黃明才，韋國蘭，龍杰鳳，王 翔，陸勤猛

（凱里學(xué)院，貴州 凱里 556011）

魚腥草為三白草科植物蕺菜Houttuynia cordataThunb.的新鮮全草或干燥地上部分，始載于《名醫(yī)別錄》，是一種藥食兩用的植物.《中國藥典》中記載魚腥草具有清熱解毒、消癰排膿、利尿通淋等功效，臨床上用于治療肺癰吐膿、痰熱喘咳、熱痢、熱淋、癰腫瘡毒等疾?。?］；在食用上常以炒、涼拌等方式見于云貴川幾大省份人民的餐桌上.魚腥草主要含黃酮、揮發(fā)油、酚酸、萜類、生物堿等成分［2-3］，現(xiàn)代藥理研究表明魚腥草中黃酮類化合物具有抗腫瘤、抗病毒、抗氧化、抗誘變和清除自由基等功能［4］.本試驗以魚腥草為原料，采用超聲波輔助提取法對魚腥草中總黃酮提取工藝進行優(yōu)化，以期為魚腥草的進一步研究提供技術(shù)依據(jù).

1 試驗材料、試劑、儀器與方法

1.1 試驗材料與試劑

樣品魚腥草購于凱里市中藥材市場，去雜質(zhì)清洗后曬干，置于烘箱中60℃干燥至恒重，再放入高速萬能粉碎機中進行粉碎，過40 目篩，得到40 目樣品粉末放入密封袋避光保存，待用.所用試劑為蘆丁、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、甲醇、無水乙醇、乙酸乙酯等.

1.2 試驗儀器

本試驗所用儀器有電熱鼓風(fēng)干燥箱（WGLL-230BE，天津市泰斯特儀器有限公司），高速萬能粉碎機（FW400A，北京科偉永興儀器有限公司），超聲波清洗機（JP-040，深圳市潔盟清洗設(shè)備公司），低速離心機（TD5M，長沙湘智離心機儀器有限公司），紫外分光光度計（UV-2550，島津企業(yè)管理中國有限公司），電子天平（AR224CN，奧豪斯儀器（常州）有限公司）等.

1.3 試驗方法

1.3.1薄層色譜鑒別

取魚腥草粉末0.4 g放入50 mL 的小燒杯中，然后加入10 mL 甲醇封口超聲5 min 后放至室溫過濾，濾液保存作為供試品.

精確稱量8.0 mg蘆丁粉末，放入錐形瓶，然后加入2.0 mL甲醇得到對照品溶液（4 mg/mL）.

硅膠G 薄板層110 ℃下活化120 min，用毛細(xì)管蘸取樣品溶液點樣，在G 薄板層取5 個點分別在1、3、5 號點上點入供試品，在2、4 號點上點入對照品，然后放入盛有展開劑乙酸乙酯∶甲酸∶水（8∶1∶1）的展缸中，10～30 min后取出，放置烘箱烘干，然后在薄層板噴上三氯化鋁溶液，放入暗箱三用紫外線分析儀在紫外燈365 nm 下檢視［5］.結(jié)果可見對照品與供試品在相應(yīng)的位置下顯示顏色相同的綠色熒光斑點，證明魚腥草中含有黃酮成分.

1.3.2測定波長的選擇

精密稱取1.2 mg 的蘆丁對照品，加入100 mL 的容量瓶中，加入乙醇稀釋至刻度，即配制濃度為0.012 mg/mL的蘆丁對照品，在紫外-可見光光譜儀200～800 nm波長下掃描，結(jié)果在512 nm處有最大吸收峰，因此在測定魚腥草總黃酮含量時，在此波長處測定.

1.3.3標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作參照文獻(xiàn)［6］：準(zhǔn)確稱取0.126 g 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品于150 mL 燒杯中，并用100 mL 的70%乙醇溶液溶解后轉(zhuǎn)移至1000 mL 容量瓶中，并定容至刻度，搖勻靜置.分別吸取該標(biāo)準(zhǔn)溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL 于5 個25 mL 比色管中，再分別加入70%乙醇溶液至5.0 mL，混合均勻，再加入5%亞硝酸鈉溶液0.5 mL，混合均勻，靜置6 min，加入0.5 mL 10%硝酸鋁溶液，混合均勻，放置6 min，再加入4 mL 4%氫氧化鈉溶液，混合均勻.放置15 min，并于510 nm 波長處測定其吸光度.以蘆丁濃度（X）為橫坐標(biāo)，吸光度（Y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線.其回歸方程為Y=11.701X-0.0057（R2=0.9996）.由此可見，此方程線性良好.

1.3.4魚腥草總黃酮得率的結(jié)果計算

魚腥草總黃酮得率通過以下公式計算：總黃酮得率（%）=（C×V×稀釋倍數(shù)）×100/M，式中C為標(biāo)準(zhǔn)樣液濃度（mg/mL），V為樣品體積（mL），M為稱取樣品質(zhì)量（mg）

1.3.5魚腥草總黃酮提取的單因素考察

1.3.5.1料液比對魚腥草總黃酮提取的影響

精密稱取2.0 g魚腥草粉末5份，放入相應(yīng)的5個250 mL圓底燒瓶中，以40%乙醇溶液為提取劑，以按1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25為料液比，用保鮮膜封口，在溫度為40 ℃條件下超聲提取15 min 后放置室溫，抽濾，濾液轉(zhuǎn)入100 mL容量瓶定容至刻度，根據(jù)1.3.3測定其吸光度.

1.3.5.2乙醇濃度對魚腥草總黃酮提取的影響

精密稱取2.0 g 魚腥草粉末5 份，放入相應(yīng)的5 個250 mL 圓底燒瓶中，按固定料液比為1∶10比例分別加入50%、60%、70%、80%、90%濃度的乙醇，用保鮮膜封口，在溫度為40 ℃條件下超聲提取15 min后放置室溫，抽濾，濾液轉(zhuǎn)入100 mL容量瓶定容至刻度.根據(jù)1.3.3測定其吸光度.

1.3.5.3提取時間對魚腥草總黃酮提取的影響

精密稱取2.0 g魚腥草粉末5份，放入相應(yīng)的5個250 mL圓底燒瓶中，按固定料液比為1∶10加入70%的乙醇，用保鮮膜封口，在溫度為40 ℃條件下超聲提取時間依次為15、30、45、60、75 min后，放置室溫，抽濾，濾液轉(zhuǎn)入100 mL容量瓶定容至刻度，根據(jù)1.3.3測定其吸光度.

1.3.5.4提取溫度對魚腥草總黃酮提取的影響

精密稱取2.0g魚腥草粉末5份，放入相應(yīng)的5個250 mL圓底燒瓶中，按固定料液比為1∶10加入70%的乙醇，設(shè)置超聲溫度分別為40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃，超聲提取30 min 后，放置室溫，抽濾，濾液轉(zhuǎn)入100 mL容量瓶定容至刻度，根據(jù)1.3.3測定其吸光度.

1.3.6正交試驗設(shè)計

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，采用L9（34）正交實驗優(yōu)化提取工藝參數(shù)，因素水平表見表1.

表1 正交試驗因素水平表

2 結(jié)果與分析

2.1 因素試驗結(jié)果

2.1.1料液比對魚腥草總黃酮提取的影響

根據(jù)圖1 可知，當(dāng)料液比為1∶5 至1∶10 時，提取所獲的總黃酮得率逐漸增大，當(dāng)料液比為1：10時總黃酮得率最大，隨后慢慢降低，故正交試驗設(shè)計中選取提取料液比為1∶5～1∶15.

圖1 料液比不同對總黃酮提取的影響

2.1.2乙醇濃度對魚腥草總黃酮提取的影響

根據(jù)圖2 可知，當(dāng)乙醇濃度為50%～70%時，提取所獲的總黃酮得率逐漸增大，當(dāng)料液比為70%時總黃酮得率最大，隨后慢慢降低，故正交試驗設(shè)計中選取提取乙醇濃度為60%～80%.

圖2 不同乙醇濃度對總黃酮提取的影響

2.1.3提取時間對魚腥草總黃酮提取的影響

根據(jù)圖3 可知，當(dāng)超聲提取時間為15～30 min 時，提取所獲的總黃酮得率逐漸增大，當(dāng)超聲提取時間達(dá)30～45 min時，總黃酮得率沒有變化，這時得率最大，45 min后總黃酮得率逐漸降低，故正交試驗設(shè)計中選取提取時間為15～45 min.

圖3 提取時間不同對總黃酮提取的影響

2.1.4提取溫度對魚腥草總黃酮提取的影響

根據(jù)圖4 可知，當(dāng)提取溫度在40℃～50℃時，提取所獲的總黃酮得率逐漸增大，當(dāng)提取溫度達(dá)50℃時，這時總黃酮得率最大，50℃后總黃酮得率逐漸降低.故正交試驗設(shè)計中選取提取時間為40℃～60℃.

圖4 提取溫度不同對總黃酮提取的影響

2.2 魚腥草總黃酮提取工藝的優(yōu)化

在單因素試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上設(shè)計正交試驗方案，選取各因素中魚腥草總黃酮得率較高3 個水平進行正交試驗，正交實驗結(jié)果見表2.

表2 正交試驗方案及結(jié)果

由表2中極差分析可知，4個因素對魚腥草總黃酮提取效果影響的主次順序為A（料液比）＞C（提取時間）＞D（提取溫度）＞B（乙醇濃度），最佳工藝為A2B2C3D3，即料液比為1∶10、乙醇濃度為70%、提取時間為45 min、提取溫度60℃.故對A2B2C3D3進行驗證實驗，驗證實驗結(jié)果總黃酮得率為2.53%.

3 結(jié)論

本研究在考察單因素料液比、乙醇濃度、提取時間、提取溫度的基礎(chǔ)上，采用正交設(shè)計對魚腥草總黃酮提取工藝進行優(yōu)化，得到魚腥草總黃酮的最佳工藝為A2B2C3D3，即料液比為1∶10、乙醇濃度為70%、提取時間為45 min、提取溫度60℃，此方法便捷、快速、低成本，可為魚腥草的開發(fā)提供一定的參考依據(jù).