鄭娛 翟新宇 王琛

摘要 目的：探討補中益氣湯治療壓力性尿失禁（Stress Urinary Incontinence，SUI）的分子作用機制。方法：運用中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺（TCMSP）檢索出補中益氣湯的藥物有效活性成分及其作用靶點。利用GeneGards、OMIM疾病數(shù)據(jù)庫篩選出該病靶點，借助Cytoscape3.7.2軟件構建出補中益氣湯中藥的活性成分-靶點網(wǎng)絡和蛋白質-蛋白質相互作用（PPI）網(wǎng)絡，采用R軟件對靶基因進行基因本體論（Gene Ontology，GO）分析和京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路的分析。結果：共得到補中益氣湯有效活性成分182個，通過116個潛在靶標作用于SUI，富集得到GO中2 115個生物過程條目和144條KEGG通路。結論：補中益氣湯主要通過槲皮素、山萘酚、7-甲氧基-2-甲基異黃酮、7-O-甲基異丁香酚、利可考酮、β-谷固醇、福莫寧、美迪紫檀素、柚皮苷、糖醇等活性成分調節(jié)SELE、ICAM1、MMP3、MAPK14、CD40LG、PLAU、CCNA2、ERBB3、CASP1關鍵靶點，調控糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路、膀胱癌信號通路、流體剪切應力與動脈粥樣硬化信號通路、TNF信號通路、前列腺癌信號通路、胰腺癌信號通路、乙型肝炎信號通路等多條通路來治療SUI。

關鍵詞 網(wǎng)絡藥理學;補中益氣湯;壓力性尿失禁;機制

Abstract Objective：To explore the molecular mechanism of Buzhong Yiqi Decoction in the treatment of stress urinary incontinence（SUI）.Methods：Effective active ingredients and action targets of Buzhong Yiqi Decoction were retrieved with the aid of TCMSP while the disease targets were screened out using GeneGards and OMIM databases.The active ingredient of Buzhong Yiqi Decoction-target network and PPI network were established using Cytoscape 3.7.2 software.And then using R software the gene function of the target gene（Gene Ontology，GO）and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）pathway analysis were annotated.Results：A total of 182 effective active ingredients of Buzhong Yiqi Decoction were obtained，and 116 potential targets can act on SUI.GO functional enrichment analysis obtained 2 115 GO itemsin total.KEGG pathway enrichment analysis obtained 20 pathways.Conclusion：Buzhong Yiqi Decoction mainly through quercetin，kaempferol，7-methoxy-2-methyl isoflavone，7-O-methyl isoeugenol，riccocodone，β-sitosterol，formonine，medicinal pterostilbene，naringin，sugar alcohol and other active ingredients regulates key targets of SELE，ICAM1，MMP3，MAPK14，CD40LG，PLAU，CCNA2，ERBB3，CASP1，and regulates AGE-RAGE in diabetic complications Signal pathways，bladder cancer signaling pathways，fluid shear stress and atherosclerosis signaling pathways，TNF signaling pathways，prostate cancer signaling pathways，pancreatic cancer signaling pathways，hepatitis B signaling pathways and other pathways so that SUI can be treated.

Keywords Network pharmacology; Buzhong Yiqi Decoction; Stress urinary incontinence; Mechanism

中圖分類號：R694+.54;R271.9;R285;TN711.1文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.07.007

女性尿失禁是目前全球最為常見的健康問題之一，隨著人口的老齡化和人們生活水平的提高，女性出現(xiàn)尿失禁的狀況越來越受到各方重視。近年流行病學的調查結果表示，成年女性的尿失禁發(fā)病率在18.5%～57.5%，而且隨年齡的增長而上升[1]。在所有類型的尿失禁當中，壓力性尿失禁（Stress Urinary Incontinence，SUI）是最為常見的。國際尿控協(xié)會（International Continence Society，ICS）將SUI定義為：當腹部壓力突然增加，例如運動，打噴嚏或咳嗽時，患者會出現(xiàn)不自主的尿液溢出[2]。SUI常見于年老體弱、妊娠分娩損傷、絕經(jīng)、肥胖等女性患者。國內尿失禁發(fā)病率約30%，而其中SUI約占尿失禁總數(shù)的42.6%[3]。中國女性的壓力性尿失禁發(fā)病率達18.9%，其中老年女性的發(fā)病率約為30%[4]。目前的治療方案以行為矯正和保守治療為主。中醫(yī)將壓力性尿失禁歸屬類于“遺溺”“遺尿”或“淋證”的范疇，中藥治療壓力性尿失禁多從脾腎二臟論治，脾腎氣虛，固攝無力。補中益氣湯出自《脾胃論》，該方由白術、黃芪、當歸、陳皮、甘草、柴胡、人參、升麻組成，主要功效為補中益氣、升陽舉陷。肖春風等[5]用補脾氣溫腎陽為治法，針對中氣虧虛、腎陽不足型尿失禁。觀察組給予補中益氣湯為底加上健脾溫中、溫腎固精之藥，結論總有效率達87.68%。張愛華[6]則認為SUI多因脾腎氣虛、膀胱失約導致，臨床運用補中益氣丸聯(lián)合知柏地黃丸治療，總有效率達到93.94%。邵朝弟教授提出了補中益氣湯不僅能補益中氣，還具有補益肺氣的功效，對于腹壓過高而導致的尿失禁療效顯著[7]。本研究采用中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺（TCMSP）數(shù)據(jù)庫篩選出補中益氣湯中8味藥的化學活性成分及相應靶點，而后與GeneGards、OMIM數(shù)據(jù)庫中與SUI對應靶點相交，作蛋白質-蛋白質相互作用（PPI）網(wǎng)絡分析并篩選核心蛋白，進行GO和京都基因與基因組百科全書（KEGG）富集分析。最終以闡明補中益氣湯治療SUI的分子藥理機制，為補中益氣湯的臨床應用提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 篩選補中益氣湯中藥活性成分，估測潛在作用靶點 借助TCMSP數(shù)據(jù)庫搜索出補中益氣湯8味藥的活性成分，以口服生物利用度（OB）和類藥性（DL）作為篩選條件，定OB>30%、DL>0.18為篩選標準，由此可得到符合條件的活性成分靶點信息，而后通過Uniport數(shù)據(jù)庫使得基因名標準化[8-9]。

1.2 預測壓力性尿失禁疾病靶點 在GeneCards數(shù)據(jù)庫和OMIM數(shù)據(jù)庫中以“Stress Urinary Incontinence”為關鍵詞檢索出與壓力性尿失禁相關的基因。

1.3 構建中藥-活性成分-靶點基因網(wǎng)絡圖 運用Cytoscape軟件構建疾病-活性成分-關鍵靶基因網(wǎng)絡圖[10]。網(wǎng)絡中的節(jié)點（Node）代表疾病、活性成分和關鍵靶基因;網(wǎng)絡中的邊（Edge）用于連接疾病和活性成分、活性成分和關鍵靶基因。連接到網(wǎng)絡的節(jié)點以度值（Degree）為單位表示[11]，一個節(jié)點連接到其他節(jié)點的邊越多，其重要性就越大，節(jié)點在網(wǎng)絡中所起的作用及程度值越大，通過Cytoscape軟件構建出中藥-活性成分-關鍵靶基因網(wǎng)絡圖。

1.4 構建PPI網(wǎng)絡，篩選核心靶點 將中藥活性成分潛在作用靶點與疾病預測相關靶點取交集，導入至STRING數(shù)據(jù)庫，物種選擇為“Homosapiens”，以置信度>0.4為篩選條件，可以得到交集靶點的PPI網(wǎng)絡信息，通過degree、closeness、betweenness等條件篩選出前10個關鍵基因（HubGene），利用Cytoscape軟件將其可視化[12]。

1.5 富集分析靶點基因 將補中益氣湯作用于SUI的所有靶點導入DAVID數(shù)據(jù)庫，進行GO分析和KEGG通路富集分析，用R包（ggplot2）繪圖將其可視化。

1.6 構建基因-通路網(wǎng)絡 將篩選得到的信號通路和富集得到的信息，使用Cytoscape軟件構建出基因-信號通路網(wǎng)絡圖，并將其可視化。

2 結果

2.1 補中益氣湯活性成分的篩選及潛在作用靶點的收集 通過TCMSP檢索到符合篩選標準的補中益氣湯活性成分共有182個，其中甘草92個，人參22個，黃芪20個，柴胡17個，升麻17個，白術7個，陳皮5個，當歸2個。然后將得到的活性成分預測作用靶點導入到Uniprot數(shù)據(jù)庫進行標準化，刪除重復值，最后可得到靶點基因共232個。

2.2 壓力性尿失禁靶點的收集 利用GenCards、OMIM疾病數(shù)據(jù)庫分別獲得SUI潛在靶點1 766、45個，整合后共有1 811個SUI相關靶點。

2.3 中藥-活性成分-靶點網(wǎng)絡圖分析 將篩選得到的補中益氣湯所有作用靶點232個和疾病所有相關靶點1 811個進行重復比較，最終得到116個交集靶點，說明補中益氣湯可通過116個靶點作用于SUI。

2.4 PPI網(wǎng)絡分析 將2.3中獲得的116個靶標導入至STRING網(wǎng)站進行靶基因之間的PPI分析，得到PPI網(wǎng)絡圖，并篩選出關聯(lián)性為前10的Hub基因，分別為SELE、ICAM1、MMP3、MAPK14、CD40LG、PLAU、CCNA2、ERBB3、CASP1，表明這些基因在補中益氣湯治療SUI的過程中具有重要意義。

2.5 GO功能富集與KEGG通路富集分析 將最終得到的116個作用靶點用DAVID數(shù)據(jù)庫進行GO與KEGG富集分析，結果共有2 115條生物功能顯著富集（P<0.05），1 869個在生物過程（BP）中富集，84個在細胞成分（CC）中富集，162個在分子功能（MF）中富集。顯示的GO富集分析中存在3大類，即生物過程（BP）、細胞組分（CC）和分子功能（MF）。在生物過程分析中，主要涉及對抗生素的反應（Response to Antibiotic）、對脂多糖的反應（Response to Lipopolysaccharide）、對細菌來源分子的反應（Response to Molecule of Bacterial Origin）、對金屬離子的反應（Response to Metalion）、對乙醇的反應（Response to Alcohol）等。在細胞組分分析中，主要涉及膜筏（Membrane Raft）、膜微區(qū)（Membrane Microdomain）、膜區(qū)（Membrane Region）、小窩（Caveola）、質膜筏（Plasma Membrane Raft）等。在分子功能分析中，主要涉及核受體活性（Nuclear Receptor Activity）、轉錄因子活性，直接的配體調控序列-特異性DNA結合（Transcription Factor Activity，Direct Ligand Regulated Sequence-specific DNA Binding）、磷酸酶結合（Phosphatase Binding）、蛋白磷酸酶結合（Protein Phosphatase Binding）、激酶調節(jié)活性（Kinase Regulator Activity）等。

按照KEGG通路富集分析的P-value值排名，可以富集得到20條通路。補中益氣湯的關鍵靶點主要富集的通路有以下：糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路（AGE-RAGE Signaling Pathway in Diabetic Complications）、膀胱癌（Bladder Cancer）信號通路、前列腺癌（Prostate Cancer）信號通路、胰腺癌（Pancreatic Cancer）信號通路、流體剪切應力與動脈粥樣硬化（Fluid Shear Stress and Atherosclerosis）信號通路、乙型肝炎（Hepatitis B）信號通路、TNF信號通路（TNF Signaling Pathway）、內分泌抵抗（Endocrine Resistance）信號通路、卡波西氏肉瘤相關皰疹病毒感染（Kaposi Sarcoma-associated Herpesvirus Infection）信號通路、戊型肝炎（Hepatitis C）信號通路、IL-17信號通路（IL-17 Signaling Pathway）、非小細胞肺癌（Non-small Cell Lung Cancer）信號通路、愛潑斯坦巴爾病毒感染（Epstein-Barr Virus Infection）信號通路、鉑耐藥（Platinum Drug Resistance）信號通路、小細胞肺癌（Small Cell Lung Cancer）信號通路、PI3K-AKT信號通路（PI3K-AKT Signaling Pathway）、人巨細胞病毒感染（Human Cytomegalovirus Infection）信號通路、麻疹（Measles）信號通路、癌癥中的蛋白聚糖（Proteoglycans in Cancer）信號通路、大腸癌（Colorectal Cancer）信號通路。結果表明，補中益氣湯的活性成分靶點分布于不同的信號通路，說明補中益氣湯可以通過對各條通路的協(xié)調作用達到治療SUI的目的。

2.6 基因-通路網(wǎng)絡分析 利用Cytoscape軟件構建通路-活性成分-核心靶點網(wǎng)絡，其中包含了9個核心目標基因和20條通路。圖形面積越大則代表目標基因或者通路在其中發(fā)揮的作用越大。

3 討論

中醫(yī)學中并無尿失禁的病名記載，據(jù)癥狀多歸屬于“遺溺”范疇。壓力性尿失禁是尿失禁中最常見的類型，其臨床表現(xiàn)主要是當患者做咳嗽、運動、大笑等使腹壓突然增加的動作時，尿液會不自主地從尿道口流出，嚴重者在日常生活活動時也會出現(xiàn)，這嚴重影響了患者的生命質量，損害患者的身心健康[13]。中醫(yī)理論認為SUI的病因病機為沖任不固、提攝無力，治療宜健脾益氣與補腎固攝。《全書·婦人規(guī)》有“或因分娩過勞，或因郁熱下墜，或因氣虛下脫，大都此癥當以升陽補氣，固澀真陰為主”之論述[14]。補中益氣湯方中黃芪味甘微溫，入脾肺經(jīng)，補中益氣，升陽固表，故為君藥。配伍人參、炙甘草、白術，補氣健脾為臣藥。當歸養(yǎng)血和營，協(xié)人參、黃芪補氣養(yǎng)血;陳皮理氣和胃，使諸藥補而不滯，共為佐藥。少量升麻、柴胡升陽舉陷，協(xié)助君藥以升提下陷之中氣，共為佐使。炙甘草調和諸藥為使藥。本研究借以補中益氣湯的化學成分、靶點及通路信息等多項數(shù)據(jù)，構建網(wǎng)絡對其功能分析，系統(tǒng)預測其對SUI多成分、多靶標的可能分子機制。

SUI的病理機制尚不明確，有研究表明該病的發(fā)生與盆底-組織異常膠-原代謝相關[15]，影響膠原-代謝的因素有很多，期間涉及多個功能蛋白和代謝通路。周菲菲等[16]研究探討加味補中益氣湯是否通過成纖維細胞膠原代謝治療女性壓性尿失禁。結果表明加味補中益氣湯干預后I膠原蛋白及Ⅲ膠原蛋白的mRNA表達，增加尿道支撐組織的膠原含量以改善SUI癥狀。艾陽等[17]通過體外細胞培養(yǎng)研究補中益氣湯治療盆底功能障礙性疾?。òㄅ枨慌K器脫垂和壓力性尿失禁）的作用機制，結果顯示補中益氣湯對TGF-β3、COL1A1、COL3A1的表達都具有上調作用。本研究基于網(wǎng)絡藥理學，分析補中益氣湯治療SUI的分子機制。發(fā)現(xiàn)補中益氣湯中的116種成分具有治療SUI的功效，篩選得到前10個關鍵活性成分為：槲皮素、山萘酚、7-甲氧基-2-甲基異黃酮、7-O-甲基異丁香酚、利可考酮、β-谷固醇、福莫寧、美迪紫檀素、柚皮苷、糖醇。分析得槲皮素是補中益氣湯的主要的活性成分，存在于黃芪和甘草中，研究表明槲皮素是廣泛的激酶抑制劑能調節(jié)多種細胞信號傳導途徑，主要包括細胞凋亡，細胞周期停滯，核因子κB途徑，MAPK途徑，PI3K-AKT途徑和mTOR[18]。山萘酚可以調節(jié)核因子κB、Notch等信號通路起到抗癌、抗氧化、抗病毒、抗炎、抗菌、增強機體免疫等多種藥理作用[19]。幾種關鍵活性成分與疾病作用靶點聯(lián)系緊密，且來源于補中益氣湯的君藥和臣藥。通過PPI網(wǎng)絡圖分析可知補中益氣湯主要通過SELE、ICAM1、MMP3、MAPK14、CD40LG、PLAU、CCNA2、ERBB3、CASP1靶點發(fā)揮作用。ICAM1能夠抑制淋巴因子激活的殺傷細胞與自然殺傷細胞，與各種癌癥表達相關[20]。Zhou等[21]對陰道壁組織的基因進行了分析，認為ICAM1、IL6、CCNA2、ATF3等基因在SUI的發(fā)生過程中起著關鍵作用。Tong等[22]發(fā)現(xiàn)載脂蛋白E，生長因子受體結合蛋白2，高爾基體SNAP受體復合物等可能在SUI發(fā)展中起神經(jīng)退行性作用。KEGG富集到的通路多涉及神經(jīng)、炎癥、內分泌等。Kang等[23]通過調節(jié)FAK-AMPK和Wnt/β-catenin激活骨盆底和尿道肌內的組織干細胞。馬雙玲等[24]對60例SUI患者研究發(fā)現(xiàn)TGF-β1和CTGF信號轉導通路過度抑制可能與SUI患者盆底支持結構的退行性病變密切相關。黃瓊[25]研究發(fā)現(xiàn)P44/42MAPK細胞信號通路與SUI發(fā)病相關通路受抑制后尿道支撐組織成纖維細胞Ⅰ型和Ⅲ型膠原表達量明顯下降。

本研究通過數(shù)據(jù)挖掘結合網(wǎng)絡藥理學的方法，初步闡明補中益氣湯多成分、多靶點、多通路治療SUI可能存在的作用機制?？紤]到網(wǎng)絡藥理學的局限性和數(shù)據(jù)分析的不全面性，后期仍需進一步臨床研究或實驗佐證。

參考文獻

[1]李兆艾.女性壓力性尿失禁的非手術治療[J].中國計劃生育和婦產(chǎn)科，2015，7（8）：1-4.

[2]中華醫(yī)學會婦產(chǎn)科學分會婦科盆底學組.女性壓力性尿失禁診斷和治療指南（2017）[J].中華婦產(chǎn)科雜志，2017，52（5）：289-293.

[3]劉晉宏.昆明兩社區(qū)成年女性盆底功能障礙性疾病的流行病學調查[D].昆明：昆明醫(yī)科大學，2013.

[4]Zhu L，Lang J，Liu C，et al.The epidemiological study of women with urinary incontinence and risk factors for stress urinary incontinence in China[J].Menopause，2009，16（4）：831-836.

[5]肖春風，李建坤，韋哲，等.益氣溫陽中藥治療老年女性壓力性尿失禁65例[J].河南中醫(yī)，2013，33（7）：1100-1101.

[6]張愛華.補中益氣丸聯(lián)合知柏地黃丸治療老年女性壓力性尿失禁療效分析[J].實用藥物與臨床，2013，16（12）：1236-1238.

[7]胡應林，王玉惠，王小琴，等.邵朝弟運用補中益氣湯治療尿失禁經(jīng)驗[J].遼寧中醫(yī)雜志，2015，42（3）：479-481.

[8]Liang Y，Zhou R，Liang X，et al.Pharmacological targets and molecular mechanisms of plumbagin to treat colorectal cancer：A systematic pharmacology study[J].Eur J Pharmacol，2020，881：173227.

[9]樊耀華，歐海亞，王漢裕，等.基于網(wǎng)絡藥理學的茵陳五苓散作用機制分析[J].中國實驗方劑學雜志，2018，24（11）：193-200.

[10]Doncheva NT，Morris JH，Gorodkin J，et al.Cytoscape StringApp：Network Analysis and Visualization of Proteomics Data[J].J Proteome Res，2019，18（2）：623-632.

[11]王晶慧，趙慧亮，靳翔，等.數(shù)據(jù)挖掘中藥治療癲癇藥對“陳皮-半夏”及其網(wǎng)絡藥理學作用機制分析[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2020，32（5）：769-777.

[12]Fang HY，Zeng HW，Lin LM，et al.A network-based method for mechanistic investigation of Shexiang Baoxin Pill′s treatment of cardiovascular diseases[J].Sci Rep，2017，7：43632.

[13]于樂泳，韓克華.女性壓力性尿失禁的中醫(yī)治法概述[J].現(xiàn)代中西醫(yī)結合雜志，2014，23（29）：3304-3306.

[14]曾玉燕，關永格.《景岳全書·婦人規(guī)》辨治癥瘕的學術思想探析[J].中國中醫(yī)基礎醫(yī)學雜志，2015，21（8）：924，932.

[15]湯康敏，明樹人，劉建黨，等.電針對壓力性尿失禁大鼠盆底MMPs和TIMPs表達的影響[J].上海中醫(yī)藥大學學報，2019，33（1）：81-86.

[16]周菲菲，謝臻蔚，李文娟，等.加味補中益氣湯治療女性壓力性尿失禁的臨床及機制研究[C].南昌：首屆男性大健康中西醫(yī)協(xié)同創(chuàng)新論壇暨第三屆全國中西醫(yī)結合男科青年學術論壇，2019.

[17]艾陽，薛麗霞，陳瀅，等.補中益氣湯對轉化生長因子β3及ⅠⅢ型膠原蛋白的影響及其治療盆腔臟器脫垂的機制研究[J].中國藥物與臨床，2017，17（1）：41-43，154.

[18]馮亞莉，盧令攀，翟廣玉.槲皮素衍生物抗腫瘤活性研究進展[J].中國中藥雜志，2020，45（15）：3565-3574.

[19]雷曉青，陳鰲，劉毅，等.山萘酚藥理作用的研究進展[J].微量元素與健康研究，2017，34（2）：61-62.

[20]黃蜜，王曦，曹登成.ICAM1、XIAP在宮頸癌中的表達及臨床意義研究[J].癌癥進展，2019，17（22）：2710-2712，2716.

[21]Zhou Q，Hong L，Wang J.Identification of key genes and pathways in pelvic organ prolapse based on gene expression profiling by bioinformatics analysis[J].Arch Gynecol Obstet，2018，297（5）：1323-1332.

[22]Tong J，Lang J，Zhu L.Microarray analysis of differentially expressed genes in vaginal tissues in postmenopausal women.The role of stress urinary incontinence[J].Int Urogynecol J，2010，21（12）：1545-1551.

[23]Kang N，Peng D Wang B，et al.The effects of microenergy acoustic pulses on animal model of obesity-associated stress urinary incontinence.Part 2：In situ activation of pelvic floor and urethral striated muscle progenitor cells[J].Neurourol Urodyn，2019，38（8）：2140-2150.

[24]馬雙玲，王魯文，馬學玲，等.TGF-β1/CTGF信號傳導通路在女性壓力性尿失禁發(fā)生中的研究[J].中國婦幼保健，2014，29（11）：1763-1766.

[25]黃瓊.P44/42 MAPK細胞信號傳導通路在女性壓力性尿失禁患者尿道支撐組織中的表達和意義[D].杭州：浙江大學，2012.

（2020-05-10收稿 責任編輯：蒼寧）