溫大科，李天宇

無錫市兒童醫(yī)院血液科，江蘇無錫 214000

傳染性單核細(xì)胞增多癥(IM)患兒的免疫因子表達(dá)可能發(fā)生異常[1-2]。IM作為以發(fā)熱起病的感染性疾病，免疫因子并非其特異性診斷因素，容易與其他感染性疾病混淆[3]。腫瘤壞死因子α(TNF-α)由巨噬細(xì)胞釋放，在感染性疾病中TNF-α水平可能出現(xiàn)異常；白細(xì)胞介素(IL)由白細(xì)胞釋放，在感染性疾病發(fā)病過程中起著傳遞抗原信息的作用[4-6]。本研究旨在進(jìn)一步明確IM與TNF-α、IL的關(guān)系，探討上述指標(biāo)聯(lián)合應(yīng)用對IM的診斷價(jià)值。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2017年12月至2019年12月于本院確診為IM的患兒47例納入IM組，另選擇同期就診的非IM發(fā)熱患兒50例作為非IM發(fā)熱組。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)IM組患兒符合《諸福棠實(shí)用兒科學(xué)(第8版)》中IM的診斷標(biāo)準(zhǔn)，且為首次診斷[1]；(2)非IM發(fā)熱組患兒均明確診斷為上呼吸道感染，符合《急性上呼吸道感染基層診療指南2018版》標(biāo)準(zhǔn)[7]；(3)腋溫≥37.3 ℃；(4)年齡3～12歲；(5)患兒監(jiān)護(hù)人簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)血液系統(tǒng)惡性疾??；(2)先天性缺陷或發(fā)育異常；(3)半月內(nèi)抗菌藥物或免疫抑制劑使用史；(4)器官功能明顯異常；(5)熱程(發(fā)熱天數(shù))超過3 d。

1.2方法 所有患兒均行EB病毒抗體(包括CA-IgM、CA-IgG及NA-IgG)檢測。

1.2.1TNF-α、IL-1β、IL-6及IL-10水平檢測 抽取患兒空腹靜脈血后分離上清液，使用上海酶聯(lián)生物科技有限公司提供的相關(guān)酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)試劑盒(雙抗夾心法)對血清TNF-α、IL-1β、IL-6及IL-10水平進(jìn)行檢測，并采用酶標(biāo)儀對結(jié)果進(jìn)行定量，具體方法如下。將所有試劑充分混勻，注意輕拿輕放，同時(shí)緩慢混勻，避免氣泡產(chǎn)生導(dǎo)致取樣誤差。標(biāo)本用標(biāo)本稀釋液1∶1稀釋后加50 μL于反應(yīng)孔內(nèi)建立標(biāo)本孔，并將等量的稀釋液加入其他反應(yīng)孔作為空白孔。立即加入50 μL的生物素標(biāo)記的抗體。蓋上膜板，輕輕振蕩混勻，37 ℃溫育1 h。甩去孔內(nèi)液體，每孔加滿洗滌液，振蕩30 s，棄去洗滌液，用吸水紙拍干。重復(fù)此操作3次后每孔加入80 μL的親和鏈酶素-辣根過氧化物酶(HRP)，輕輕振蕩混勻，37 ℃溫育30 min。而后每孔加入底物A、B各50 μL，輕輕振蕩混勻，于37 ℃溫育10 min，孵育過程中避免光照。取出酶標(biāo)板，迅速加入50 μL終止液，使用上海譜原儀器有限公司提供的Alpha1500型分光光度計(jì)在450 nm波長處測定各孔的吸光度(A)值。以A值為縱坐標(biāo)(Y)，相應(yīng)的待測物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)(X)，繪制相應(yīng)的曲線，樣品中待測物質(zhì)含量可根據(jù)其A值由標(biāo)準(zhǔn)曲線換算出。試劑盒性能：(1)敏感度，最小的檢測濃度小于1號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品，樣品線性回歸與預(yù)期濃度相關(guān)系數(shù)(R)值為0.990。(2)特異度，不與其他細(xì)胞因子反應(yīng)。(3)重復(fù)性，板內(nèi)、板間變異系數(shù)均小于10%。

1.2.2臨床資料及實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果收集 收集患兒臨床資料，包括年齡、性別、出生體質(zhì)量、熱程、1年內(nèi)抗菌藥物使用次數(shù)、臨床癥狀，以及實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果，包括白細(xì)胞計(jì)數(shù)(WBC)、中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)(Neu)、淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)(Lym)、異型淋巴細(xì)胞占比、C反應(yīng)蛋白、降鈣素原。

2 結(jié) 果

2.1兩組患兒臨床資料及實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果比較 IM組患兒肝大及脾大占比、Neu、Lym、異型淋巴細(xì)胞占比，以及TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10水平均顯著高于非IM發(fā)熱組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 兩組患兒臨床資料及實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果比較

2.2IM相關(guān)指標(biāo)的Logistic回歸分析 根據(jù)單因素分析結(jié)果，將IM患病作為因變量(1=是，0=否)；將肝大(1=是，0=否)及脾大(1=是，0=否)、Neu(實(shí)測值)、Lym(實(shí)測值)、異型淋巴細(xì)胞占比(實(shí)測值)、TNF-α(實(shí)測值)、IL-1β(實(shí)測值)、IL-6(實(shí)測值)及IL-10(實(shí)測值)作為自變量進(jìn)行二元Logistic回歸分析，結(jié)果顯示，肝大(OR=35.128，95%CI：4.467～127.556)、異性淋巴細(xì)胞占比(OR=1.277，95%CI：1.021～1.476)、TNF-α(OR=15.991，95%CI：5.476～369.052)、IL-1β(OR=2.015，95%CI：1.095～3.706)、IL-6(OR=2.853，95%CI：1.398～5.822)及IL-10(OR=1.221，95%CI：1.083～1.377)為IM的危險(xiǎn)因素(P<0.05)，見表2。

表2 IM相關(guān)指標(biāo)的Logistic回歸分析

2.3基于TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10水平的預(yù)測模型的構(gòu)建與驗(yàn)證 根據(jù)多因素Logistic分析結(jié)果，構(gòu)建基于TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10水平的預(yù)測列線圖，見圖1。列線圖預(yù)測IM的C指數(shù)為0.922(95%CI：0.871～0.963)。內(nèi)部驗(yàn)證顯示，列線圖模型預(yù)測IM與實(shí)際可能性絕對誤差為0.009，一致性良好，見圖2。

圖1 基于TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10水平預(yù)測IM的列線圖

圖2 基于TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10水平預(yù)測IM模型的內(nèi)部驗(yàn)證

3 討 論

國內(nèi)IM發(fā)病人群主要集中于學(xué)齡及學(xué)齡前兒童，IM是一類自限性疾病，患兒癥狀會(huì)在一定時(shí)間后消失，但在SENJO等[8]的研究中，少部分臨床治愈后的患兒淋巴組織內(nèi)仍有少量EB病毒殘留，而此類殘留病毒會(huì)誘發(fā)小兒惡性腫瘤疾病。通過早期確診并采取積極的治療手段能盡可能地在病毒復(fù)制早期進(jìn)行遏制，并減少治愈后的病毒殘留量。目前，根據(jù)《諸福棠兒科學(xué)(第八版)》中的描述，通過癥狀及相關(guān)抗原的檢測能對IM進(jìn)行有效診斷，但大部分發(fā)熱患兒首診的鄉(xiāng)村衛(wèi)生院及社區(qū)醫(yī)院等基層醫(yī)療機(jī)構(gòu)開展相關(guān)抗原檢測的難度大。本課題組在前期的研究中，針對EB病毒所致的IM誘發(fā)的單核-巨噬細(xì)胞系統(tǒng)增生的特點(diǎn)，結(jié)合國內(nèi)外多個(gè)研究[9-10]，篩選出了TNF-α、IL-1β、IL-6及IL-10對IM進(jìn)行聯(lián)合診斷，效果顯著。

本研究中，單因素分析結(jié)果顯示，IM組患兒較非IM發(fā)熱組患兒肝大、脾大占比，以及Neu、Lym、異型淋巴細(xì)胞占比升高明顯。IM患兒的診斷標(biāo)準(zhǔn)中肝大是其中重要的一項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)，而劉立飛等[11]的研究中，IM患兒肝大、脾大占比高達(dá)62.1%及80.6%，顯著高于本次研究中的27.6%及78.7%，原因在于本研究主要針對早期發(fā)熱的IM患兒，納入患兒熱程均<3 d，而該研究中患兒熱程在7～10 d，由于此時(shí)間段內(nèi)肝、脾二器官受到病毒感染的影響時(shí)間長，其所致的免疫功能異?？哼M(jìn)更嚴(yán)重，故肝大、脾大更明顯。而咽峽炎及頸部淋巴結(jié)腫大在細(xì)菌或其他病毒所致的上呼吸道感染中也屬較為常見的癥狀，并非IM患兒的特異性表現(xiàn)，故這些癥狀僅為IM診斷參考標(biāo)準(zhǔn)中的一項(xiàng)。IM患兒的Neu、Lym及異型淋巴細(xì)胞占比明顯升高則是由于EB病毒引起的單核-巨噬細(xì)胞系統(tǒng)異常激活所致，這點(diǎn)也已經(jīng)在國內(nèi)外多個(gè)研究中得到證實(shí)[12-13]。TNF-α是由巨噬細(xì)胞釋放的腫瘤細(xì)胞殺傷因子，IM患者由于EB病毒感染導(dǎo)致巨噬細(xì)胞增生，故TNF-α水平亦會(huì)明顯增加。在肖楠陽等[14]的研究中，EB病毒感染患兒外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)內(nèi)多個(gè)Toll受體蛋白及TNF-α mRNA均呈高表達(dá)狀態(tài)，而該研究還指出Toll受體蛋白是前炎性細(xì)胞因子基因激活的重要影響因素，說明EB病毒可導(dǎo)致PBMC內(nèi)TRL激活，從而誘導(dǎo)TNF-α大量釋放，本研究中IM患兒的血清TNF-α水平顯著上升，與該研究結(jié)論一致。IL-1β、IL-6及IL-10均為IL家族成員，既往研究顯示，上述3種因子由T淋巴細(xì)胞釋放，IL-1β、IL-6具有促炎作用，而IL-10則具有抗炎作用，當(dāng)EB病毒進(jìn)入體內(nèi)后，通常由巨噬細(xì)胞吞噬并將抗原信號(hào)呈遞至T細(xì)胞，從而誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的發(fā)生[15-16]。在GERBER-MORA等[17]的研究中，EB病毒感染后患兒體內(nèi)CD4+CD8+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Tr細(xì)胞)比例顯著上升，從而導(dǎo)致該細(xì)胞分泌的IL-10及IL-6水平顯著增加。同時(shí)文獻(xiàn)[14]報(bào)道，EB病毒激活TRL受體后亦會(huì)導(dǎo)致PBMC內(nèi)的IL-1β mRNA水平顯著增加，從而導(dǎo)致體內(nèi)上述因子水平增加，本研究也得到了類似結(jié)果。

回歸分析結(jié)果顯示，脾大、Neu、Lym與IM發(fā)病無相關(guān)性，筆者認(rèn)為有以下幾點(diǎn)原因：(1)大規(guī)模流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，近年來小兒上呼吸道感染中病毒感染的占比顯著增加，而巨細(xì)胞病毒、甲型流感病毒在某些特定條件下亦會(huì)誘發(fā)脾大，故脾大非EB病毒感染的特異性癥狀[18]；(2)在文獻(xiàn)[11]的研究中，患兒癥狀與年齡相關(guān)，部分年齡較小的患兒癥狀不典型；(3)發(fā)熱患兒多伴有病原體感染，而此類患兒Neu及Lym通常情況下會(huì)上升，加之病程較短，故上述2個(gè)指標(biāo)差異不顯著；(4)本次研究為單中心小樣本量研究，結(jié)果可能存在偏倚。

列線圖是一種圖形工具模型，最初設(shè)計(jì)用于無需計(jì)算機(jī)或計(jì)算器即可快速地進(jìn)行近似復(fù)雜的計(jì)算，通過將不同指標(biāo)按其權(quán)重形成量化的預(yù)測分值，列線圖在提高單項(xiàng)指標(biāo)診斷準(zhǔn)確性的基礎(chǔ)上，具有簡便的界面和實(shí)用性，目前已被廣泛應(yīng)用于疾病診斷及預(yù)后預(yù)測中[19-21]。本研究對基于TNF-α、IL-1β、IL-6及IL-10水平的列線圖分析結(jié)果顯示，C指數(shù)為0.922，提示該模型對于IM的預(yù)測價(jià)值較好。

綜上所述，TNF-α、IL-1β、IL-6及IL-10聯(lián)合檢測可以有效提升IM患兒的診斷效能，且ELISA檢測上述指標(biāo)的可行性較好，可以應(yīng)用于基層醫(yī)院發(fā)熱患兒IM的早期診斷中。