毛露甜，朱蔚健，徐良雄，練英鐸，夏樹敏，呂鎮(zhèn)城

（1.惠州學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院；2.澳寶化妝品（惠州）有限公司，廣東 惠州 516007）

近年來，安全、溫和、功效型化妝品受到人們的青睞，但很多化妝品中添加了如膠原蛋白、透明質(zhì)酸、多肽、銀耳多糖等植物來源的功能性提取物，這大大增加了化妝品被污染的風(fēng)險(xiǎn)［1-2］．化妝品常見的微生物污染有細(xì)菌性污染（金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸桿菌等）和真菌性污染（黑曲霉、黃曲霉等）等［3］．

化妝品的原材料、生產(chǎn)環(huán)境、生產(chǎn)設(shè)備以及半成品膏體都容易受到霉菌的污染，其中面膜類產(chǎn)品受霉菌污染尤為明顯［4］．化妝品被黑曲霉污染是導(dǎo)致化妝品變質(zhì)的一個(gè)重要因素．黑曲霉廣泛存在于自然界中，在溫暖潮濕的南方地區(qū)尤其容易生長(zhǎng)繁殖，它通過次生代謝途徑合成黃曲霉毒素、單端孢菌毒素等，有一定的致癌性，嚴(yán)重危害人體健康［5］．

化妝品的防腐歷來是化妝品研發(fā)中的一個(gè)重要環(huán)節(jié)．2015年新版《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》中允許使用的51種防腐劑大都是化學(xué)合成物質(zhì)［6］，其中卡松、甲基氯異噻唑啉酮、尼泊金酯類等多種常用的防腐劑對(duì)人體具有一定的刺激性以及潛在的安全風(fēng)險(xiǎn)［7］．另外，由于環(huán)境污染，敏感性肌膚的人群越來越多，開發(fā)安全高效、低毒溫和的防腐劑是當(dāng)前化妝品防腐劑的研究熱點(diǎn)，但目前還極少研究植物內(nèi)生真菌代謝物在化妝品中的抑菌活性．

植物內(nèi)生真菌有產(chǎn)生殺蟲、抗菌、抗癌的生物活性物質(zhì)的潛能，內(nèi)生菌及其代謝產(chǎn)物具有很高的研究?jī)r(jià)值［8-9］．西藏的地理環(huán)境獨(dú)特，藏地植物長(zhǎng)期生長(zhǎng)在高海拔、低氧、高寒區(qū)域，對(duì)極端環(huán)境有較好的耐受力．此研究有望從中分離到與普通生境不一樣的獨(dú)特內(nèi)生真菌，以期能研發(fā)出一種新穎的抗黑曲霉活性的代謝物．本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)藏地植物內(nèi)生菌的分離純化、發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵代謝物提取和活性篩選，并對(duì)活性菌種進(jìn)行鑒定，為后續(xù)化妝品新型抗菌活性次生代謝產(chǎn)物的發(fā)現(xiàn)奠定基礎(chǔ)．

1 材料和方法

1.1 材料

植物采樣：2018年12月于西藏林芝地區(qū)的雅尼國家濕地公園、林芝索松林普巴等地采集桃花、砂生槐、檉柳等植物樣本6份，同時(shí)對(duì)植物進(jìn)行鑒定和編號(hào)．

測(cè)試菌：黑曲霉（Aspergillus niger）由惠州學(xué)院天然產(chǎn)物化學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供，2018年8月分離自高良姜．

1.2 試劑與儀器

試劑：甲醇、次氯酸鈉、乙醇、甘油、乙酸乙酯、二氯甲烷、石油醚、氯化鈉等常規(guī)試劑均為分析純；硫酸鏈霉素（純度98%，上海麥克林生化科技有限公司）．

培養(yǎng)基：（1）馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）：將200 g馬鈴薯削皮切塊小火煮沸30 min，3層紗布過濾，加葡萄糖20 g、瓊脂粉20 g，加自來水定容至1000 mL；（2）大米或玉米固體培養(yǎng)基：每個(gè)發(fā)酵瓶放入大米或玉米60 g，加自來水60 mL；上述培養(yǎng)基均以121℃高壓蒸汽滅菌15 min，備用．

儀器：SW-CJ-2FD超凈工作臺(tái)、GR60DR自動(dòng)電熱壓力蒸汽滅菌鍋、TE212電子精密天平、電熱恒溫干燥箱、RV10 digital旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、SB25-12D超聲波清洗機(jī)、BSD-TX370恒溫震蕩培養(yǎng)箱、SPX-250生化培養(yǎng)箱、9700型PCR儀．

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 組織分離法分離純化植物內(nèi)生真菌

用2.5%次氯酸鈉和70%乙醇依次消毒植物的莖、葉等組織，組織分離法在PDA平板上挑選單菌落獲得純種［10］．對(duì)獲得單菌落的內(nèi)生真菌進(jìn)行拍照并編號(hào)入庫，將純培養(yǎng)物分別置于4℃、-20℃和-80℃冰箱中保藏菌種．

1.3.2 內(nèi)生真菌的固體發(fā)酵及其代謝物的提取

用無菌吸管從純培養(yǎng)的平板中戳取6-8個(gè)菌塊，分別接種在大米、玉米發(fā)酵培養(yǎng)基中，每株內(nèi)生真菌用玉米、大米培養(yǎng)基各發(fā)酵一瓶，于28℃暗房中恒溫培養(yǎng)30 d，期間不定期觀察記錄發(fā)酵現(xiàn)象．

30 d后，往發(fā)酵瓶中加入100 mL乙酸乙酯，浸提過夜，搗碎，過濾收集發(fā)酵粗提物，轉(zhuǎn)移至旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至干燥，加入3 mL甲醇溶解，得到內(nèi)生真菌的代謝粗提物［11］．

1.3.3 內(nèi)生真菌活性代謝物的篩選

黑曲霉孢子液的制備［12］：用巴氏管吸取2 mL無菌水于活化培養(yǎng)的黑曲霉平板中，輕輕震蕩收集黑曲霉的孢子液．用無菌棉簽沾取少量孢子液均勻涂PDA平板，將預(yù)先準(zhǔn)備好的含10 μL粗提物的濾紙片（直徑5 mm）放置于上述含測(cè)試菌液的PDA平板上，每張濾紙片的間距不小于24 mm，紙片中心距平板邊緣應(yīng)不小于15 mm，每個(gè)平板上貼放6張濾紙片，于28℃恒溫培養(yǎng)2-3 d，每隔12 hr觀察并記錄抑菌圈大?。?/p>

1.3.4 抗黑曲霉活性菌株的分子鑒定

內(nèi)生真菌DNA的提取選用改良的CTAB法［13］．1 mL黑曲霉的菌絲球經(jīng)600 μL 5%CTAB提取液和10 μL濃度為20 mg/mL的蛋白酶K處理，用細(xì)胞破碎儀研磨10 min，于65℃水浴1hr（其間顛倒混勻3-4次），冷卻至室溫，加入等體積酚-氯仿（1∶1），上下顛倒10 min，11000 rpm離心10 min，將上清液移至新的離心管，加入2.5倍體積的預(yù)冷無水乙醇，充分混勻后放-20℃冰箱靜置20 min，離心棄除上清液，加70%乙醇使DNA沉淀并揮發(fā)干，用20 μL TE緩沖液溶解，于-20℃保存．

根據(jù)真菌18S rDNA保守區(qū)設(shè)計(jì)引物，采用通用引物ITS1和ITS4進(jìn)行PCR擴(kuò)增．

引物合成序列如下：

ITS1：TCCGTAGGTGAACCTGCGG

ITS4：TCCTCCGCTTATTGATAGC

PCR擴(kuò)增采用30 μL的反應(yīng)體系和35個(gè)循環(huán)條件，PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，送交北京六合華大基因科技有限公司武漢分公司測(cè)序．用SeqMan進(jìn)行序列的人工校正，在GenBank進(jìn)行Blast序列比對(duì)，使用MEGA 6.0軟件進(jìn)行NJ樹的構(gòu)建．

2 結(jié)果與分析

2.1 藏地植物內(nèi)生真菌的分離純化

本次共分離純化得到內(nèi)生真菌78株，部分內(nèi)生真菌的菌落形態(tài)見圖1．可見菌株LT 36的菌落為白色疏松粉粒狀，全緣，菌絲白色；菌株LT 62的菌落為圓形、菌絲為淺灰色，基質(zhì)為淡青色；菌株LT 46的菌落為圓形、全緣，菌絲白色．用透明膠紙粘片法經(jīng)乳酸石炭酸棉藍(lán)染色觀察3株菌的菌絲和孢子形態(tài)，結(jié)果見圖2，可見三株菌的菌絲發(fā)達(dá)，孢子橢圓形，其中LT 62的孢子較大，數(shù)量較多．

圖1 內(nèi)生真菌LT36、LT62、LT46的菌落形態(tài)

圖2 內(nèi)生真菌LT 36、LT 62、LT 46的菌絲和孢子形態(tài)

2.2 抗黑曲霉的活性代謝物篩選

分離純化的菌株經(jīng)玉米和大米培養(yǎng)基固體發(fā)酵30 d，乙酸乙酯法提取得到156個(gè)次級(jí)代謝產(chǎn)物，平板濾紙片法對(duì)黑曲霉（Aspergillus niger）進(jìn)行活性初篩，篩選出13個(gè)具有抑制活性的內(nèi)生真菌代謝物，其中抑菌圈半徑≥1mm的代謝物有8個(gè)，以LT 46R、LT 46C、LT 62R和LT 36R的抑菌活性較好．復(fù)篩結(jié)果與初篩結(jié)果的活性基本一致，其抑菌效果見表1和圖3，后續(xù)對(duì)相應(yīng)的菌株進(jìn)行菌種鑒定．

表1 內(nèi)生真菌活性代謝物拮抗黑曲霉的復(fù)篩結(jié)果

圖3 內(nèi)生真菌代謝物L(fēng)T 46R、LT 46C和LT 62R對(duì)黑曲霉的抑菌效果

2.3 菌種鑒定結(jié)果與聚類樹構(gòu)建

2.3.1 活性菌種的DNA提取和PCR擴(kuò)增

對(duì)抗菌活性最好的3株菌株（LT 46、LT 62、LT 36）進(jìn)行DNA提取、PCR擴(kuò)增，經(jīng)1.0%的瓊脂糖凝膠電泳分析擴(kuò)增產(chǎn)物，結(jié)果見圖4．3株菌株的擴(kuò)增產(chǎn)物條帶清晰，與Marker對(duì)比，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物約為500 bp，與引物ITS1/ITS4的預(yù)期擴(kuò)增片段400-600 bp一致．

圖4 活性內(nèi)生真菌LT 46、LT 62、LT 36的PCR擴(kuò)增圖

2.3.2 ITS序列測(cè)定結(jié)果與系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

將3株菌的ITS序列分別提交至NCBI數(shù)據(jù)庫中，對(duì)同源度較高的ITS rDNA序列進(jìn)行Blast比對(duì)，構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹見圖5-7，可見LT 46、LT 62、LT 36分別與ConiolaRella屬、Coniochaeta cipronana亞屬、Daldinia屬的親緣關(guān)系最近，但沒法鑒定到種．

圖5 菌株LT 46基于ITS序列的系統(tǒng)發(fā)育樹

圖6 菌株LT 62基于ITS序列的系統(tǒng)發(fā)育樹

圖7 菌株LT 36基于ITS序列的系統(tǒng)發(fā)育樹

3 討論與結(jié)論

本研究分離到3株有抗黑曲霉活性的內(nèi)生真菌LT 46、LT 62、LT 36，經(jīng)ITS序列測(cè)序分別鑒定為ConiolaRella屬、Coniochaeta cipronana亞 屬 和Daldinia屬，都沒鑒定到種．值得關(guān)注的是，LT 46玉米和大米的發(fā)酵物對(duì)黑曲霉均有較高的拮抗活性，相較于其他菌株而言，LT 46更有望為化妝品新型防腐劑提供新型天然產(chǎn)物．

目前，從傳統(tǒng)中醫(yī)藥及民間古方中發(fā)掘出用于美容化妝品的天然活性物質(zhì)已經(jīng)有數(shù)百種，其發(fā)明的組合物在防腐功能上具有協(xié)同增效作用，其抑菌效力明顯高于化學(xué)防腐劑［14-15］．無添加防腐劑復(fù)合體系是天然、綠色化妝品研發(fā)的熱點(diǎn)和趨勢(shì)［16-17］，本研究希望通過對(duì)植物內(nèi)生真菌的抑菌活性成分進(jìn)行研究，開發(fā)出一種可以應(yīng)用在化妝品中的天然植物來源的抑菌活性成分，下一階段可考慮與多元醇復(fù)配，開發(fā)一種在化妝品中可以宣稱無添加概念的復(fù)合抑菌防腐劑體系．