陳溪雯，錢(qián)亞云

揚(yáng)州大學(xué)醫(yī)學(xué)院（揚(yáng)州大學(xué)轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究院）/國(guó)家中醫(yī)藥管理局胃癌毒邪論治重點(diǎn)研究室，江蘇 揚(yáng)州 225001

胃癌是起源于胃黏膜上皮的惡性腫瘤，腺癌是其中最常見(jiàn)的病理類型。早期胃癌多無(wú)特殊癥狀，易被患者忽視，多數(shù)患者確診時(shí)已處于晚期，錯(cuò)過(guò)了最佳的手術(shù)治療時(shí)機(jī)，只能選擇放化療?；熕幬飳?duì)腫瘤細(xì)胞無(wú)選擇特異性，在殺死腫瘤細(xì)胞的同時(shí)，也會(huì)影響正常細(xì)胞的功能，不良反應(yīng)明顯，增加了患者的身心負(fù)擔(dān)。

從中藥中尋找抗腫瘤活性成分逐漸受到臨床的重視，也是將傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)與現(xiàn)代科學(xué)相結(jié)合的重要方式。臨床研究及基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)表明，艾迪注射液在提高機(jī)體免疫力、抗腫瘤治療等方面的效果較好。

雷帕霉素靶蛋白（mechanistic target of rapamycin kinase，MTOR）信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在生理和病理?xiàng)l件下對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)等多個(gè)方面均發(fā)揮至關(guān)重要的作用，能夠?qū)Χ喾N腫瘤細(xì)胞進(jìn)行修飾，包括增殖、分化、運(yùn)動(dòng)性和細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸?shù)龋鼓[瘤細(xì)胞對(duì)抗腫瘤療法產(chǎn)生抗性。MTOR通路的異常激活可調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的自噬、凋亡、轉(zhuǎn)移、上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelialmesenchymal transition，EMT）等方面，對(duì)艾迪注射液可能的分子機(jī)制進(jìn)行探討有重要意義。

人胃癌HGC-27細(xì)胞源自未分化的胃癌組織，與其他分化程度的胃癌細(xì)胞相比，人胃癌HGC-27細(xì)胞惡性程度較高，未分化胃癌患者的預(yù)后差，這與艾迪注射液臨床適用條件相符。本文探討不同濃度的艾迪注射液對(duì)HGC-27細(xì)胞增殖和遷移能力的影響及其可能相關(guān)的信號(hào)通路，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、主要試劑和儀器

野生型人胃癌HGC-27細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院研究所上海細(xì)胞庫(kù)。艾迪注射液購(gòu)自貴州益佰制藥股份有限公司，注射用順鉑購(gòu)自齊魯制藥有限公司。兔抗人單克隆抗體β-actin、蛋白激酶B（protein kinase B，PKB，又稱AKT）、MTOR、真核翻譯起始因子4E結(jié)合蛋白1（eukaryotic translation initiation factor 4E binding protein 1，4EBP1）、磷酸化的4EBP1（phospho-4EBP1，p-4EBP1）均購(gòu)自美國(guó) Cell Signaling公司，兔抗免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）購(gòu)自美國(guó)ABclonal公司，胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司，RPMI-1640培養(yǎng)基購(gòu)自北京索萊寶公司；二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自美國(guó)Biosharp公司，噻唑藍(lán)（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）購(gòu)自美國(guó)Corning公司，二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司。無(wú)菌6孔細(xì)胞培養(yǎng)板、無(wú)菌96孔細(xì)胞培養(yǎng)板均購(gòu)自美國(guó)Costar公司；恒溫培養(yǎng)箱、酶標(biāo)儀、臺(tái)式離心機(jī)均購(gòu)自美國(guó)Thermo公司，蛋白電泳槽、全自動(dòng)多功能酶標(biāo)儀、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）凝膠成像分析儀均購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司，逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）儀購(gòu)自瑞士Roch公司，倒置顯微鏡購(gòu)自日本Olympus公司，制冰機(jī)購(gòu)自德國(guó)Scotsman公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 采用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，并置于5% CO、37℃的無(wú)菌恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每天觀察細(xì)胞狀態(tài)并及時(shí)更換培養(yǎng)液，將細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，采用胰酶細(xì)胞消化液將細(xì)胞消化進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 MTT 法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人胃癌HGC-27細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×10/孔，接種于96孔板，采用RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h后，棄上清。分別加入 0、7.5、15.0、30.0、60.0、120.0 mg/ml艾迪注射液的RPMI 1640培養(yǎng)基100 μl，分別作用24、48、72 h后，每孔加入0.5%的MTT溶液20 μl，37℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，棄上清。每孔加入150.0 μl的DMSO，低速振蕩10 min，采用多功能酶標(biāo)儀于490 nm處測(cè)量各孔吸光度（A）。

1.2.3 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人胃癌HGC-27細(xì)胞接種于6孔板，待細(xì)胞鋪滿后，于每孔中線處劃痕，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered solution，PBS）沖洗3次，洗去漂浮細(xì)胞，倒置顯微鏡下觀察刮痕內(nèi)無(wú)細(xì)胞。0、7.5、15.0、30.0、60.0、120.0 mg/ml艾迪注射液培養(yǎng)人胃癌HGC-27細(xì)胞48 h后，半數(shù)抑制濃度（50% concentration of inhibition，IC）為 20.17 mg/ml。后續(xù)實(shí)驗(yàn)將6.0、12.0、24.0 mg/ml艾迪注射液處理的人胃癌HGC-27細(xì)胞分別設(shè)置為低濃度組、中濃度組、高濃度組，以野生型HGC-27細(xì)胞作為空白對(duì)照組，2.0 mg/L順鉑處理的人胃癌HGC-27細(xì)胞作為陽(yáng)性對(duì)照組，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，于倒置相差顯微鏡下拍照記錄各孔劃痕的距離。細(xì)胞遷移率（%）=100%-未遷移率，未遷移率（%）=培養(yǎng)24 h空白面積/培養(yǎng)0 h空白面積×100%。

1.2.4 蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）檢測(cè)AKT、MTOR、4EBP1、p-4EBP1蛋白的相對(duì)表達(dá)量 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期低濃度組（6.0 mg/ml）、中濃度組（12.0 mg/ml）、高濃度組（24.0 mg/ml）人胃癌HGC-27細(xì)胞，以及空白對(duì)照組和陽(yáng)性對(duì)照組人胃癌HGC-27細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×10/孔，接種于6孔板內(nèi)，培養(yǎng)48 h后，提取細(xì)胞總蛋白，BCA法測(cè)定濃度。經(jīng)過(guò)SDSPAGE電泳，轉(zhuǎn)膜90 min，采用含5%脫脂奶粉的TBST封閉2 h，加入一抗（濃度為1∶1000），4 ℃孵育過(guò)夜。TBST清洗3遍，加入二抗（濃度為1∶2000），室溫孵育2 h，TBST清洗3遍，電化學(xué)發(fā)光（electrochemiluminescence，ECL）法采集并分析圖像，計(jì)算AKT、MTOR、4EBP1、p-4EBP1蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞增殖能力的比較

隨艾迪注射液濃度的升高，培養(yǎng)24、48、72 h，人胃癌HGC-27細(xì)胞A值均逐漸降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

＜0.05）；但60.0 mg/ml與120.0 mg/ml艾迪注射液處理的人胃癌HGC-27細(xì)胞培養(yǎng)48、72 h時(shí)A值比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

＞0.05）。（表 1）

表1 不同濃度艾迪注射液處理的人胃癌HGC-27細(xì)胞培養(yǎng)不同時(shí)間的A值比較（±s）

2.2 細(xì)胞遷移能力的比較

培養(yǎng)24 h，低濃度組、中濃度組、高濃度組人胃癌HGC-27細(xì)胞未遷移率均高于空白對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

＜0.05）。高濃度組人胃癌HGC-27細(xì)胞未遷移率均高于低濃度組和中濃度組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

＜0.05），但低濃度組與中濃度組人胃癌HGC-27細(xì)胞未遷移率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

＞0.05）。陽(yáng)性對(duì)照組人胃癌HGC-27細(xì)胞未遷移率高于空白對(duì)照組，但低于中濃度組和高濃度組細(xì)胞，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

＜0.05）。（表2）

表2 不同組別人胃癌HGC-27細(xì)胞未遷移率比較（%，±s）

2.3 AKT、MTOR、4EBP1、p-4EBP1蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

低濃度組和中濃度組人胃癌HGC-27細(xì)胞AKT、4EBP1、p-4EBP1蛋白相對(duì)表達(dá)量均低于空白對(duì)照組，且中濃度組人胃癌HGC-27細(xì)胞MTOR蛋白的相對(duì)表達(dá)量低于空白對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

＜0.05）。高濃度組人胃癌HGC-27細(xì)胞AKT、MTOR、4EBP1、p-4EBP1蛋白相對(duì)表達(dá)量均低于低濃度組和中濃度組，中濃度組人胃癌HGC-27細(xì)胞AKT蛋白的相對(duì)表達(dá)量高于低濃度組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

＜0.05），但低濃度組和中濃度組人胃癌HGC-27細(xì)胞MTOR、4EBP1、p-4EBP1蛋白相對(duì)表達(dá)量比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

＞0.05）。（表3）

表3 不同組別人胃癌HGC-27細(xì)胞中AKT、MTOR、4EBP1、p-4EBP1蛋白相對(duì)表達(dá)量的比較（±s）

3 討論

胃癌的發(fā)病率、轉(zhuǎn)移率和病死率均較高，早期診斷率較低，根治性切除率和患者5年生存率也均較低。中醫(yī)藥是惡性腫瘤綜合治療的重要部分，主要目的是穩(wěn)定瘤體，改善患者的臨床癥狀、延長(zhǎng)生存期、提高生活質(zhì)量。艾迪注射液是常用的純中藥復(fù)方制劑，其主要成分中的人參、黃芪、斑蝥、刺五加有廣泛的生物活性。李瑞青采用艾迪注射液聯(lián)合化療治療62例老年晚期胃癌，結(jié)果顯示，與單純化療相比，中藥聯(lián)合化療能夠明顯緩解患者的癌因性疲乏程度，提高生活質(zhì)量，延長(zhǎng)生存期。劉沙河系統(tǒng)評(píng)價(jià)了艾迪注射液對(duì)緩解化療不良反應(yīng)的作用，結(jié)果顯示，艾迪注射液能有效減少化療患者白細(xì)胞計(jì)數(shù)和血小板計(jì)數(shù)降低的風(fēng)險(xiǎn)，減少外周神經(jīng)毒性反應(yīng)，減少消化道不良反應(yīng)。

本研究結(jié)果顯示，不同濃度的艾迪注射液處理人胃癌HGC-27細(xì)胞24、48、72 h后，細(xì)胞的增殖能力受到明顯抑制，呈現(xiàn)出濃度與時(shí)間的依賴性，表明艾迪注射液可明顯抑制HGC-27細(xì)胞的生長(zhǎng)能力。艾迪注射液的主要成分為斑蝥，對(duì)正常細(xì)胞有一定毒性，因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)中分別設(shè)置低濃度組、中濃度組、高濃度組，并研究其作用機(jī)制，希望在毒性較低的情況下，發(fā)揮最佳的抗腫瘤作用。劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組細(xì)胞相比，艾迪注射液處理的人胃癌HGC-27細(xì)胞向空白處遷移的能力受到明顯抑制，表明艾迪注射液可能通過(guò)抑制胃癌細(xì)胞的遷移發(fā)揮抗腫瘤作用。

斑蝥是艾迪注射液的主要抗腫瘤成分，為加強(qiáng)斑蝥的抗腫瘤效果，減少毒性，又添加了益氣、活血的人參、黃芪、刺五加。艾迪注射液作為抗腫瘤藥物的分子機(jī)制尚未探明，但已有針對(duì)其成分的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究。陳慕媛等研究發(fā)現(xiàn)，去甲斑蝥酸鈉處理胰腺癌PANC-1細(xì)胞后，p-PI3K和p-AKT蛋白的表達(dá)均下調(diào)，提示去甲斑蝥酸鈉可能通過(guò)調(diào)節(jié)PI3K/AKT通路，下調(diào)B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2（B cell lymphoma/leukemia-2，Bcl-2）蛋白的表達(dá)，上調(diào)Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bcl-2-associated X protein，BAX）和caspase 3蛋白的表達(dá)。陳佳欣等研究發(fā)現(xiàn)，人參皂苷Compound K（CK）能夠抑制人肝癌細(xì)胞BEL-7404的增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞自噬，下調(diào)AKT/MTOR通路相關(guān)蛋白AKT、p-AKT、MTOR、p-MTOR的表達(dá)，表明人參皂苷CK可以通過(guò)調(diào)控AKT/MTOR信號(hào)通路誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞BEL-7404的自噬。

MTOR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是一條酪氨酸激酶級(jí)聯(lián)信號(hào)通路，是細(xì)胞生存通路之一。AKT是磷脂酰肌醇-3-羥激酶（phosphatidylinositol 3-hydroxy kinase，PI3K）下游的主要分子，活化的AKT能夠磷酸化下游的多種蛋白，如核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）、MTOR和p21基因等來(lái)介導(dǎo)細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、細(xì)胞周期和糖代謝。MTOR是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，由MTORC1和MTORC2兩種多蛋白復(fù)合物構(gòu)成。MTORC1的主要功能是通過(guò)激活和磷酸化下游分子4EBP1來(lái)調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)合成和細(xì)胞生長(zhǎng)。AGC激酶由cAMP依賴的蛋白激酶（cAMP-dependent protein kinase，PKA）、cGMP依賴的蛋白激酶（cGMP-dependent protein kinase，PKG）和磷脂依賴的蛋白激酶C（phospholipid-dependent protein kinase C，PKC）組成。研究表明，MTORC2能夠磷酸化AGC激酶家族中AKT的C端疏水模體，對(duì)生長(zhǎng)因子信號(hào)作出響應(yīng)。兩種復(fù)合物相互調(diào)節(jié)，從而促進(jìn)蛋白合成、生長(zhǎng)因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)和遷移。

為進(jìn)一步研究艾迪注射液的抗腫瘤作用機(jī)制，本研究觀察了MTOR信號(hào)通路在其中的作用，結(jié)果顯示，不同濃度艾迪注射液處理后的HGC-27細(xì)胞中AKT、MTOR、4EBP1、p-4EBP1蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯降低。表明艾迪注射液可能通過(guò)抑制MTOR信號(hào)通路活化，發(fā)揮抗腫瘤作用。

綜上所述，艾迪注射液可能通過(guò)抑制AKT、MTOR、4EBP1、p-4EBP1等MTOR信號(hào)通路相關(guān)蛋白而發(fā)揮抗腫瘤作用。但腫瘤細(xì)胞的作用機(jī)制較為復(fù)雜，艾迪注射液是否還通過(guò)其他途徑發(fā)揮抗腫瘤作用，尚有待后續(xù)研究。