薛金嫚，安文強，張 茜，楊 敏，劉 鵬，郭 迎，吳曉牧

(1.北京銀豐鼎誠生物工程技術(shù)有限公司，北京 102600； 2.江西省人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，南昌 330006)

多發(fā)性硬化(multiple sclerosis，MS)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的自身免疫性疾病，導(dǎo)致髓鞘及其少突膠質(zhì)細胞的破壞，從而留下容易損傷和變性的脫髓鞘軸突，最終導(dǎo)致軸突喪失和永久性神經(jīng)功能障礙[1-3]。實驗性自身免疫性腦脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)與MS的臨床癥狀及病理特征相似，故常用EAE作為MS實驗研究的動物模型。目前MS主要使用免疫調(diào)節(jié)或免疫抑制藥物治療，但藥物治療價格昂貴，且不能從根本上改善疾病進展及患者的運動功能障礙[4]。

干細胞研究的進展為神經(jīng)退行性疾病的治療提供了新的策略。神經(jīng)干細胞移植及其提供的少突膠質(zhì)細胞替代和介導(dǎo)髓鞘修復(fù)的潛能越來越引起研究者關(guān)注[5]。人神經(jīng)干細胞(human neural stem cells，hNSCs)可多譜系分化為神經(jīng)元細胞、星形膠質(zhì)細胞和少突膠質(zhì)細胞，具有自我更新以及多譜系分化的能力[6-7]。因此，hNSCs為中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能重建和神經(jīng)再生帶來希望[4]。近幾年，NSCs治療MS的研究正逐漸增多。目前，關(guān)于NSCs治療MS的研究主要集中在臨床前的動物研究且NSCs供體為同種異體動物。例如，GAO等[8]研究發(fā)現(xiàn)鼠來源的NSCs能抑制慢性EAE大鼠的腦炎癥并改善髓鞘密度。ZHANG等[9]移植誘導(dǎo)多能干細胞來源的NSCs治療小鼠MS，顯著減少了EAE小鼠的T細胞浸潤，改善了白質(zhì)損傷。hNSCs治療MS的研究僅有國外的2項，且處于臨床I期的研究階段(數(shù)據(jù)來源ClinicalTrial)。然而，hNSCs治療MS動物模型的研究較少。本研究以C57BL/6(6N)小鼠為實驗對象構(gòu)建EAE模型，hNSCs鑒定后進行EAE小鼠的移植治療，觀察hNSCs治療EAE的療效，以期為臨床治療MS提供新的思路和方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑

DMEM/F-12培養(yǎng)基、胰酶(TP-EDTA)均購自美國Gibco公司；抗體均購自Abcam公司；蘇木精、伊紅均購自北京中杉金橋科技有限公司；多因子試劑盒購自Biolegend公司(貨號：740446)；hNSCs系來自北京銀豐鼎誠生物工程技術(shù)有限公司。

1.1.2 實驗動物

健康雌性 C57BL/6(6N) 40只，8～12周齡，體重18～20 g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，許可證號：SCXK(京)2016-0006。在SPF級環(huán)境下進行小鼠的培養(yǎng)。

1.2 方法

1.2.1 hNSCs的培養(yǎng)

hNSCs復(fù)蘇后計數(shù)，接種于T75培養(yǎng)瓶中，于37 ℃、5% 二氧化碳培養(yǎng)箱中傳代、換液培養(yǎng)8～14 d，于倒置熒光顯微鏡中觀察并記錄細胞形態(tài)[10]。錐蟲藍染色計數(shù)法計算hNSCs在第1～10天的細胞數(shù)目，然后計算hNSCs代內(nèi)增殖倍數(shù)。

1.2.2 流式細胞術(shù)檢測hNSCs干性標志物

hNSCs處理后，對其進行膜表面標記、細胞內(nèi)標記和細胞核標記染色[11]。細胞清洗、固定后，通過流式細胞儀分析檢測干性標志物CD133、vimentia、Nestin、Musashi、PAX6、SOX2的表達，于CytExpert軟件統(tǒng)計并分析陽性率。

1.2.3 免疫熒光檢測hNSCs分化標志物

hNSCs處理后，接種于24孔板中培養(yǎng)并固定，對其進行GFAP、TUJ-1及O4的免疫熒光染色，于倒置熒光顯微鏡下拍照，photoshop合成圖片后用Image-Pro Plus統(tǒng)計陽性細胞數(shù)目并計算陽性率[9]。

1.2.4 Transwell法檢測神經(jīng)干細胞的遷移能力

含hNSCs的細胞懸液加在transwell的上室中，并取hNSCs培養(yǎng)基置于下室中，小室放于24孔板中；將24孔板放置于培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)14、18、20 和22 h，于倒置顯微鏡下拍照，photoshop處理圖片后用Image-Pro Plus統(tǒng)計遷移細胞數(shù)目并計算遷移率[12]。

1.2.5 EAE小鼠模型的建立

選取8～12周齡雌性C57BL/6(6N)小鼠稱取體重，確認不同小鼠個體間體重無統(tǒng)計學(xué)差異。選取30只小鼠用于建立模型，10只小鼠作為空白對照。將溶于PBS的MOG35-55肽段(每只小鼠600 μg)與完全弗式佐劑(含5 mg·mL-1結(jié)核分枝桿菌)等體積充分混勻成油包水乳劑，于小鼠脊柱背側(cè)中線兩側(cè)分4點皮下注射(每個部位50 μL)，并于免疫當日和48 h后分別通過腹腔注射百日咳毒素300 ng (溶解于 300 μL PBS)，以進行免疫誘導(dǎo)制備EAE模型。

1.2.6 hNSCs的移植及實驗分組

實驗分3組：hNSCs治療組(NSC治療組)、模型組、空白組，每組10只小鼠。造模10 d后，以出現(xiàn)尾部遠端無力作為EAE造模成功的標準，最后造模成功小鼠20只。將培養(yǎng)的hNSCs消化計數(shù)，立體定位儀定位到沿中縫向后前囟前后-0.5 mm、中縫向右中縫左右 1 mm、深度顱骨平面向下2.5 mm，于腦室注射10 μL(含2.5×105)細胞?？瞻捉M于腦室注射10 μL PBS。

1.2.7 小鼠神經(jīng)功能評分

自造模日(d0)起每日記錄實驗小鼠體重、動態(tài)觀察臨床體征并進行神經(jīng)功能評分，直至細胞移植后14 d。實驗動物的評分標準根據(jù)TOADER等[13]的5級評分法。0分，無任何臨床癥狀；1分，尾癱；2分，雙后肢無力；3分，雙后肢癱瘓；4分，雙后肢及部分前肢癱瘓；5分，完全四肢癱瘓或死亡。癥狀介于兩者之間記0.5分。

1.2.8 HE染色

細胞移植14 d后將各組小鼠處死取腦組織，取材后直接放入4%多聚甲醛中固定超過24 h，常規(guī)脫水、透明、石蠟包埋并制成石蠟切片。根據(jù)步驟說明進行HE染色[14]。于顯微鏡觀察并分析炎性細胞情況。

1.2.9 細胞因子的檢測

細胞移植14 d后，利用多因子檢測試劑盒檢測各組小鼠血清中細胞因子IL-1β、IL-6、IL-10的水平，嚴格按照試劑盒操作說明書進行操作。經(jīng)流式細胞儀分析獲得樣本中各細胞因子的水平。

1.2.10 統(tǒng)計學(xué)方法

使用Graphpad Prism5.0對數(shù)據(jù)進行處理。計量資料以均數(shù)±標準差表示，組內(nèi)、組間比較均采用t檢驗。以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 hNSCs的形態(tài)及生長變化

hNSCs培養(yǎng)8～14 d后神經(jīng)球直徑達到200 μm以上，且經(jīng)過消化后能夠穩(wěn)定傳代擴增，其倍增時間為傳代后3～4 d。見圖1。

2.2 hNSCs干性標志物的表達

流式細胞術(shù)結(jié)果顯示，hNSCs干性標志物Musashi表達陽性率為73.49%；Nestin表達陽性率為97.87%；CD133表達陽性率為80.97%；SOX2表達陽性率為97.66%；vimentia表達陽性率為98.58%；PAX6表達陽性率為91.8%。見圖2。

圖2 hNSCs干性標志物的表達(流式細胞術(shù))

圖2(續(xù))

2.3 hNSCs分化標志物的表達

免疫熒光結(jié)果顯示，神經(jīng)元標志物TUJ-1表達的陽性率為60.8%，星形膠質(zhì)細胞標志物GFAP表達的陽性率為25%，少突膠質(zhì)細胞標志物O4表達的陽性率為0.4%。見圖3。

2.4 hNSCs的遷移能力

Transwell結(jié)果顯示，hNSCs遷移率在14、18、20 h隨著時間增加逐漸增高，20 h遷移率高達43%。見圖4。

圖4 hNSCs細胞的遷移情況

2.5 各組體重及神經(jīng)功能的評分

如圖5所示，空白組、模型組、NSC治療組小鼠體重基本相同；模型組小鼠見尾癱并伴隨雙后肢無力現(xiàn)象，神經(jīng)功能評分為1.5，NSC治療組小鼠僅見尾癱現(xiàn)象，神經(jīng)功能評分為1。

2.6 各組的HE染色

HE染色結(jié)果顯示，與空白組比較，模型組小鼠腦組織中見較多炎癥細胞，而經(jīng)hNSCs治療后小鼠腦組織炎癥細胞數(shù)目顯著降低。見圖6。

圖6 各組腦組織的HE染色(箭頭所示為炎癥細胞)

2.7 各組細胞因子的水平

流式細胞術(shù)結(jié)果顯示，與空白組比較，模型組血清中促炎因子IL-1β、IL-6的水平顯著升高(均P<0.05)，IL-10的水平降低(P<0.05)；與模型組比較，NSC治療組血清中促炎因子IL-1β、IL-6的水平顯著降低(均P<0.05)，IL-10的水平升高(P<0.05)。見表1。

表1 各組血清細胞因子水平的比較

表1 各組血清細胞因子水平的比較

組別nIL-1βIL-6IL-10空白組3182.77±161.99140.3±97.031420.38±961.57模型組3414.83±219.70*581.82±424.54*1017.54±441.00*NSC治療組3243.68±40.55#339.47±200.42#1620.16±816.39#

*P<0.05與空白組比較；#P<0.05與模型組比較。

3 討論

MS是一種神經(jīng)退行性疾病，可導(dǎo)致脫髓鞘并伴有身體或認知功能障礙。多灶性炎癥進入中樞神經(jīng)系統(tǒng)是MS損傷的主要原因[15]。干細胞具有免疫調(diào)節(jié)和神經(jīng)保護的潛在作用，是治療神經(jīng)退行性疾病的一種有前途的策略。神經(jīng)干細胞可以調(diào)節(jié)趨化因子水平，導(dǎo)致免疫細胞向中樞神經(jīng)系統(tǒng)受損部位遷移[16-17]，這些信號分子對內(nèi)源性神經(jīng)干細胞進入白質(zhì)也很重要[18]。許多動物研究[19-23]表明用動物源神經(jīng)干細胞治療多發(fā)性硬化是有效的，其有益作用主要由免疫調(diào)節(jié)和神經(jīng)保護機制介導(dǎo)。YANG等[24]通過靜脈注射同種異體側(cè)腦室外側(cè)壁腦室下區(qū)的NSCs和骨髓源NSCs治療EAE鼠，結(jié)果表明二者對EAE鼠具有相同的治療潛力，但側(cè)腦室外側(cè)壁腦室下區(qū)的NSCs存在倫理問題而備受爭議，這使骨髓源NSCs成為治療MS的更優(yōu)治療方式。但是骨髓源NSCs來源少且取材不方便，故研究者們[9,25]嘗試研究誘導(dǎo)多能干細胞來源的NSCs對MS的可能治療作用。ZHANG等[9]利用小鼠誘導(dǎo)多能干細胞源NSCs治療EAE小鼠，結(jié)果表明經(jīng)多能干細胞源NSCs治療后小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)的T細胞浸潤大大減少，髓鞘的再形成顯著增加，運動功能的恢復(fù)也提高了。MCINTYRE等[14]研究發(fā)現(xiàn)人胚胎干細胞源的NSCs移植后，調(diào)節(jié)性T細胞增加，并促進EAE小鼠的再髓鞘化，但是出現(xiàn)了免疫排斥反應(yīng)。臨床上hNSCs治療MS目前有2項研究，其目的主要為觀察其治療的安全性，但尚處于I期階段，已激活但尚未招募(數(shù)據(jù)來源clinicaltrials.gov)。故迄今有關(guān)hNSCs治療MS在臨床上的安全性研究尚未報道。

本研究通過注射MOG35-55肽段進行小鼠EAE的誘導(dǎo)，模擬人MS的病理及行為學(xué)改變。通過對小鼠行為學(xué)評判，本研究成功建立了小鼠EAE模型。進一步通過腦立體定位進行hNSCs腦內(nèi)移植， 結(jié)果顯示NSC治療組、模型組和空白組3組體重基本保持不變，但是NSC治療組的神經(jīng)功能得到明顯緩解，特別是NSC治療組體重無明顯變化與TOADER等[13]的研究結(jié)果一致。本研究結(jié)果還顯示，經(jīng)hNSC治療后小鼠腦組織的炎癥細胞浸潤減少，同時伴隨促炎因子IL-1β、IL-6的含量降低，抗炎因子IL-10的含量增加，提示hNSCs治療對EAE具有改善作用，這為臨床治療MS提供新的思路和方法。同時，本研究采用多因子方法進行細胞因子表達的檢測，解決了小鼠血清含量少的問題。但是，本研究僅探討了hNSCs在EAE模型中炎癥細胞浸潤的改善作用，對軸突損傷修復(fù)及NSCs移植后體內(nèi)分化、分布、存活、遷移等情況尚未做深入研究，這些將是筆者未來研究的方向。

綜上，本研究通過體外培養(yǎng)鑒定hNSCs，并將其移植至EAE小鼠腦內(nèi)進行定位治療，顯示hNSCs具有改善EAE小鼠神經(jīng)功能及炎癥浸潤的作用，這為其應(yīng)用于臨床MS的治療提供了實驗基礎(chǔ)。