王 濤, 馮君瑞, 李姝璇, 杜 響, 劉曉環(huán), 吳綿斌

葡萄糖胺-6-磷酸合成酶的異源表達(dá)及其酶學(xué)性質(zhì)表征

王 濤1, 馮君瑞1, 李姝璇1, 杜 響1, 劉曉環(huán)1, 吳綿斌2

(1. 濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院 生物科學(xué)學(xué)院,山東 日照 276826;2. 浙江大學(xué)生物質(zhì)化工教育部重點實驗室, 浙江大學(xué) 化學(xué)工程與生物工程學(xué)院,浙江 杭州 310027)

葡萄糖胺-6-磷酸合成酶(GFA)是己糖胺生物合成中的一個關(guān)鍵酶，為建立一條高效的GFA生產(chǎn)工藝，其研究對象GFA來源于致病菌白色假絲酵母(ATCC 64548)，通過基因克隆，然后在大腸桿菌中進(jìn)行異源表達(dá)。結(jié)果顯示，GFA的最佳異源表達(dá)條件為：誘導(dǎo)劑濃度為0.1 mmol×L-1，誘導(dǎo)溫度為28 ℃，誘導(dǎo)時間為15 h，誘導(dǎo)時機(jī)為菌體濃度OD600達(dá)到1.0。其最佳的反應(yīng)條件為：反應(yīng)溫度為37 ℃，反應(yīng)pH為7.2，反應(yīng)時間為20 min。通過雙倒數(shù)作圖法得到該酶的M值為0.47 mg×mL-1；當(dāng)反應(yīng)體系中加入抑制劑(bacilysin)時，GFA轉(zhuǎn)氨酶活性會被顯著抑制，酶活降低約54.8 %。結(jié)果表明，研究所采取的方法能夠高效地異源表達(dá)葡萄糖胺-6-磷酸合成酶，提高其應(yīng)用潛力，這對于加快新型抗真菌藥物的研發(fā)具有重要意義。

葡萄糖胺-6-磷酸合成酶；異源表達(dá)；酶學(xué)性質(zhì)；抗真菌靶點

1 前 言

葡萄糖胺-6-磷酸合成酶(GFA，EC 2.6.1.16)是氨基己糖代謝通路中第一個關(guān)鍵酶[1-2]，也是含糖胺生物大分子(如：幾丁質(zhì))代謝調(diào)控過程中一個關(guān)鍵的節(jié)點[3]。其能夠利用-谷氨酰胺，不可逆地催化-果糖-6-磷酸轉(zhuǎn)化成-葡萄糖胺-6-磷酸(GlcN6P)。GFA是酰胺轉(zhuǎn)移酶超家族中一員，其結(jié)構(gòu)由兩個行使不同功能的結(jié)構(gòu)域組成：轉(zhuǎn)氨酶結(jié)構(gòu)域和異構(gòu)酶結(jié)構(gòu)域[4-5]。通過抑制葡萄糖胺-6-磷酸合成酶的活性，能夠?qū)е孪嚓P(guān)糖蛋白及幾丁質(zhì)的生物合成受阻，致使致病菌無法合成細(xì)胞壁而死亡[6]。但在哺乳動物中，該酶被抑制短時間內(nèi)不會對個體造成嚴(yán)重的傷害，其所造成的結(jié)果因組織不同而異。因此， GFA也被認(rèn)為將成為抗細(xì)菌和抗真菌新藥研發(fā)中極具前景的潛在靶點[7-8]。

研究表明：無論在胞內(nèi)還是在胞外，GFA的存在形式(活性的二聚體與無活性的六聚體)都處于一種平衡狀態(tài)[9]。同時研究發(fā)現(xiàn)，隨著蛋白濃度的增加及產(chǎn)物(GlcN6P)濃度的提高，GFA更傾向于以六聚體形式存在，造成其比活力將隨之降低[10]。這必將大大增加GFA的生產(chǎn)及應(yīng)用方面的成本，嚴(yán)重影響其應(yīng)用潛力。此外，來源不同的GFA往往在異源表達(dá)的過程中存在表達(dá)量少、提取困難等問題，因此迫切需要通過合適的手段，建立一條高效的生產(chǎn)工藝。本研究中，來源于真菌致病菌(白色念珠菌)中的GFA在大腸桿菌BL21(DE3) Codon plus中成功實現(xiàn)異源表達(dá)，并對其酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了表征，大大提高了其生產(chǎn)效率。在此基礎(chǔ)上，驗證其作為抗真菌靶點的可行性，為其進(jìn)一步在抗真菌新藥研發(fā)中的應(yīng)用提供基礎(chǔ)。

2 實驗部分

2.1 試劑與儀器

(1) 本實驗使用的菌種主要有：實驗室保藏的大腸桿菌BL21(DE3) Codon plus，大腸桿菌DH5α白色念珠菌(ATCC 64548)。

(2) 主要試劑有：1 mmol×L-1的GLUPA(-谷氨酰對硝基苯胺)；pH 7.2的磷酸鹽(PBS)緩沖液；LB(Luria-Bertani)培養(yǎng)基(pH 7.2，胰化蛋白胨10 g×L-1、酵母提取物5 g×L-1和NaCl 10 g×L-1)；對硝基苯胺(天津大茂化學(xué)試劑廠)；Bacilysin(實驗室保存)。質(zhì)粒提取試劑盒(Solarbio，D1100)，瓊脂糖凝膠回收試劑盒(Omega，D2500-01)。

2.2 實驗過程

2.2.1 對硝基苯胺標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

用pH為7.2的PBS緩沖液分別配制終濃度為10、20、30、40、50 mmol×L-1的對硝基苯胺溶液，溶解后，使用可見光分光光度計，以pH為7.2的PBS緩沖液為空白對照，測量吸光度A420，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.2.2基因制備與表達(dá)載體的構(gòu)建

從NCBI基因文庫調(diào)取白色念珠菌細(xì)胞GFA的基因序列(，GenBank：NC-032091.1)，設(shè)計上游引物5￠-CGCATGTGTGGTATTTTTGGTTACGTCAATT-3￠、下游引物5￠- CCGTTACTCAACAGTAACTGATTTAGCCAAGTT-3￠(下劃線部分分別為I、I酶切位點)。以白色念珠菌基因組為模板進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增。PCR克隆該基因過程中在該序列的上下游分別引入限制性內(nèi)切酶I/I 的酶切位點，將 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物用I／I雙酶切后并克隆至載體 pET28(a)。經(jīng)酶切和PCR 驗證后，對所獲得的陽性克隆進(jìn)一步測序驗證，將測序正確的陽性質(zhì)粒命名為 pET28(a)-G。

PCR 反應(yīng)條件：98 ℃ 預(yù)變性2 min，30 次擴(kuò)增循環(huán) (98 ℃、30 s；55 ℃、30 s；72 ℃、3 min)，72 ℃ 延伸 10 min。

2.2.3 重組質(zhì)粒pET28(a)-G的轉(zhuǎn)化與GFA的誘導(dǎo)表達(dá)

將 pET28(a)-G重組質(zhì)粒通過 CaCl2法轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)-Condon Plus感受態(tài)細(xì)胞，挑取單菌落接種到 5 mL LB 培養(yǎng)液中，37 ℃培養(yǎng)過夜，次日以2% 的接種量轉(zhuǎn)至 10 mL LB 培養(yǎng)液中，在菌體濃度OD600達(dá)到 0.6 后，加入 IPTG(異丙基硫代半乳糖苷，終濃度為 0.5 mmol×L-1)，16 ℃誘導(dǎo)過夜，取1 mL 菌液，12 000 r×min-1離心 2 min，收集菌體細(xì)胞，超聲破碎，5 000 r×min-1離心 10 min，用聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分別定性檢測沉淀和上清中重組GFA的表達(dá)量，并分析重組蛋白的可溶性。

2.2.4 SDS-PAGE蛋白電泳

將發(fā)酵液于10 000～12 000 r×min-1離心5 min，取上清液進(jìn)行SDS-PAGE電泳[11]。離心后所得沉淀用相同濃度的緩沖液溶解后，取樣進(jìn)行蛋白電泳。采用的聚丙烯酰胺濃度為12%，染色液為0.1% 的考馬斯亮藍(lán) R-250，脫色液配方中甲醇:水:乙酸(體積比)為2:7:1。

2.2.5 GFA酶活力測定

將1 mL 酶液加入2 mL的反應(yīng)體系中。反應(yīng)體系如下(終濃度)：

1 mmol×L-1底物(GLUPA)，1 mmol×L-1EDTA(乙二胺四乙酸)，1 mmol×L-1DTT(二硫蘇糖醇)，及0.5 mmol×L-1PMSF(苯甲基磺酰氟) 溶解于 20 mmol×L-1HEPES(4-羥乙基哌嗪乙磺酸) 緩沖液中，在pH為7.5，37 ℃下反應(yīng)10 min。反應(yīng)結(jié)束后，100 ℃煮沸5 min終止反應(yīng)，冷卻至室溫，將反應(yīng)體系置于420 nm下，利用分光光度計測量產(chǎn)物的吸光值度A420，以未加底物的反應(yīng)體系為空白對照。

測定酶活時，將單位時間(10 min)催化產(chǎn)生1 μmol對硝基苯胺的酶量(mL)定義為一個酶活單位。

2.2.6 GFA異源表達(dá)條件的優(yōu)化

1) 誘導(dǎo)時間的優(yōu)化

誘導(dǎo)時間分別為10、12、14、16、18、20 h，誘導(dǎo)結(jié)束后取酶液分別測定不同誘導(dǎo)時間條件下的GFA活力，確定最佳誘導(dǎo)時間。酶活測定條件同2.2.5節(jié)。

2) GFA最佳誘導(dǎo)溫度的確定

誘導(dǎo)溫度分別設(shè)定為15、20、25、30、35 ℃，誘導(dǎo)結(jié)束后取酶液分別測定不同誘導(dǎo)時間條件下的GFA活力，確定最佳誘導(dǎo)時間。酶活測定條件同2.2.5節(jié)。

3) GFA最佳誘導(dǎo)劑IPTG濃度的確定

在GFA誘導(dǎo)過程中，分別在每個培養(yǎng)基中加入終濃度為0.06、0.125、0.25、0.50、1.0、2.0 mmol×L-1的IPTG，誘導(dǎo)結(jié)束后取酶液分別測定不同誘導(dǎo)時間條件下的GFA活力，確定最佳誘導(dǎo)時間。酶活測定條件同2.2.5節(jié)。

4) GFA最適反應(yīng) pH 值的確定

分別配制不同pH的PBS緩沖液：pH值為5.6、5.8、6.0、6.3、6.5、7.0、8.0，取酶液分別測定不同 pH 條件下的GFA活力。其他條件同2.2.5節(jié)。

5) GFA最適反應(yīng)溫度的確定

將反應(yīng)溫度設(shè)為30、35、40、45、50、55、60、65和70 ℃，測定試樣在pH 7.0 時的GFA活力。

2.2.7 應(yīng)用雙倒數(shù)作圖法確定葡萄糖胺-6-磷酸合成酶的max(最大反應(yīng)速度)和M(米氏常數(shù))

分別配制濃度為0.1、0.2、0.5、1.0、2.0 mmol×L-1的底物，取5支試管，每支試管分別放入不同濃度的底物和2 mL的酶液，37 ℃水浴反應(yīng)30 min。以4 mL的水為空白對照。測量反應(yīng)體系的吸光度(A420)，計算出對硝基苯胺的濃度，然后以對硝基苯胺的生成速度倒數(shù)與底物濃度的倒數(shù)作圖，求出M及max。

2.2.8 Bacilysin對GFA的抑制作用研究

取5支試管，每支試管中加入1 mL的酶液，1 mL底物，1 mL 30 mg×mL-1的抑制劑，使抑制劑的終濃度為10 mg×mL-1。37 ℃水浴加熱，每隔20 min取一次樣，以純水為空白對照，測量A420，然后計算出酶活。

取5支試管，每個試管中加入2 mL的酶液和2 mL的底物，放在37 ℃水浴鍋中加熱，仍是每隔20 min取一次樣，以純水為空白對照，測量A420，然后計算出酶活。

3 結(jié)果與討論

3.1 葡萄糖胺-6-磷酸合成酶表達(dá)優(yōu)化的結(jié)果與分析

3.1.1 葡萄糖胺-6-磷酸合成酶的異源表達(dá)

圖1中標(biāo)記的條帶即為過表達(dá)的葡萄糖胺-6-磷酸合成酶，相對分子質(zhì)量約為80′103，與文獻(xiàn)報道的結(jié)果吻合(約78.4′103)[12-13]。由上圖可以明顯發(fā)現(xiàn)，在大腸桿菌BL21(DE3)Codon plus中過表達(dá)的GFA，基本處于可溶狀態(tài)，包涵體的成分較少，說明來源于致病菌細(xì)胞內(nèi)的葡萄糖胺-6-磷酸合成酶，可以在該宿主中正常表達(dá)。同時，通過后續(xù)酶活的測定(見3.2節(jié))表明，本研究中所得到的重組GFA蛋白基本為活性狀態(tài)的可溶性蛋白。

圖1 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果

(M: Marker G-S: Supernatant of the bacteria lysate G-C: precipitation of the bacteria lysate C-S: supernatant of the bacteria lysate (control) C-C:precipitation of the bacteria lysate (control))

3.1.2 誘導(dǎo)時間與酶活的關(guān)系

如圖2所示，加入IPTG對GFA的進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)后，酶活隨誘導(dǎo)時間延長而升高，這是因為IPTG不會被大腸桿菌代謝，從而產(chǎn)生持久的誘導(dǎo)效果；當(dāng)誘導(dǎo)時間為15 h時酶活達(dá)到最高，約為14.4 U×mL-1；繼續(xù)增加誘導(dǎo)時間，會造成酶活降低。這主要是由于IPTG對宿主細(xì)胞具有一定的毒性(抑制)作用，會造成細(xì)胞的裂解[14]、宿主細(xì)胞內(nèi)蛋白的降解[15]，從而影響外源蛋白的表達(dá)。隨著誘導(dǎo)時間的延長這種抑制作用越明顯[16]。因此，考慮到GFA的催化活性與生產(chǎn)效率，其最佳的誘導(dǎo)時間確定為15 h。

圖2 誘導(dǎo)時間對酶活的影響

3.1.3 誘導(dǎo)劑濃度的優(yōu)化

據(jù)報道，IPTG的攝取進(jìn)入細(xì)胞需要利用細(xì)胞膜表面的質(zhì)子泵，這會大大增加細(xì)胞生長的負(fù)擔(dān)，對細(xì)胞造成“毒性”，從而抑制菌體的生長及外源蛋白的表達(dá)[17-18]。因此，IPTG 終濃度是影響外源蛋白表達(dá)的重要因素之一。由圖3可知，隨著誘導(dǎo)劑濃度增加，酶活顯著提高。當(dāng)誘導(dǎo)劑的終濃度為0.1 mmol×L-1時，酶活最高，達(dá)到19.5 U×mL-1；但繼續(xù)增加誘導(dǎo)劑濃度，酶活又會表現(xiàn)出顯著的降低。因此，綜合各方面的考慮，在GFA的誘導(dǎo)表達(dá)過程中，誘導(dǎo)劑(IPTG)的濃度確定為0.1 mmol×L-1。

圖3 誘導(dǎo)劑濃度對酶活的影響

3.1.4 誘導(dǎo)溫度與酶活關(guān)系的結(jié)果分析

由圖4可知，誘導(dǎo)溫度對異源表達(dá)的GFA活性具有十分明顯的影響。隨著誘導(dǎo)溫度的增加(15～30 ℃)，酶活逐漸增加，當(dāng)30 ℃進(jìn)行誘導(dǎo)時，此時酶活達(dá)到最高約為18 U×mL-1。當(dāng)誘導(dǎo)溫度處于30～40 ℃時，酶活又逐漸降低。這是因為隨著溫度的升高，大腸桿菌繁殖速度加快，導(dǎo)致蛋白表達(dá)量急劇增加，從而增加其空間結(jié)構(gòu)折疊錯誤的概率，形成無活性的包涵體，導(dǎo)致酶活降低[19]。雖然大腸桿菌的最適生長溫度為37～38 ℃，但利用其作為宿主進(jìn)行外源蛋白的異源表達(dá)時，考慮到重組GFA蛋白的可溶性及其生化活性的維持，因此在進(jìn)行異源表達(dá)時采用相對較低的誘導(dǎo)溫度，約為28 ℃。

圖4 誘導(dǎo)溫度與酶活的關(guān)系

3.1.5 菌體濃度與酶活的關(guān)系

如圖5所示，誘導(dǎo)時機(jī)的不同將顯著影響外源蛋白的活力。隨著菌體濃度的增加，其經(jīng)過誘導(dǎo)所生產(chǎn)的酶，活力也隨之增加。當(dāng)OD600為1.0左右時，酶活最高，約34.1 U×mL-1；繼續(xù)培養(yǎng)，當(dāng)OD600超過1.0時，酶活會有所降低。這一方面可能是因為菌體濃度太高，瞬間表達(dá)的蛋白濃度較高，從而形成非正常折疊、無定型的包涵體，使酶活降低。另一方面，研究表明[20]，當(dāng)在宿主細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行蛋白的異源表達(dá)時，不同的誘導(dǎo)時機(jī)對宿主所造成的負(fù)擔(dān)不盡相同：指數(shù)期前期進(jìn)行誘導(dǎo)，對宿主所造成的負(fù)擔(dān)要遠(yuǎn)高于在指數(shù)期后期所造成的負(fù)擔(dān)。這不僅會造成外源蛋白表達(dá)量的下降，同時也會造成宿主細(xì)胞中一些非必須蛋白的生物合成，從而影響宿主細(xì)胞的生長速率。Dykhuizen等[21]指出，造成這種結(jié)果的原因主要涉及蛋白的轉(zhuǎn)錄與翻譯過程，與總蛋白濃度無關(guān)。因此，選擇一個恰當(dāng)?shù)恼T導(dǎo)時機(jī)(OD600為1.0左右)，無論對于GFA的表達(dá)量還是宿主細(xì)胞的生長速率都有重要的意義。

圖5 菌體濃度對酶活的影響

3.2 葡萄糖胺-6-磷酸合成酶的酶學(xué)性質(zhì)表征

3.2.1 反應(yīng)pH與酶活的關(guān)系

由圖6可知，在pH為7.2的時候，酶活最高，表明葡萄糖胺-6-磷酸合成酶的最適反應(yīng)pH為中性，偏酸或偏堿都會影響其結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，造成酶活降低。

圖6 反應(yīng)體系pH與緩沖液種類對酶活的關(guān)系

圖7 反應(yīng)溫度與酶活的關(guān)系

3.2.2 反應(yīng)溫度優(yōu)化與酶活的關(guān)系

由圖7可知，葡萄糖胺-6-磷酸合成酶酶活最高點所對應(yīng)的溫度是37 ℃，在37 ℃之前，酶活隨著溫度升高而增加，這是因為在一定溫度范圍內(nèi)，溫度升高會使分子熱運(yùn)動加速，從而提高化學(xué)反應(yīng)速率；但酶的本質(zhì)是蛋白質(zhì)，溫度過高會破壞其空間結(jié)構(gòu)。所以隨著溫度的持續(xù)升高，酶活會顯著降低。

3.2.3 雙倒數(shù)作圖確定最大反應(yīng)速度與反應(yīng)速率

通過對硝基苯胺的生成速度倒數(shù)與底物濃度的倒數(shù)作圖(Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖)，如圖8所示，得到雙倒數(shù)方程(double-reciprocal plot)：=0187 9+0.040 32(2=0.992 59)，圖中，為反應(yīng)速度，substrate為底物質(zhì)量濃度，其中橫軸截距為-1/M，縱軸截距為1/max。由雙倒數(shù)字方程可獲得最大反應(yīng)速度max和反應(yīng)速率M，當(dāng)=0時，=1/max，即max=24.80 mg×(mL×min)-1；當(dāng)=0時，=-1/M，M=0.47 mg×mL-1，即當(dāng)反應(yīng)速率達(dá)到1/2max時，substrate為0.47 mg×mL-1。

圖8 雙倒數(shù)作圖分析GFA酶學(xué)性質(zhì)

3.2.4 葡萄糖胺-6-磷酸合成酶作為抗真菌靶點的應(yīng)用

前期研究發(fā)現(xiàn)，bacilysin是一種新型的、高效的抗真菌化合物[22]。由于bacilysin在結(jié)構(gòu)上屬于谷氨酰胺的結(jié)構(gòu)類似物，因而探索其對谷氨酰胺類化合物的代謝過程調(diào)控具有重要的意義。本研究中，當(dāng)在GFA的反應(yīng)體系中加入bacilysin后，其轉(zhuǎn)氨酶活性明顯降低，20 min內(nèi)其殘余酶活僅剩45.2%，且隨著時間的延長，該酶的催化活力劇烈下降(圖9)。這與作者之前的研究結(jié)果吻合，其最低抑菌濃度達(dá)到1.8 μg×mL-1[23]。這主要是由于抑制N-乙酰--葡糖胺的生成，造成白色念珠菌的細(xì)胞壁無法正常合成[24]，實現(xiàn)高效的抗真菌作用。

圖9 Bacilysin對GFA酶活的抑制作用

4 結(jié) 論

通過本研究，在大腸桿菌BL21(DE3) Codon plus中成功表達(dá)來源于致病菌白色假絲酵母(ATCC 64548)中、具有活性的葡萄糖-6-磷酸合成酶。通過誘導(dǎo)條件優(yōu)化，得到GFA的最佳異源表達(dá)條件為：誘導(dǎo)劑濃度為0.1 mmol×L-1；誘導(dǎo)溫度為28 ℃；誘導(dǎo)時間為15 h；誘導(dǎo)時機(jī)為OD600達(dá)到1.0。

確定了最佳的反應(yīng)條件：反應(yīng)溫度為37 ℃；反應(yīng)pH為7.2，反應(yīng)時間為20 min，通過雙倒數(shù)方程確定米氏常數(shù)M為0.47 mg×mL-1。在此基礎(chǔ)上探索其在抗真菌領(lǐng)域的應(yīng)用，當(dāng)反應(yīng)體系中加入抑制劑(bacilysin)時，GFA轉(zhuǎn)氨酶活性會顯著降低54.8 %，且隨著時間的增加抑制作用越明顯。

本研究對于進(jìn)一步提高葡萄糖胺-6-磷酸合成酶的應(yīng)用潛力，加快新型抗真菌藥物的研發(fā)具有重要意義。

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Heterologous expression and enzymatic characterization of glucosamine-6-phosphate synthase

WANG Tao1, FENG Jun-rui1, LI Shu-xuan1, DU Xiang1, LIU Xiao-huan1, WU Mian-bin2

(1. School of Biological Science, Jining Medical University, Rizhao 276826, China;2. Key Laboratory of Biomass Chemical Engineering of Ministry of Education,College of Chemical and Biological Engineering, Zhejiang University, Hangzhou 310027, China)

Glucosamine-6-phosphate synthase (GFA) is a key enzyme in the biosynthesis of hexosamine. In order to establish an efficient GFA production process, the heterologous expression of GFA from pathogenic bacteriumATCC 64548 was expressed inBL21(DE3) Codon plus. The results show that the optimal expression conditions of GFA were: the concentration of IPTG 0.1 mmol×L-1; induction temperature 28 ℃; induction time 15 h; induction timing (OD600) reaching 1.0. The optimum reaction conditions were determined as: reaction temperature 37 ℃; reaction pH 7.2, and reaction time 20 min. TheMvalue of GFA was determined as 0.47 mg×mL-1by Lineweaver-Burk. When the inhibitor (bacilysin) was added, the transaminase activity of GFA was significantly inhibited and reduced by 54.8 %. With the method developed in this study, glucosamine-6-phosphate synthase could be expressed heterologously, which would greatly increase its application and help accelerate the development of new antifungal drugs.

glucosamine-6-phosphate synthase; heterologous expression; enzymatic characterization; antifungal target

Q 556.9

A

10.3969/j.issn.1003-9015.2021.03.015

1003-9015(2021)03-0500-07

2019-06-11；

2019-08-30。

山東省自然科學(xué)基金博士基金(ZR2019BB062)；2019年大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃(201910443059)。

王濤(1988-)，男，山東青島人，濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院副教授，博士。

王濤，E-mail：tao-wang@zju.edu.cn