駱 航，孫興力，李華生，周振華，李玉婷

（永州職業(yè)技術(shù)學(xué)院醫(yī)學(xué)院，湖南 永州425100）

虎杖是一種天然藥物資源，其嫩葉可做蔬菜食用，嫩莖口感松脆爽口，性似竹筍，被稱之為虎杖筍，根煮熟可做冷飲，具有清涼解暑的功效，地下根及根莖亦是一種中藥材。虎杖含有兩類重要的化學(xué)成分，即白藜蘆醇和蒽醌［1］，特別是其中的白藜蘆醇在食品、醫(yī)藥和化工等領(lǐng)域都是重要中間原料，具有很高的應(yīng)用價值［2-4］。早些年對虎杖的開發(fā)應(yīng)用主要集中在某單一化學(xué)成分或化學(xué)部位上，對虎杖化學(xué)成分的綜合開發(fā)和利用研究較少，使得我國豐富的虎杖資源的工業(yè)價值未能得到充分發(fā)揮和體現(xiàn)。目前虎杖化學(xué)成分開發(fā)利用的難點主要是將不同成分類型的提取物進行分離和純化。

大孔吸附樹脂是一種廣泛用于中草藥化學(xué)成分分離和富集的高分子材料，因其具有良好的穩(wěn)定性和選擇性，分離速度快，吸附容量大，操作方便，可再生使用等諸多優(yōu)點［5］，迅速成為柱層析中常用的分離介質(zhì)。為充分保留虎杖中的活性成分，提高虎杖提取物的附加值，采用大孔樹脂分離純化虎杖提取物中的白藜蘆醇和蒽醌類化合物具有很強的現(xiàn)實需求。但是大孔樹脂類型繁多，尚需對不同類型大孔樹脂的各項參數(shù)和應(yīng)用條件進行考察，才能尋找出最佳的分離純化工藝。本實驗在對虎杖中白藜蘆醇和蒽醌類化合物提取工藝確定的基礎(chǔ)上，以白藜蘆醇、總蒽醌的含量為考察指標(biāo)，對兩大活性成分的大孔樹脂分離純化工藝進行優(yōu)化研究，為綜合開發(fā)利用虎杖資源奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

Agilent1260高效液相色譜儀（美國安捷倫科技有限公司）；UV-2201SHIMADZU型分光光度計（日本島津）；KQ2200超聲波清洗器（上海楚定分析儀器有限公司）；TDL80-213離心機（上海安亭科學(xué)儀器廠）；氣浴恒溫振蕩器（江蘇金壇市醫(yī)療儀器廠）；FY130型藥物粉碎機（天津泰斯特儀器公司）；RE-3000A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；AE240型電子分析天平（瑞士METTLER）。

白藜蘆醇對照品、大黃素對照品、大黃素甲醚對照品（購自中國食品藥品檢定研究院，批號分別為111535-201703、110756-201913、110758-201616）；虎杖藥材（購自湖南廉橋藥材市場，由湖南中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室潘清平教授鑒定）；植物精提復(fù)合酶（寧夏夏盛實業(yè)集團有限公司）；AB-8，NKA-9，NKA-2，D101，H103型大孔樹脂（天津南開大學(xué)化工廠）；甲醇、乙腈為色譜純，其他試劑除乙醇外均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 虎杖樣品溶液的制備

虎杖粗粉參照文獻［6］的方法進行酶發(fā)酵處理，稱取酶處理過的虎杖粗粉約100 g，加入70%的乙醇1000 mL，超聲提取1 h（功率250 W）。過濾，濾液減壓濃縮至無醇味，離心，沉淀加水分散，離心取上清液，重復(fù)操作1次。將上清液合并，加水定容至1000 mL的容量瓶中，搖勻，得1 mL相當(dāng)于藥材0.104 g的虎杖樣品液。

2.2 含量測定方法

白藜蘆醇、虎杖總蒽醌的含量分別按文獻［7］中的高效液相色譜法進行測定。

2.3 大孔吸附樹脂的篩選

2.3.1 靜態(tài)飽和吸附量測定試驗 參考相關(guān)文獻，選AB-8、NKA-9、NKA-2、D101、H103型5種大孔樹脂［8-14］，樹脂經(jīng)過預(yù)處理之后［15］，各稱取2.5 g，置于具塞三角瓶中，分別精密加入樣品溶液50 mL，置于振蕩器中（室溫，頻率80 r/min，下同）振搖12 h，充分吸附后，取濾液，按2.2項的方法測定白藜蘆醇和蒽醌的濃度，并按公式計算出各樹脂的吸附量。

吸附量（mg/干樹脂）=吸附量/上樣量=（C前V前－C后V后）/W。其中，C前，C后分別為吸附前、后指標(biāo)成分濃度；V前，V后為上樣液吸附前、后溶液的體積；W為樹脂質(zhì)量（g）。結(jié)果見表1。

表1 5種不同樹脂靜態(tài)飽和吸附結(jié)果 （mg/g）

2.3.2 靜態(tài)洗脫率測定試驗 將已經(jīng)靜態(tài)飽和吸附有效成分后的5種大孔樹脂AB-8、NKA-9、NKA-2、D101、H103，過濾，風(fēng)干水分，精密加入70%乙醇50 mL，置振蕩器中，振搖解吸12 h后，過濾，測定洗脫液中各物質(zhì)濃度，按公式計算出各種大孔樹脂的靜態(tài)洗脫量和洗脫率。結(jié)果見表2。

洗脫率（%）=解吸量／吸附量=C解V解/（C前V前－C后V后）。其中，C解、V解為解吸后指標(biāo)成分濃度與液體體積。結(jié)果見表2。

表2 5種不同樹脂靜態(tài)洗脫結(jié)果 （mg/g）

2.4 靜態(tài)動力學(xué)試驗

2.4.1 靜態(tài)吸附動力學(xué)測定 精密稱取2 g經(jīng)預(yù)處理的H103型大孔樹脂，置于100 mL三角瓶中，加入虎杖樣品液50 mL，置振蕩器中振搖，每隔一段時間取出3 mL樣品液，分別測定溶液中各指標(biāo)成分的濃度，根據(jù)濃度吸附計算樹脂的吸附量。以樹脂吸附量Y（mg/g）對時間X（min）作圖，得到H103樹脂的靜態(tài)吸附動力學(xué)曲線，見圖1。如圖1可知，隨著時間的延長，樣品液中有效成分的吸附量逐漸增加，白藜蘆醇和蒽醌類成分在前4 h內(nèi)吸附較快，并分別在5 h、7 h時接近完全吸附。但蒽醌成分在6 h后趨于平緩，從生產(chǎn)效率與成本方面綜合考慮，本研究選擇6 h作為虎杖提取物上柱液的靜態(tài)吸附時間較為合適。

圖1 白藜蘆醇和蒽醌的靜態(tài)吸附動力學(xué)曲線

2.4.2 解吸動力學(xué)測定 將吸附后的樹脂抽濾出來，置于三角瓶中，加入70%的乙醇液50 mL，于振蕩器中振搖，每隔一段時間取3 mL經(jīng)解吸液，分別測定溶液中各指標(biāo)成分的濃度，見圖2。通過解吸動力學(xué)試驗可知，隨著時間的延長，樣品液中有效成分的濃度逐漸增加，白藜蘆醇和蒽醌分別在3 h、4 h時達到完全解吸。因此，在靜態(tài)解吸試驗中，有效成分在4 h左右基本達到了完全解吸。

圖2 白藜蘆醇和蒽醌的靜態(tài)解吸動力學(xué)曲線

2.5 H103型大孔樹脂的動態(tài)吸附試驗

準(zhǔn)確稱取10 g經(jīng)預(yù)處理的H103型大孔樹脂，按濕法裝入層析柱，取2.1項下制得的虎杖提取液300 mL（白黎蘆醇質(zhì)量濃度為0.198 mg/mL，蒽醌質(zhì)量濃度為0.244 mg/mL）上柱。每10 mL收集流出的樣品溶液1份，測定其指標(biāo)成分濃度，繪制動態(tài)吸附曲線，見圖3。

圖3 白藜蘆醇和蒽醌的動態(tài)吸附曲線

由圖3可知，白藜蘆醇在流份7的含量為流份6的9.88倍，表現(xiàn)出明顯的泄漏現(xiàn)象；蒽醌在流份9的含量為流份8的6.30倍，此時蒽醌成分開始出現(xiàn)泄漏現(xiàn)象。按每段流份10 mL計算，綜合考慮，總上樣體積為60 mL較為合適，相當(dāng)于6.2 g生藥。表明每克H103型大孔樹脂對虎杖的處理能力為0.62 g生藥。

2.6 正交優(yōu)選

H103樹脂工藝參數(shù)試驗在各單因素試驗的基礎(chǔ)上精密稱取經(jīng)預(yù)處理的H103型大孔樹脂9份，根據(jù)樣品溶液中白藜蘆醇和蒽醌成分的理化性質(zhì)結(jié)合大孔樹脂的吸附特點，選擇溶液濃度、pH值、流速作為考察因素，各因素選擇3個水平，采用L9（34）正交表，實施正交試驗設(shè)計，各因素水平的設(shè)計具體見表3。

表3 因素水平表

按表1的設(shè)計進行正交試驗，并以白藜蘆醇和蒽醌的吸附量作為試驗指標(biāo)，試驗結(jié)果見表4。通過對表4的直觀分析可知，4號試驗方案的總吸附量最大，最佳的提取工藝是A2B1C2，即pH4、上樣流速0.5 mL/min、原液濃度0.12 g（生藥）/mL。通過方差分析可知，影響總吸附率的因素優(yōu)先順序為B〉A(chǔ)〉C，其中上樣流速、原液的pH值對虎杖有效成分的吸附量有顯著影響，而原液濃度對吸附量的影響較小。

表4 正交試驗結(jié)果 （mg/g）

按優(yōu)化后的工藝條件A2B1C2進行3次平行試驗，結(jié)果見表5。在此條件下，測得H103型大孔樹脂虎杖白藜蘆醇和蒽醌的總吸附量分別為190.72 mg/g、192.09 mg/g和191.27 mg/g，說明此工藝條件穩(wěn)定可行。

表5 驗證試驗結(jié)果 （mg/g）

2.7 洗脫溶劑的選擇

精密稱取經(jīng)預(yù)處理過的H103型大孔樹脂7份，每份1 g，分別置于三角瓶中，加入樣品液后置于振蕩器中，振搖使之充分吸附，然后將樹脂抽濾出來，晾干，各樹脂柱對應(yīng)加入30%、40%、50%、60%、70%、80%、95%的乙醇各20 mL，室溫下置振蕩器振搖，讓其充分解吸后，測定洗脫液中各指標(biāo)成分的濃度，并根據(jù)濃度計算出洗脫率。乙醇的洗脫結(jié)果見表6。

表6 不同濃度乙醇洗脫作用比較

由表6可知，用70%乙醇洗脫時，白藜蘆醇的洗脫率最高，用95%乙醇洗脫時蒽醌成分的洗脫率最高。50%以下的乙醇對兩類成分的洗脫效果較差，70%或80%乙醇均能獲得較好的洗脫效果，考慮到成本及脂溶性雜質(zhì)也會隨乙醇的濃度增加而增加，經(jīng)綜合考慮，故選定70%乙醇作為洗脫劑。

2.8 H103型大孔樹脂的動態(tài)解吸試驗

樣品溶液按2.6項下正交試驗篩選出的條件上柱吸附，先用一定量的去離子水洗至樹脂流出液不渾濁。再以70%乙醇洗脫，每10 mL收集1份，共收集10份，每份取適量分別測定洗脫液中白藜蘆醇和蒽醌成分的濃度。以每份收集液中各指標(biāo)成分的含量為縱坐標(biāo)，洗脫體積為橫坐標(biāo)繪制洗脫曲線。結(jié)果見圖4。

由圖4可知，白藜蘆醇和蒽醌在洗脫至第6份體積時含量已經(jīng)很低，當(dāng)洗脫至第8份體積時含量已接近為0。所以最后確定每10 g樹脂用80 mL洗脫劑。

圖4 H103型大孔樹脂的動態(tài)解吸曲線

2.9 H103型大孔樹脂動態(tài)解吸流速的確定

分別準(zhǔn)確稱取5 g經(jīng)預(yù)處理后的H103大孔樹脂3份，按濕法裝入層析柱，虎杖藥材按已確定的工藝進行提取，提取液經(jīng)濃縮、離心后按2.6項所確定的工藝上柱，經(jīng)吸附飽和后，先分別用去離子水沖洗柱子至流出液無色，再以40 mL濃度為70%的乙醇，按0.5 mL/min、1 mL/min、2 mL/min的流速分別洗脫，收集流出液，分別測定各流出液中白藜蘆醇和蒽醌的含量，并計算洗脫率。

不同洗脫流速對洗脫率的影響，見表7。由表7的結(jié)果可知，洗脫效果與洗脫流速成負(fù)相關(guān)性，當(dāng)洗脫速度越快時，洗脫效果越低，特別是流速超過2 mL/min后，洗脫劑與樹脂上的成分不能進行充分接觸，洗脫效果明顯變差。建議把流速控制在1mL/min左右，可以兼顧到洗脫得率和洗脫的效率。

表7 不同洗脫流速洗脫率比較

2.1 0 所得產(chǎn)品總有效成分的純度測定

準(zhǔn)確稱取100 g已經(jīng)處理過的H103型大孔樹脂，按濕法裝柱，再按上述最佳上樣和洗脫條件，取100 mL虎杖樣品溶液在H103型樹脂柱上進行洗脫，收集洗脫液，低溫烘干成粉末并干燥至恒重，粉末稱重為1.9305 g。再取烘干粉末0.5002 g，分別按2.2項下方法測定各有效成分含量，每個樣品重復(fù)3次，測定白藜蘆醇平均含量為34.77%（34.23%、35.40%、34.68%），蒽醌含量為47.39%（47.85%、47.76%、46.55%），總有效部位的平均純度為82.16%，較之大孔樹脂純化前的含量，純度提高了5倍。

3 討論

采用大孔吸附樹脂對虎杖主要化學(xué)成分進行分離和純化的研究已有不少文獻進行過報道，通過對比發(fā)現(xiàn)，即便是虎杖中相同成分，不同文獻篩選得到的最佳大孔吸附樹脂類型和工藝并不完全一致。本研究通過對AB-8、NKA-9、NKA-2、D101、H103型5種大孔吸附樹脂富集純化虎杖白藜蘆醇和蒽醌兩大成分的性能進行考察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)H103型大孔吸附樹脂對上述兩類虎杖成分具有較好的富集作用和良好的解吸效果。

對H103型大孔樹脂進行正交試驗，以原液的濃度、pH值、上樣流速為因素進行上樣條件考察，最后確定原液濃度為0.12 g/mL，原液pH值調(diào)整為4，上樣液流速控制為0.5 mL/min時能獲得最好的吸附效果，其中上樣流速對吸附效果具有顯著性影響。理論上來說上樣液流速越慢，化學(xué)成分才能更有效地擴散到樹脂內(nèi)部和表面進行分子篩過濾，并依靠范德華力和氫鍵等發(fā)生物理吸附。過快的流速顯然不利于樹脂與被吸附成分的充分接觸而導(dǎo)致泄露增加，產(chǎn)率下降。在實際生產(chǎn)操作中，需要盡量縮短吸附時間才能兼顧到生產(chǎn)效率。在大孔樹脂的吸附過程中，藥液的pH值影響也較為顯著。白藜蘆醇和蒽醌都屬于酚性成分，具有一定的酸性，樹脂對其吸附的能力很大程度上受到解離度的影響。即酸性條件下酸性物質(zhì)主要以分子形式存在，易被樹脂吸附，而在堿性條件下發(fā)生解離，則不易被吸附。但過低的pH值不但會影響白藜蘆醇的穩(wěn)定性，還會使白藜蘆醇等轉(zhuǎn)變成烊鹽，導(dǎo)致吸附下降。因此，原液以控制在pH值4為宜。

另外，對H103大孔樹脂洗脫條件進行考察，洗脫流速對洗脫率有一定影響，最終確定洗脫流速為1 mL/min，洗脫溶劑為70%乙醇。最后對所得產(chǎn)品的總有效成分進行純度測定，測定結(jié)果顯示純化后虎杖總有效成分的含量可達80%以上，說明本工藝穩(wěn)定可行。

虎杖活性成分除蒽醌和白藜蘆醇外，尚含有白藜蘆醇的苷類化合物，即虎杖苷。具文獻報道，虎杖苷在植物中的含量比白藜蘆醇要高數(shù)倍，但虎杖苷作為活性成分在體內(nèi)要先轉(zhuǎn)化為白藜蘆醇才能發(fā)揮醫(yī)療作用。本研究對原料藥材的預(yù)處理采用了酶解發(fā)酵的方法，即讓苷類酶解成相應(yīng)苷元，發(fā)現(xiàn)效果與直接使用虎杖原料提取比較白藜蘆醇和游離蒽醌的含量可以提高數(shù)倍。酶處理不僅提高了有效成分產(chǎn)率，同時也有助于降低大孔樹脂同時分離多種成分的工藝難度。

經(jīng)H103大孔樹脂富集后的白藜蘆醇和蒽醌可采用醇提水沉、結(jié)晶等傳統(tǒng)方法進一步分離。本實驗對虎杖提取物大孔樹脂的處理研究為以后將虎杖作為原料向中藥制劑、保健用品的開發(fā)和工藝制定提供了科學(xué)依據(jù)，不失為一次有益的探索。