胡旭鋼 唐夏莉 劉細幫 陳清勇

肺癌是目前世界上發(fā)病率及死亡率最高的腫瘤類型，肺腺癌（LUAD）是肺癌最常見的組織學(xué)類型［1］。近年來，針對肺癌的分子靶向治療極大地提高了患者的生存率。尋找新的生物標(biāo)志物，不僅可以更精準(zhǔn)地闡述LUAD細胞惡變的分子機制，還可為LUAD的早期診斷、療效監(jiān)測、預(yù)后評估等提供參考。酪氨酸和蘇氨酸蛋白激酶（TTK）是一種雙特異性蛋白激酶，能夠磷酸化酪氨酸、絲氨酸和蘇氨酸，是有絲分裂過程中紡錘體裝配檢查點的核心調(diào)節(jié)蛋白［2］。目前研究顯示，在結(jié)腸癌、肝癌、膽囊癌等多種腫瘤中均存在TTK的過表達，與患者的不良預(yù)后相關(guān)［3-7］。本研究擬基于公共腫瘤數(shù)據(jù)庫觀察TTK在LUAD中的表達模式及預(yù)后意義，為TTK的機制研究及臨床應(yīng)用提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)獲取 通過UCSC Xena數(shù)據(jù)庫（https：//tcga.xenahubs.net）下載腫瘤基因圖譜（TCGA）中標(biāo)準(zhǔn)化的肺腺癌RNASeq3級數(shù)據(jù)及臨床病理資料［8］。最終59例正常肺上皮組織及517例肺腺癌納入研究，其中494例包含完整隨訪信息的病例納入生存分析。從基因表達綜合數(shù)據(jù)庫（GEO，https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo）下載肺腺癌GSE31210、GSE68465和GSE75037數(shù)據(jù)集的原始微陣列mRNA表達數(shù)據(jù)及臨床資料，采用RMA方法進行歸一化后進行相關(guān)分析［9-11］。GSE31210，共20例正常肺上皮組織和226例肺腺癌組織，臨床資料包括患者的年齡、性別、腫瘤分期、吸煙史、EGFRALKKRAS突變情況及生存隨訪信息。GSE68465，共442例包含完整生存隨訪信息的肺腺癌患者，納入生存分析。GSE75037，共83對肺腺癌及對應(yīng)癌旁組織納入研究，臨床資料包括患者的年齡、性別、腫瘤分期、吸煙史及EGFRKRASSTK11突變情況。腫瘤免疫評估資源（TIMER，https：//cistrome.shinyapps.io/timer/）是一個利用RNA-Seq表達譜數(shù)據(jù)預(yù)測腫瘤組織中免疫細胞浸潤情況的網(wǎng)站［12-13］，通過Diff Exp模塊可以快速獲得TTK基因在肺腺癌等33種腫瘤組織及對應(yīng)正常組織中的表達情況。人類蛋白質(zhì)圖譜（HPA，https：//www.proteinatlas.org）是利用各種組學(xué)技術(shù)來繪制蛋白質(zhì)在正常及腫瘤細胞、組織和器官中表達的網(wǎng)站［14］，在線查詢可獲得TTK蛋白（抗體編號：CAB013229）在正常肺泡上皮細胞及肺腺癌中的免疫組化染色結(jié)果。

1.2 基因富集分析 采用GSEA軟件（4.0.2版本），以TCGA數(shù)據(jù)集中肺腺癌標(biāo)本為分析對象，依據(jù)TTK表達的中位值進行分組，以Hallmark基因集作為參考基因集，置換次數(shù)為1000次，將同時滿足P＜0.05和FDR＜0.25的基因集認(rèn)為是顯著富集的基因集。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用R軟件（3.6.1版本）和Graphpad（8.0版本）統(tǒng)計軟件。計量資料以（）表示，兩兩組間比較采用t檢驗，配對數(shù)據(jù)采用配對t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。篩選包含生存隨訪信息的TCGA、GSE31210和GSE68465數(shù)據(jù)集的標(biāo)本，納入隨訪＞30 d的病例進行生存分析。依據(jù)TTK表達的中位值，將患者分為TTK低表達組和TTK高表達組。利用R軟件的survival和surviminer包繪制Kaplan-Meier曲線，進行l(wèi)og-rank檢驗；timeROC包繪制ROC曲線，計算AUC值；survival和surviminer包進行單因素及多因素Cox回歸分析，采用forestplot包繪制森林圖。根據(jù)多因素Cox回歸結(jié)果繪制列線圖，并繪制校準(zhǔn)曲線和決策曲線來驗證列線圖模型在預(yù)后預(yù)測中的作用。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 泛癌組織中TTK的表達 通過TIMER網(wǎng)站的Diff Exp模塊，搜索TTK基因在33類腫瘤組織中的表達情況。TTK在包括膀胱尿路上皮癌（BLCA）、乳腺浸潤癌（BRCA）、膽管癌（CHOL）、結(jié)腸癌（COAD）、食管癌（ESCA）、頭頸鱗狀細胞癌（HNSC）、腎嫌色細胞癌（KICH）、腎透明細胞癌（KIRC）、腎乳頭狀細胞癌（KIRP）、肝細胞肝癌（LIHC）、肺腺癌（LUAD）、肺鱗癌（LUSC）、前列腺癌（PRAD）、直腸腺癌（READ）、胃癌（STAD）、甲狀腺癌（THCA）及子宮內(nèi)膜癌（UCEC）等多種腫瘤組織中的表達均顯著高于正常組織，見圖1A。皮膚黑色素瘤（SKCM）有遠處轉(zhuǎn)移的腫瘤患者，TTK的表達明顯高于無遠處轉(zhuǎn)移的腫瘤患者。結(jié)果表明，TTK在泛癌組織中存在高表達，提示可能與惡性腫瘤的發(fā)生、演進密切相關(guān)。

2.2 LUAD組織中TTK的表達 在TCGA數(shù)據(jù)集中，與正常肺上皮組織（n=59）比較，LUAD組織（n=517）中TTK mRNA的表達顯著升高（t=16.470，P＜0.001），見圖1B。在GSE31210數(shù)據(jù)集中，20例正常肺上皮組織與226例LUAD組織比較，TTK mRNA在腫瘤組織中存在顯著高表達（t=5.406，P＜0.001），見圖1C。在GSE75037數(shù)據(jù)集中，83例LUAD組織及癌旁組織配對比較，TTK mRNA在LUAD組織中過表達（t=18.690，P＜0.001），見圖1D。HPA數(shù)據(jù)庫中的免疫組化結(jié)果提示，TTK蛋白在正常肺上皮組織中弱表達，在LUAD組織中表達明顯增加，見圖1E。綜上，TTK在LUAD組織中的表達顯著高于正常肺上皮組織。

圖1 腫瘤組織與正常組織TTK表達的比較

2.3 TTK表達與LUAD患者臨床病理特征的相關(guān)性 TTK的表達與年齡、性別、吸煙史、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期、驅(qū)動基因突變狀態(tài)、KRAS突變等密切相關(guān)（P＜0.05），與患者的 ECOG 評分（P=0.052）、遠處轉(zhuǎn)移（P=0.087）、MAP2K1突變（P=0.095）、PTPN11突變（P=0.060）可能相關(guān)，見圖2。觀察TCGA、GSE31210和GSE75037三個數(shù)據(jù)集中的TTK表達與TNM分期、吸煙史及EGFR突變的關(guān)系，結(jié)果提示TNM分期越晚，TTK表達越高（P＜0.05），見圖3A；既往吸煙史患者的TTK表達明顯升高（P＜0.05），見圖3B；在GSE31210和GSE75037兩個數(shù)據(jù)集中，與EGFR野生型患者比較，EGFR突變患者的TTK表達顯著下調(diào)（P＜0.05），見圖3C。綜上，LUAD的惡性程度越高，TTK的表達隨之增加，且TTK的表達與患者的基因突變情況密切相關(guān)。

圖2 TTK表達與LUAD患者臨床病理特征的相關(guān)性

圖3 TTK表達與LUAD患者TNM分期﹑吸煙史及EGFR基因突變的相關(guān)性

2.4 TTK表達與患者預(yù)后的相關(guān)性 在TCGA、GSE31210和GSE68465三個數(shù)據(jù)集中，通過繪制Kaplan-Meier生存曲線發(fā)現(xiàn)，TTK表達越高，患者的總體生存率越低（P＜0.001，P=0.001，P=0.004），見圖4A；時間依賴的ROC曲線表明，TTK能夠準(zhǔn)確預(yù)測患者的總體生存率，見圖4B；1年生存率的曲線下面積分別為0.630、0.685和0.610；3年生存率的曲線下面積分別為0.601、0.661和0.635；5年生存率的曲線下面積分別為0.570、0.724和0.610。多因素Cox回歸結(jié)果顯示，TTK是預(yù)測LUAD患者預(yù)后的獨立預(yù)后因子，見圖4C。綜上，高表達TTK的LUAD患者預(yù)后差，且TTK是預(yù)測患者預(yù)后的一個可重復(fù)的獨立預(yù)后因素。

圖4 TTK表達與患者預(yù)后的相關(guān)性

2.5 列線圖模型的構(gòu)建及驗證 基于多因素Cox回歸分析的結(jié)果，在TCGA數(shù)據(jù)集中納入腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TTK表達等3個獨立預(yù)后因素，構(gòu)建列線圖模型，見圖5A。校準(zhǔn)曲線結(jié)果顯示，列線圖模型能夠較準(zhǔn)確預(yù)測LUAD患者真實的3年生存率，見圖5B。決策曲線結(jié)果表明，與單因素預(yù)測比較，列線圖模型能更準(zhǔn)確地反應(yīng)患者預(yù)后情況，見圖5C。綜上，聯(lián)合TTK、腫瘤大小和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的列線圖模型，能更準(zhǔn)確地預(yù)測LUAD患者的預(yù)后。

圖5 列線圖模型的構(gòu)建及驗證

2.6 TTK的功能基因集富集 TTK高表達的LUAD患者在細胞增殖相關(guān)通路如有絲分裂紡錘體形成通路和G2M檢查點通路、E2F靶點通路、mTOR信號通路、Myc信號通路、糖酵解通路及DNA損傷修復(fù)等信號通路富集，可能參與TTK促進LUAD演進的過程。見圖6。

圖6 TTK高表達LUAD患者的富集信號通路分析

3 討論

在腫瘤研究領(lǐng)域，大數(shù)據(jù)已經(jīng)成為最新的驅(qū)動力，數(shù)據(jù)驅(qū)動型研究逐漸成為腫瘤生物信息學(xué)研究的重要模式，高通量測序分析技術(shù)所產(chǎn)生的腫瘤生物信息學(xué)數(shù)據(jù)，是腫瘤大數(shù)據(jù)的主要來源之一［15］。腫瘤生物信息學(xué)數(shù)據(jù)具有質(zhì)控規(guī)范、資源共享、海量樣本、超高數(shù)據(jù)維度等特點，對研究腫瘤發(fā)生、演進及治療具有重要意義［16-17］。在惡性腫瘤的病理診斷、藥物篩選、個體化基因型與表型構(gòu)建、預(yù)后預(yù)測等方面，基于大數(shù)據(jù)分析的人工智能和機器學(xué)習(xí)都已取得了飛速的發(fā)展［17-18］。運用大數(shù)據(jù)挖掘技術(shù)探究腫瘤的本質(zhì)是今后腫瘤研究領(lǐng)域的重要方法。

有絲分裂是一個高度精確有序的過程，紡錘體裝配檢查點在監(jiān)督細胞正確分裂過程中發(fā)揮重要作用。TTK作為紡錘體裝配檢查點的核心組分，只有當(dāng)染色體正確連接時，有絲分裂才能順利進入后期，否則阻滯與M期［19］。因此，TTK在高增殖指數(shù)的細胞中明顯升高，如正常睪丸及胎盤組織，以及在惡性腫瘤組織中高表達［20-21］。本研究通過多組學(xué)、多中心的數(shù)據(jù)比較發(fā)現(xiàn)，TTK在包括LUAD在內(nèi)的泛癌組織中存在明顯高表達，并與LUAD的惡性表型及不良預(yù)后明顯相關(guān)，聯(lián)合TTK表達及腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床特征，可以準(zhǔn)確的預(yù)測患者的總體生存時間，為后續(xù)的TTK相關(guān)細胞及機制研究提供了良好的基礎(chǔ)。

流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果提示，約90%肺癌的患者均存在不同程度的煙草暴露，煙草暴露人群的肺癌發(fā)病風(fēng)險較無暴露人群提高了近30倍［22］。本研究發(fā)現(xiàn)，在既往有煙草暴露史的LUAD患者中，TTK的表達明顯升高，而相比于EGFR突變的患者，EGFR野生型的患者中TTK表達顯著增加。這些結(jié)果提示TTK可能成為煙草暴露患者，尤其是EGFR野生型患者的有效治療靶點，與腫瘤的惡性表型及不良預(yù)后密切相關(guān)，可作為預(yù)后監(jiān)測及藥物治療的新標(biāo)志物。