任 鵬 姬 偉 曹海偉 邱 奇

(1.中國石油長慶油田分公司油氣工藝研究院；2.中國石油長慶油田分公司第九采油廠)

0 引 言

微生物在油泥污染修復(fù)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，是生物修復(fù)的主力[1-2]；某些特定的微生物可產(chǎn)生表面活性劑，可減小水溶液界面張力，使油相在水相中分散，增加烴類化合物在水中溶解度，從而使烴類污染物被快速運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞內(nèi)進(jìn)行降解[3-4]。微生物所產(chǎn)生的表面活性劑有多種，如糖脂、脂肽、多糖-脂類復(fù)合物、磷脂、脂肪酸和中性脂[5-6]，與化學(xué)合成的表面活性劑相比，生物表面活性劑具有低毒性，易生物降解和極端環(huán)境的高選擇性等優(yōu)良特性[7-8]。

本研究以菌株Da-6產(chǎn)生的表面活性劑(以下簡稱BH)為研究對象，分別與市售表面活性劑在臨界膠束濃度(CMC)、乳化性能、排油能力和洗脫效果等方面進(jìn)行對比實(shí)驗(yàn)，研究BH表面活性的影響因素，以期驗(yàn)證表面活性劑BH在提高微生物對石油降解能力的基礎(chǔ)上，可以保持對環(huán)境的低毒性，從而為油泥生物處理起到增效作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)菌株：從北部某油田某井場油泥中篩選出一株可以產(chǎn)生高效生物表面活性劑的菌株Da-6，經(jīng)項(xiàng)目組前期鑒定為黃單胞菌屬(Xanthomonassp.)。

油泥樣品：取自北部油田某采油井場油泥處理站處理后油泥尾渣，含油率為8%～10%，實(shí)驗(yàn)用油泥含油率實(shí)測值為8.25%。

實(shí)驗(yàn)儀器：SF-TGL-16M冷凍離心機(jī)(上海菲恰爾分析儀器有限公司)，GF254硅膠板100 mm×150 mm(煙臺維啟化工產(chǎn)品有限公司)，JK99c表面張力儀(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)，JT-OIL460紅外分光光度計(天津市精拓儀器科技有限公司)。

LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 10 g，去離子水1 000 mL，pH值7.0。

發(fā)酵培養(yǎng)基：原油3.0 g，NH4NO32.5 g，MgSO44.0 g，KH2PO44.0 g，NaCl 2.0 g，酵母膏0.5 g，K2HPO44.0 g，微量元素液5.0 g(ZnSO40.29 g，CaCl20.24 g，CuSO40.25 g，MgSO40.17 g)，去離子水1 000 mL，pH值7.0。

以上培養(yǎng)基均121℃高壓滅菌20 min。

表面活性劑：全面了解表面活性劑的種類、性質(zhì)、類別等情況，選取幾種表面活性劑，見表1。

表1 表面活性劑特性

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 發(fā)酵液制備

將斜面保藏的Da-6菌株活化，制成菌懸液后吸取0.1 L轉(zhuǎn)接至0.9 L發(fā)酵培養(yǎng)基中，35℃、160 r/min恒溫振蕩48 h，形成發(fā)酵液。

1.2.2 表面活性劑BH的提取與定性分析

取1 L發(fā)酵液于冷凍離心機(jī)中以6 000 r/min離心20 min后去除菌體，取上清液，滴加6 mol/L HCl調(diào)節(jié)pH值至2.0，4℃靜置過夜后，再以6 000 r/min離心20 min，靜置后收集沉淀物，用1 mol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)其pH值至中性。用二氯甲烷萃取3次，合并有機(jī)相于40℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，最后將產(chǎn)物在冷凍干燥機(jī)中進(jìn)行干燥，即得表面活性劑粗品。

用3 mL二氯甲烷將表面活性劑粗品溶解，點(diǎn)樣于硅膠板進(jìn)行TLC分析，再用氯仿、甲醇、水體積比為13∶5∶4的溶液展開，滴加不同顯色劑，觀察顯色結(jié)果。結(jié)果表明，溶液遇0.5%茚三酮顯色劑顯紅紫色，說明該表面活性劑為脂肽類表面活性劑。

1.2.3 表面活性劑性能研究

1)臨界膠束濃度(CMC)：將表面活性劑BH、鼠李糖脂、吐溫80和SDS分別配制成0，15，25，35，45，55，65 mg/L濃度，用1 mol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值為7.0，完全溶解后測定其表面張力，以表面活性劑溶液濃度為橫坐標(biāo)，以表面張力值為縱坐標(biāo)，作出臨界膠束濃度(CMC)曲線。出現(xiàn)拐點(diǎn)所對應(yīng)的橫坐標(biāo)即為表面活性劑的CMC。

2)乳化實(shí)驗(yàn)[9]：分別取5 mL濃度為100 mg/L的BH、鼠李糖脂、吐溫80和SDS于試管中，同時分別加入等體積的原油，充分振蕩、靜置。分別測定其不同時間(0，12，24，36，48，60，72 h)的乳化層高度，根據(jù)公式(1)計算乳化指數(shù)。

E=H乳/H總×100%

(1)

式中：E為乳化指數(shù)，%；H乳為乳化層的高度，cm；H總為液體總高度，cm。

3)排油能力實(shí)驗(yàn)[10]：分別配制不同濃度的BH、鼠李糖脂、吐溫80和SDS(0，25，50，75，100，125，150，175，200 mg/L)表面活性劑溶液，取直徑為90 mm的培養(yǎng)皿，在其中加入10 mL去離子水，之后在培養(yǎng)皿中央滴加200 μL原油，待原油以圓的形式擴(kuò)散至鋪滿水面的油膜后，加1滴表面活性劑溶液到油膜的中心，油膜以圓圈的形式向四周擴(kuò)散，測量不同濃度的表面活性劑溶液的排油圈直徑，圓圈直徑越大說明表面活性劑排油能力越強(qiáng)，即活性越高[11]。

4)洗脫實(shí)驗(yàn)：分別取20 mL的BH、鼠李糖脂、吐溫80和SDS溶液(濃度為臨界膠束濃度)于100 mL的錐形瓶中，向錐形瓶中分別加入5 g滅菌的油泥樣品，每2 h取一次樣，采用石油醚萃取-紅外分光光度法測定錐形瓶中石油含量，計算各表面活性劑對油泥的洗脫率。

1.2.4 不同因素對BH表面活性的影響

配制濃度為25 mg/L的BH溶液，將溶液分別置于不同溫度(10，20，40，60，80，100，120℃)條件下處理2 h，冷卻至室溫后測其表面張力。

在濃度為25 mg/L的BH溶液中加入NaCl，使其濃度分別為0%，4%，8%，12%，16%，20%，24%，28%，并測其表面張力。

用1 mol/L HCl溶液和1 mol/L NaOH溶液將25 mg/L的BH溶液分別調(diào)節(jié)成不同pH值(2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13)，并測其表面張力。

2 結(jié)果與分析

2.1 表面活性劑BH的TLC分析

依次在硅膠板上滴加不同顯色劑后，顯色反應(yīng)見圖1。

圖1 BH薄層層析顯色反應(yīng)

如圖1所示，在硅膠板上(數(shù)字1處)滴加苯酚-硫酸和溴百里香酚藍(lán)-氫氧化鈉后，無顏色反應(yīng)，滴加0.5%茚三酮后，出現(xiàn)一個紅紫色斑點(diǎn)(數(shù)字2處)，故初步判定所產(chǎn)生的表面活性劑是脂肽類物質(zhì)。

2.2 表面活性劑性能研究

2.2.1 CMC測定

陳露等[12]研究表明表面活性劑可使蒸餾水表面張力值降低。本研究將BH、鼠李糖脂、吐溫80和SDS稀釋成不同濃度后測定其表面張力，結(jié)果見圖2。

圖2 表面張力測定結(jié)果

由圖2可知，當(dāng)BH濃度增加到25 mg/L時，表面張力值最低，達(dá)到飽和值，因此可確定BH的CMC為25 mg/L，其表面張力穩(wěn)定在25.98 mN/m。鼠李糖脂的濃度為35 mg/L時，表面張力最低達(dá)到飽和值，為30.19 mN/m。在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，吐溫80和SDS的表面張力曲線一直處于下降趨勢，并未出現(xiàn)“拐點(diǎn)”，說明吐溫80和SDS的CMC大于65 mg/L。由此可知，BH在達(dá)到CMC所需表面活性劑濃度方面要遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于化學(xué)表面活性劑吐溫80和SDS，略優(yōu)于生物表面活性劑鼠李糖脂。

2.2.2 乳化性能測定

各表面活性劑在不同時間內(nèi)(0，12，24，36，48，60，72 h)乳化指數(shù)變化見圖3。

圖3 表面活性劑乳化實(shí)驗(yàn)測定結(jié)果

由圖3可知，乳化指數(shù)隨著時間增加而逐漸減小，并在某個時間處于平穩(wěn)狀態(tài)。BH在24 h時，乳化指數(shù)明顯下降至71.93%，72 h內(nèi)乳化指數(shù)一直保持在70%左右，乳化比較穩(wěn)定，乳化性能較好。鼠李糖脂在24 h時，乳化指數(shù)下降至69.64%，之后乳化指數(shù)保持在66%左右，而吐溫80、SDS隨著時間的增加，乳化指數(shù)分別保持在50%，46%左右。表明BH與其他3種表面活性劑相比，乳化穩(wěn)定性高，乳化性能好。

2.2.3 排油性能測定

各表面活性劑所產(chǎn)生排油圈的直徑見圖4。

圖4 表面活性劑排油圈直徑對比

據(jù)文獻(xiàn)[4]表明，表面活性劑排油性能可以用排油圈直徑大小來反映。由圖4可知，在不同濃度下，BH、鼠李糖脂、吐溫80和SDS排油圈直徑隨著濃度的增大而增大。在相同濃度下，4種表面活性劑的排油圈直徑大小為：BH>鼠李糖脂>吐溫80>SDS。如在濃度均為200 mg/L時，BH排油圈直徑為81.0 mm，鼠李糖脂為72.7 mm，吐溫80為64.3 mm，SDS為58.3 mm，說明菌株Da-6產(chǎn)生的表面活性劑BH具有良好的排油性能。

2.2.4 油泥增溶實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表面活性劑能夠使附著在油泥顆粒中的石油烴洗脫下來供微生物利用和轉(zhuǎn)化，間接提高微生物利用石油烴的效率，增強(qiáng)微生物降解石油能力。因此對4種表面活性劑BH、鼠李糖脂、吐溫80和SDS進(jìn)行增溶對比實(shí)驗(yàn)，其結(jié)果見圖5。

圖5 表面活性劑對原油增溶效果比較

由圖5可知，洗脫率隨著時間的增加不斷增大，基本在12 h達(dá)到穩(wěn)定，洗脫結(jié)束。4種表面活性劑洗脫效果比較：BH>鼠李糖脂>吐溫80>SDS。BH的增溶率在12 h達(dá)到最大洗脫率90.23%，而鼠李糖脂的洗脫率在12 h最大為86.42%，吐溫80的洗脫率在10 h達(dá)到最大，為75.80%，SDS在12 h為最大，洗脫率為72.84%，說明菌株Da-6自身產(chǎn)生的表面活性劑BH的增效作用明顯優(yōu)于其他3種表面活性劑，并且和化學(xué)表面活性劑相比，具有對環(huán)境無毒無污染的優(yōu)點(diǎn)，與文獻(xiàn)[13]得到的結(jié)果相同。這為BH用于后期油泥處理奠定了理論基礎(chǔ)。

2.2.5 不同因素對BH表面活性的影響

根據(jù)不同溫度、NaCl濃度及pH值對BH表面活性的影響，評價BH的穩(wěn)定性。結(jié)果見圖6、圖7、圖8。

圖6 溫度對BH表面活性的影響

圖7 NaCl濃度對BH表面活性的影響

圖8 pH值對BH表面活性的影響

由圖6可知，溫度在10～80℃范圍內(nèi)對BH的表面活性影響不大，BH在不同溫度處理2 h后，其表面張力一直保持在26 mN/m左右；當(dāng)溫度過高，BH表面張力上升。說明BH在10～80℃時具有良好的穩(wěn)定性，這為BH在低溫及高溫條件下的應(yīng)用提供了一定的理論依據(jù)。

由圖7可知，當(dāng)NaCl濃度為0～16%時，BH的表面張力沒有明顯變化，保持在26 mN/m左右；當(dāng)NaCl濃度高于16%，BH的表面活性受到限制，此時BH表面張力迅速上升。說明BH在NaCl濃度0～16%范圍內(nèi)具有良好的耐鹽性。

由圖8可知，當(dāng)4

3 結(jié) 論

1)本實(shí)驗(yàn)從菌株Da-6發(fā)酵液中提取生物表面活性劑粗品BH，經(jīng)TLC分析為脂肽類表面活性劑。

2)對BH性能進(jìn)行研究，CMC為25 mg/L；在72 h內(nèi)其乳化值保持在70%以上，乳化性能比較穩(wěn)定；排油圈直徑最大為81.0 mm；12 h內(nèi)達(dá)到最大洗脫率90.23%。經(jīng)對比研究，BH性能優(yōu)于鼠李糖脂、吐溫80和SDS。

3)BH在溫度10～80℃，NaCl濃度0～16%，pH值4～13，可以保持較高的表面活性，表面張力保持在26 mN/m左右，具有良好的穩(wěn)定性。