由基清除能力測定

參考Brand-Williams等方法［16-17］。取 2 mL提取液及2.0 mL 20 mmol/L的DPPH溶液，搖勻后置于暗處化學(xué)反應(yīng)30 min，于517 nm測定吸光值。按照下列公式計(jì)算DPPH自由基清除能力：

DPPH自由基清除率=［1-（A樣品吸光值-A空白吸光值）/A對照吸光值］×100%

1.2.5 鐵還原能力測定（FRAP）

參考Benzie等方法［18］。10 mmol/L TPTZ溶液、20 mmol/L FeCl3·6H2O 溶液和 0.3 mol/L（pH3.6）的醋酸緩沖溶液按照體積比1：1：10的比例混合得到FRAP工作液。取提取液0.1 mL，加入2.4 mL FRAP工作液，混勻，在37 ℃水浴10 min，于593 nm測定吸光值。鐵還原能力以Trolox當(dāng)量表示（mg TE/g）。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 不同溶劑提取對花椒籽總多酚含量的影響

花椒籽中總多酚的含量受提取溶劑的影響，存在較大的差異。由圖1可知，用90%的乙醇提取時(shí)，花椒籽中總多酚含量最高，達(dá)到138.84 mg/g；用蒸餾水提取時(shí)總多酚含量為72.83 mg/g，顯著低于不同濃度的乙醇和甲醇提?。╬＜0.05）。不同濃度甲醇和乙醇提取時(shí)，總多酚含量呈現(xiàn)相同的趨勢，即隨著提取濃度的增大而增加；相同濃度的甲醇和乙醇提取時(shí)，乙醇提取效果明顯。

圖1 不同溶劑提取的花椒籽總多酚含量Fig.1 Total polyphenol content extracted with different solvents

2.2 不同溶劑提取對花椒籽總黃酮含量的影響

不同溶劑提取對花椒籽中總黃酮含量的影響如圖2所示。

圖2 不同溶劑提取的花椒籽總黃酮含量Fig.2 Total flavonoids content extracted with different solvents

用蒸餾水提取的總黃酮含量為57.56 mg/g，顯著高于其他溶劑提取時(shí)的含量（p＜0.05）；以甲醇為提取溶劑，濃度在50%～70%時(shí)的總黃酮含量顯著高于濃度為30%和90%的甲醇提?。╬＜0.05）；以乙醇為提取溶劑，濃度30%～50%時(shí)提取的總黃酮含量顯著高于70%～90%的乙醇提?。╬＜0.05）。由此表明，花椒籽中總黃酮在提取時(shí)受提取溶劑和濃度的影響明顯。

2.3 不同溶劑提取對花椒籽DPPH自由基清除率的影響

由圖3可知，不同溶劑提取的花椒籽DPPH自由基清除率在75.20%～91.34%范圍內(nèi)，不同溶劑對花椒籽DPPH自由基清除率的影響差異不大。其中90%甲醇和90%乙醇提取的花椒籽DPPH自由基的清除率最高，分別為89.40%和91.34%；30%甲醇提取時(shí)DPPH自由基的清除率為75.20%，顯著低于其他溶劑和蒸餾水提取（p＜0.05）。

圖3 不同提取物清除DPPH自由基的能力Fig.3 DPPH radical scavenging capacity of different solvent extracts

2.4 不同溶劑提取對花椒籽FRAP的影響

由圖4可知，不同提取溶劑對花椒籽FRAP的影響差異較大，其中不同濃度甲醇提取液的FRAP顯著低于不同濃度乙醇提取液的FRAP和蒸餾水提取的FRAP（p＜0.05）。不同濃度甲醇溶液提取的花椒籽FRAP間無顯著性差異，不同濃度乙醇溶液提取的花椒籽FRAP中，以50%乙醇提取的FRAP顯著高于其他濃度的乙醇提取。因此，提取溶劑對花椒籽的FRAP影響更為顯著，選擇適宜的提取溶劑對花椒籽FRAP更加明顯。

圖4 不同提取物鐵還原能力（FRAP）Fig.4 Ferric ion reducing antioxidant power (FRAP) of different solvent extracts

2.5 不同溶劑提取的活性物質(zhì)與抗氧化活性的相關(guān)性分析

為進(jìn)一步明確不同溶劑花椒籽提取物中總多酚和總黃酮的含量與抗氧化活性的關(guān)系，對不同溶劑提取物中總黃酮、總多酚含量與DPPH自由基清除率和FRAP進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果如表1所示?；ń纷巡煌軇┨崛∥锏目偠喾雍颗c總黃酮含量呈負(fù)相關(guān)性，且差異極顯著（p＜0.01）；總多酚含量與DPPH自由基清除率顯著性相關(guān)（p＜0.05）；總黃酮含量與FRAP顯著性相關(guān)，且差異極顯著（p＜0.01）；而總多酚含量與 FRAP、總黃酮含量與DPPH自由基清除率間的相關(guān)性均較低。

表1 不同溶劑提取的活性物質(zhì)與抗氧化活性的相關(guān)性分析Tab.1 Correlation analysis of antioxidant activity with activity compounds extracted with different solvents

3 討論與結(jié)論

花椒籽中活性成分和抗氧化活性受到提取溶劑的影響差異顯著。其中，用90%乙醇提取的花椒籽總多酚含量最高，用蒸餾水提取的總黃酮含量最高，且總多酚和總黃酮含量呈負(fù)相關(guān)，差異極顯著。對于抗氧化活性而言，DPPH自由基清除率在用90%甲醇和90%乙醇提取時(shí)最高，與總多酚含量顯著性相關(guān)；而FRAP在用50%乙醇提取時(shí)活性達(dá)到最大值，且與總黃酮含量相關(guān)性極顯著。

通過本研究發(fā)現(xiàn)，花椒籽中總多酚含量與提取溶劑極性大小密切相關(guān)，極性較小的溶劑更利于花椒籽總多酚的提取，同時(shí)由于花椒籽中多酚種類的不同，其在不同溶劑中的溶解性亦有較大的差異。而總黃酮的含量則在用蒸餾水提取時(shí)含量達(dá)到最大值，說明黃酮以水溶性成分居多。王桂林等研究了超聲輔助不同溶劑（70%甲醇、70%乙醇、70%丙酮和水）提取金銀花中的總多酚，發(fā)現(xiàn)金銀花中多酚以脂溶性為主，即提取溶劑極性小，總多酚含量越高，與本研究的結(jié)論一致［19］。趙玉紅等對不同溶劑提取的“魯赫”刺薔薇葉中總多酚和總黃酮含量進(jìn)行測定，結(jié)果表明60%乙醇提取的總多酚和總黃酮含量達(dá)到最高，根據(jù)“相似相溶”原理，說明乙醇水溶液對樣品中的分類化合物溶解性較好［20］。孟憲華等用70%乙醇對青花椒中的分類化合物進(jìn)行提取，并利用柱色譜和高效液相色譜等分離技術(shù)和核磁共振（NMR）、高分辨質(zhì)譜（HR-ESI-MS）等結(jié)構(gòu)鑒定技術(shù)對所提取的酚類化合物進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)12個(gè)多酚糖苷類化合物，其中包含2個(gè)新結(jié)構(gòu)化合物［21］。李杰等通過不同濃度乙醇對花椒黃酮進(jìn)行提取，發(fā)現(xiàn)在乙醇濃度為40%～60%時(shí)，總黃酮含量隨著乙醇濃度的增大而增加；當(dāng)乙醇濃度大于60%時(shí)，花椒總黃酮含量隨乙醇濃度的增大而逐漸降低［22］。通過相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，不同溶劑提取的花椒籽中總多酚和總黃酮含量呈負(fù)相關(guān)（p＜0.01），這主要是由于花椒籽中多酚和黃酮在不同提取溶劑中的溶解性不同導(dǎo)致，同時(shí)，花椒籽中的花椒籽油含量較高，在提取過程中，花椒籽油可能會(huì)對提取溶劑的極性產(chǎn)生一定影響，從而導(dǎo)致多酚和黃酮含量的差異。因此，在對于花椒籽中活性成分的提取過程中，要根據(jù)所提取的成分選擇適宜的溶劑和濃度。

花椒籽中不同溶劑提取的活性物質(zhì)的DPPH自由基清除率在用90%甲醇和90%乙醇提取時(shí)最高，且與總多酚含量顯著性相關(guān)；而FRAP在用50%乙醇提取時(shí)活性達(dá)到最大值，且與總黃酮含量相關(guān)性極顯著。這可能是由于不同溶劑和不同濃度的提取物中多酚和黃酮的種類和含量存在較大差異，不同活性成分間存在相互協(xié)同或拮抗的作用，從而導(dǎo)致提取物具有不同的抗氧化能力。陳靜等采用蒸餾水、50%乙醇和無水乙醇為溶劑，從青、紅花椒中提取到6種提取物，發(fā)現(xiàn)不同的花椒提取物均具有較強(qiáng)的抗氧化能力，且呈現(xiàn)出不同程度的量效關(guān)系［23］。徐一鳴等通過對漢源花椒黃酮的提取和抗氧化活性研究，發(fā)現(xiàn)漢源花椒總黃酮提取物具有較強(qiáng)的DPPH自由基清除能力和羥自由基的清除能力，同時(shí)具備一定的還原力與總抗氧化能力［24-25］。

綜上所述，本文通過不同溶劑對花椒籽中活性物質(zhì)總多酚和總黃酮進(jìn)行提取，并分析了活性物質(zhì)的抗氧化能力。研究結(jié)果表明，花椒籽中的總多酚和總黃酮含量相對較高，且具有較強(qiáng)的抗氧化活性，可以作為天然的抗氧化劑。同時(shí)，不同溶劑對花椒籽中的活性成分含量影響差異顯著，在提取時(shí)應(yīng)根據(jù)所需要的目標(biāo)化合物選擇適宜的溶劑。