宋彥顯,閔玉濤,陳 靜
(鄭州工程技術(shù)學(xué)院,鄭州 450044)
花葉滇苦菜(Sonchus asper (L.) Hill)又名續(xù)斷菊,苦馬菜,屬被子植物門,雙子葉植物綱,桔梗目,菊科,苦苣菜屬,在我國(guó)被列為一般入侵植物,花葉滇苦菜生長(zhǎng)繁殖能力強(qiáng),在我國(guó)分布廣,資源豐富,是深受歡迎的野生蔬菜之一[1]。花葉滇苦菜營(yíng)養(yǎng)豐富,且具有多種生物活性和藥效。Kamble Sanghmitra S.等[2]研究發(fā)現(xiàn)花葉滇苦菜正己烷提取物具有較好的抗貧血效果。Rahmat Ali Khan,PhD[3]研究發(fā)現(xiàn)花葉滇苦菜提取物可以顯著減輕糖尿病大鼠癥狀,具有降糖活性潛質(zhì)。Mushtaq Muhammad Naveed 等[4]研究發(fā)現(xiàn)花葉滇苦菜水-甲醇提取物有顯著的抗高血壓活性,可以開發(fā)植物降壓藥。陳睿等[5]試驗(yàn)結(jié)果表明,花葉滇苦菜總黃酮提取液乙酸乙酯萃取物對(duì)金黃色葡萄球菌具有一定的抑制作用。
苦苣菜屬植物含有大量的黃酮類物質(zhì),劉麗敏等[6]研究微波輔助提取苦苣總黃酮得率23.8 mg/g。劉婧等[7]采用超聲波破碎法提取長(zhǎng)裂苦苣菜總黃酮提取率可達(dá)28.57 mg/g。陳睿等采用微波輻射預(yù)處理提取花葉滇苦菜總黃酮提取率地上部分38.328 mg/g和地下部分7.232 mg/g。近年來(lái),研究發(fā)現(xiàn)苦苣菜屬黃酮類物質(zhì),具有抗氧化活性及清除自由基的能力,抗抗?jié)兒蜐冃越Y(jié)腸炎、抗衰老的功效[8-10]。但目前,花葉滇苦菜黃酮抗氧化活性的研究國(guó)內(nèi)尚未見報(bào)道。
本文以花葉滇苦菜為試驗(yàn)原材料,用乙醇提取黃酮,經(jīng)乙酸乙酯萃取進(jìn)行初步純化,采用DPPH自由基清除法測(cè)定其抗氧化活性,為花葉滇苦菜資源的綜合利用和天然抗氧化劑的開發(fā)提供參考和理論支撐。
花葉滇苦菜,采自鄭州市賈魯河附近。
蘆?。?biāo)準(zhǔn)品,南京奧多福尼生物科技有限公司);1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)(分析純,合肥巴斯夫生物科技有限公司);乙酸乙酯(分析純,天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司);亞硝酸鈉(分析純,天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司);硝酸鋁(分析純,南京化學(xué)試劑股份有限公司);其余試劑均為分析純。
UV-1800PC DS2型紫外可見分光光度計(jì)(上海美譜達(dá)儀器有限公司);DZF-6050真空干燥箱(上海山連實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司);旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司);恒溫水浴鍋(金壇市正基儀器有限公司)。
1.3.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備
準(zhǔn)確稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品10 mg,用60%的乙醇溶解后,定容至50 mL的容量瓶中,即得到0.2 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。分別吸取0、2.00 mL、3.00 mL、4.00 mL、5.00 mL、6.00 mL 于 7個(gè) 15 mL的刻度試管中,先加入5%的亞硝酸鈉溶液0.4 mL,搖勻后靜置6 min。再加入10%的硝酸鋁溶液8.0 mL,搖勻后靜置6 min。最后加入4%的氫氧化鈉溶液8.0 mL,搖勻后,加60%的乙醇溶液定容至8 mL,靜置10 min。在510 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度值,以蘆丁的濃度為橫坐標(biāo),吸光度(Abs)為縱坐標(biāo),制備標(biāo)準(zhǔn)曲線
1.3.2 花葉滇苦菜黃酮粗提取物的制備
花葉滇苦菜洗凈后,晾干烘烤,粉碎過(guò)40目篩,得花葉滇苦菜的粉末。稱取20 g的花葉滇苦菜粉末,用200 mL的80%乙醇,在溫度為80 ℃的條件下回流提取3次,真空泵抽濾2 h,合并濾液,用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮后,得花葉滇苦菜黃酮乙醇粗提物,測(cè)定得率。
1.3.3 花葉滇苦菜黃酮提取物的制備
將花葉滇苦菜黃酮乙醇粗提物加入乙酸乙酯進(jìn)行萃取,萃取6次以上,合并上清液,50~60 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸發(fā)濃縮,調(diào)pH值在3~4之間,在用石油醚萃取除色素,蒸發(fā)濃縮后即得花葉滇苦菜黃酮提取物,計(jì)算得率。
1.3.4 花葉滇苦菜的黃酮提取率的計(jì)算
分別吸取2 mL的萃取前和萃取后的花葉滇苦菜提取物,按照1.3.1方法在510 nm下測(cè)定吸光度值,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和回歸方程,計(jì)算萃取前和萃取后花葉滇苦菜的黃酮含量,按照下式分別計(jì)算提取率。
花葉滇苦菜黃酮提取率(mg/g)=CVn/M
式中 C——樣液經(jīng)吸光度算出的原提取液中總黃酮的質(zhì)量濃度,mg/mL;
V——提取液總體積,mL;
n——稀釋倍數(shù);
M——稱取的花葉滇苦菜質(zhì)量,g。
1.3.5 花葉滇苦菜的黃酮提取液對(duì)DPPH自由基清除試驗(yàn)
采用馬慶一等[11]的研究方法,原花葉滇苦菜黃酮提取液濃度為5.5 mg/mL,分別配制成0.5、1.5、2.5、3.5、4.5、5.5 mg/mL 5 種濃度,每個(gè)濃度配制5 mL,配制如表1。
取三支試管并依次編號(hào),于試管①中加入2 mL的無(wú)水乙醇,和2 mL一定濃度的花葉滇苦菜黃酮提取液,于試管②中加入2 mL的一定濃度花葉滇苦菜黃酮提取溶液和2 mL DPPH溶液,于試管③中加入2 mL的DPPH溶液和2 mL的無(wú)水乙醇,分別搖勻后置于25 ℃水浴中保持30 min,以試管①做為調(diào)零管,用分光光度計(jì)于517 nm下測(cè)定試管②和試管③的吸光度值,分別記為A樣品和A空白。
抑制率計(jì)算公式:
抑制率=(A空白-A樣品)/A空白×100%
1.3.6 花葉滇苦菜黃酮提取物、BHT、VC對(duì)DPPH自由基清除能力的比較
BHT母液配制:稱取275 mgBHT,用乙醇溶解后定容至50 mL容量瓶中,配制成濃度為5.5 mg/mL的BHT溶液。
Vc母液配制:稱取275 mg的維生素C,用乙醇溶解后,定容至50 mL的容量瓶中,配制成濃度為5.5 mg/mL的維生素C溶液。
將 BHT 和 Vc分別稀釋成 0.5、1.5、2.5、3.5、4.5、5.5mg/mL 6種濃度如表2所示。按照1.2.5的方法檢測(cè)其清除DPPH自由基的能力。
表2 BHT和Vc溶液稀釋Table 2 Dilution table of BHT and Vc
在分光光度計(jì)波長(zhǎng)為510 nm處測(cè)定其吸光度以蘆丁的濃度為橫坐標(biāo),吸光度(Abs)為縱坐標(biāo),繪制得到標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。
圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Rutin standard curve
由圖1可知,回歸方程y=6.366 9x-0.003 1,回歸系數(shù)R2=0.998 5,在蘆丁濃度0~0.15 mg/mL范圍內(nèi),具有很好的線性關(guān)系。
采用回流-乙醇提取法制備黃酮提取率為11.5%,石油醚脫色、乙酸乙酯萃取后黃酮提取率4.8%,萃取后的黃酮類化合物有所損失,但純度更高。第一次提取過(guò)程中使用的95%乙醇,后換成80%的乙醇,提取結(jié)束后,用乙酸乙酯進(jìn)行萃取,萃取后測(cè)定其吸光度值,發(fā)現(xiàn)花葉滇苦菜黃酮提取液顏色對(duì)試驗(yàn)結(jié)果干擾較大,即用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀把乙酸乙酯蒸發(fā)后,用石油醚進(jìn)行除色處理,除色處理后再次萃取,然后再吸光度值測(cè)定,減少誤差。萃取前的黃酮類化合物得率為,萃取后黃酮類化合物提取率為。
植物源黃酮的提取方法多樣,為使得黃酮提取率更高,本文采取回流-乙醇提取法。這是一種比較溫和的提取方法,能夠完整的使黃酮溶解,并能提高它的得率和保護(hù)它的生物活性。為進(jìn)一步測(cè)定黃酮得率和研究抗氧化活性奠定了良好的基礎(chǔ)。
將花葉滇苦菜黃酮提取物配制成6個(gè)濃度,分別測(cè)定不同濃度下對(duì)DPPH自由基的清除能力,結(jié)果如圖2所示。
圖2 花葉滇苦菜黃酮提取液清除DPPH自由基的能力Fig.2 DPPH radical scavenging ability of flavone extract from Sonchus asper
DPPH自由基即二苯基苦酰肼基自由基,是一種穩(wěn)定的氮中心自由基,常用于體外抗氧化活性的評(píng)價(jià)[12]。從圖2可知,不同濃度的提取物都具有清除自由基的能力,對(duì)DPPH自由基清除能力隨著花葉滇苦菜黃酮提取液濃度增大而增強(qiáng),且呈上升趨勢(shì),當(dāng)樣品濃度達(dá)到1.5 mg/mL時(shí),對(duì)DPPH自由基清除能力明顯增強(qiáng),并開始逐漸趨于平穩(wěn),測(cè)定結(jié)果顯示,當(dāng)濃度為5.5 mg/mL時(shí),樣品對(duì)DPPH自由基的抑制率高達(dá)94.12%,試驗(yàn)結(jié)果表明,花葉滇苦菜黃酮類化合物具有很強(qiáng)的抗氧化能力。
將花葉滇苦菜黃酮提取物、BHT、VC分別配制成6個(gè)相同濃度,分別測(cè)定不同濃度下對(duì)DPPH自由基的清除能力如圖3所示。
圖3 花葉滇苦菜黃酮提取液、BHT、Vc對(duì)DPPH自由基清除能力的比較Fig.3 Comparison of DPPH free radical scavenging ability of flavone extract of Sonchus asper,BHT and Vc
BHT是一種人工合成抗氧化劑,且是一種油溶性抗氧化劑,這里為了做單因素對(duì)照試驗(yàn),所以溶劑選用了無(wú)水乙醇。從結(jié)果可以看出,抗氧化活性不如花葉滇苦菜黃酮類化合物高。在5.5 mg/mL時(shí),BHT對(duì)DPPH自由基的抑制率達(dá)80.10%。
Vc是具有強(qiáng)抗氧化活性的抗氧化劑,常作抗氧化研究的對(duì)照品[13]。從圖3可以看出,Vc的抗氧化活性很強(qiáng),當(dāng)Vc溶液的濃度達(dá)到0.5 mg/mL時(shí),對(duì)DPPH自由基抑制率高達(dá)到97.05%,隨著Vc的濃度增大,對(duì)DPPH自由基清除能力明顯增強(qiáng),在5.5 mg/mL時(shí)Vc對(duì)DPPH自由基的抑制率高達(dá)98.75%。說(shuō)明Vc的抗氧化活性很強(qiáng)。
比較可知,花葉滇苦菜提取液黃酮的濃度與DPPH自由基清除能力呈正相關(guān)。經(jīng)過(guò)不同濃度梯度稀釋,花葉滇苦菜黃酮提取物,BHT,Vc對(duì)DPPH自由基有不同的清除能力。花葉滇苦菜黃酮提取物對(duì)DPPH自由基的清除能力非常強(qiáng),這也證明,花葉滇苦菜中含有大量的黃酮類化合物,且濃度越高,抑制率越高,若進(jìn)一步純化,提高其純度,其對(duì)DPPH自由基的清除能力有望超越Vc。
(1)采用乙醇提取法,80%乙醇,80 ℃抽提,乙酸乙酯萃取,萃取前的黃酮類化合物得率為11.5%,萃取后黃酮類化合物提取率為4.8%。試驗(yàn)結(jié)果表示,萃取后的黃酮類化合物有所損失,但純度更高。
(2)花葉滇苦菜中的黃酮提取液濃度為5.5 mg/mL時(shí),對(duì)DPPH自由基抑制率達(dá)94.12%,隨著花葉滇苦菜黃酮提取液的濃度越高,抗氧化活性也越強(qiáng)。
(3)花葉滇苦菜中的黃酮提取液、BHT和Vc在5.5 mg/mL時(shí),對(duì)DPPH自由基的抑制率分別為94.12%、80.10%和 98.75%,相同濃度下花葉滇苦菜黃酮提取液對(duì)DPPH自由基的抑制率遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于BHT,接近Vc。花葉滇苦菜黃酮有非常強(qiáng)的抗氧化作用,可為花葉滇苦菜資源的綜合利用和天然抗氧化劑的開發(fā)提供參考和理論支撐。
黃酮類化合物安全無(wú)毒,又因其具有較強(qiáng)的抗氧化活性及藥理活性,近年來(lái)黃酮類化合物在醫(yī)療、食品、化妝品等領(lǐng)域逐漸得到廣泛的應(yīng)用?;ㄈ~滇苦菜中有大量黃酮類物質(zhì),經(jīng)本次研究發(fā)現(xiàn)花葉滇苦菜黃酮有很好的抗氧化性能。后續(xù)可以通過(guò)大孔樹脂、聚酰胺及葡聚糖凝膠柱層析等對(duì)花葉滇苦菜黃酮進(jìn)一步純化,研究純化后黃酮的抗氧化活性。還可以將純化后的黃酮添加到食品及護(hù)膚品中,進(jìn)行應(yīng)用研究,為花葉滇苦菜黃酮的開發(fā)利用提供進(jìn)一步的理論依據(jù)。