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血卟啉單甲醚介導(dǎo)的光動力療法對胃癌細(xì)胞MGC-803的光動力殺傷效應(yīng)

2021-07-21 06:58陳強劉立鳳高越
浙江臨床醫(yī)學(xué) 2021年6期
關(guān)鍵詞:孵育輸出功率存活率

陳強 劉立鳳 高越

光動力療法(PDT)是利用腫瘤細(xì)胞的高代謝特點來治療腫瘤的一種新方法,其原理是光敏劑可以選擇性地進(jìn)入腫瘤細(xì)胞并被特定波長的光激活,引起一系列光化學(xué)反應(yīng),產(chǎn)生單線態(tài)氧和自由基,從而殺死腫瘤細(xì)胞[1]。血卟啉單甲醚(HMME)是常用的光敏劑,其介導(dǎo)的PDT已廣泛應(yīng)用于整形美容、細(xì)菌感染及惡性腫瘤的治療[2-4],通過特定波長的激光來激活HMME可以產(chǎn)生腫瘤殺傷效應(yīng),在內(nèi)窺鏡PDT治療中激光纖維通過內(nèi)窺鏡活檢通道進(jìn)入腔道,造成腫瘤的原位破壞而正常組織不受損傷,具有毒性局限、損傷小的特點,且反復(fù)PDT治療不易產(chǎn)生耐藥性[5],目前用于胃癌的治療研究較少,本實驗旨在研究HMME-PDT對胃癌細(xì)胞MGC-803的生長抑制作用。

1 材料與方法

1.1 試劑與光源 血卟啉單甲醚(凍干粉狀態(tài))購自上海先鋒藥業(yè)有限公司,其最佳吸收光譜為630 nm[6],胃癌細(xì)胞MGC-803系獲自哈爾濱醫(yī)科大學(xué)細(xì)胞中心,RPMI-1640培養(yǎng)基和胎牛血清(FBS)均購自美國Hyclone Laboratories公司,鏈霉素和青霉素均購自蘇州碧云天生物技術(shù)公司,ApoAlert Annexin V-FITC試劑盒購自美國BD生物科技公司,細(xì)胞計數(shù)試劑盒8(CCK8)購自武漢博斯特生物工程有限公司。選用的光源為二極管激光器(日本東京三洋電機株式會社),其最大輸出功率為260 mW,波長為635 nm。光通過具有0.8 mm圓柱形擴散尖端的光纖施加器分布,照射前將輸出功率調(diào)整為50 mW,并將產(chǎn)生的光線進(jìn)行光學(xué)準(zhǔn)直至直徑為0.8 cm的光斑尺寸。激光輸出能量用功率計仔細(xì)校準(zhǔn),以避免過度曝光。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 將胃癌細(xì)胞MGC-803接種于含有10%胎牛血清、50 μg/ml鏈霉素和50 μg/ml青霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中,置于37 ℃、含有5%CO2的濕潤培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng),取對數(shù)生長期細(xì)胞用于實驗。

1.3 研究方法 (1)熒光檢測與光譜分析:將細(xì)胞接種于96孔板培養(yǎng)基中,約1×104個/孔,置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,細(xì)胞貼壁后,傾去原培養(yǎng)液,每個孔中加入一定量的HMME,并加入新的培養(yǎng)基,使之濃度為2 mg/L,每個孔設(shè)置四個復(fù)孔,分別孵育不同時間(0 min、30 min、60 min、90 min、120 min、150 min、180 min、210 min、240 min、270 min、300 min),采用波長405 nm、帶寬20 nm的光源照射,激發(fā)進(jìn)入胃癌細(xì)胞MGC-803的HMME發(fā)出熒光,使用光纖接收發(fā)出的熒光,采用Origin7軟件進(jìn)行熒光光譜分析,確定HMME的最佳孵育時間。(2)細(xì)胞形態(tài)觀察:在6孔板上培養(yǎng)的細(xì)胞與2 mg/L HMME孵育90 min(最佳孵育時間)后,用10 μg/ml DAPI(Hoechst 33342)染色10 min,熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)。

1.4 細(xì)胞活力測定 將胃癌細(xì)胞MGC-803與不同濃度(0 mg/L~4 mg/L)的HMME在黑暗環(huán)境下孵育90 min后,行激光照射(波長630 nm,光功率50 mW,照射距離2 cm,照射面積0.5 cm2),輸出功率為100 mW/cm2;照射時間分別為0 s、20 s、40 s、80 s,產(chǎn)生的光能量強度分別為 0 J/cm2、2 J/cm2、4 J/cm2、8 J/cm2。然后在每個孔中加入10 μL CCK8試劑,將細(xì)胞置于37 ℃培養(yǎng)箱中孵育2 h,之后立即檢測490 nm處每個孔的光密度(OD)。細(xì)胞存活率=(實驗組OD-空白對照組OD)/(對照組OD-空白對照組OD)×100%。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件。計量資料以()表示,采用單因素方差分析及Dunnett檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HMME在胃癌細(xì)胞MGC-803中的聚集和熒光光譜分析 經(jīng)2 mg/L HMME孵育90 min的胃癌細(xì)胞MGC-803 用 10 μg/ml DAPI(Hoechst 33342)染色后,核染成藍(lán)色,紅色熒光代表MGC-803細(xì)胞中聚集的HMME,見圖1a;未與HMME孵育的細(xì)胞,細(xì)胞漿未顯示紅色熒光,見圖1b。胃癌細(xì)胞MGC-803的熒光強度隨著孵育時間的增加而迅速增加,在90 min達(dá)到峰值,然后急劇下降,并在210 min時達(dá)到另一個峰值,但低于前一個峰值,提示HMME與MGC-803細(xì)胞的最佳孵育時間為90 min,見圖2。

圖1 胃癌細(xì)胞MGC-803的熒光顯微照片

2.2 顯微鏡下胃癌細(xì)胞MGC-803的形態(tài)與數(shù)量變化 未經(jīng)HMME或光照射處理的胃癌細(xì)胞MGC-803呈長梭狀,邊緣銳利,見圖3a;經(jīng)2 mg/L HMME介導(dǎo)的PDT(4 J/cm2)誘導(dǎo)的MGC-803細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯改變,變圓、起皺甚至破裂,存活的細(xì)胞數(shù)量明顯減少,見圖3b。

圖 2 胃癌細(xì)胞MGC-803的HMME熒光光譜分析圖

圖3 胃癌細(xì)胞MGC-803的形態(tài)學(xué)變化

2.3 胃癌細(xì)胞MGC-803的存活率測定及分析 單純給予0.25 mg/L、0.5 mg/L、1 mg/L HMME孵育,未經(jīng)激光照射的胃癌細(xì)胞MGC-803幾乎無明顯變化;當(dāng)HMME濃度達(dá)到2 mg/L時,細(xì)胞存活率下降至(83.22±1.69)%(P=0.011);HMME濃度達(dá)到4 mg/L時,細(xì)胞存活率進(jìn)一步下降至(81.70±3.04)%(P=0.006);HMME濃度達(dá)到8 mg/L時,細(xì)胞存活率(78.81±1.54)%下降更明顯(P=0.002);可能是過量HMME引起的細(xì)胞毒性作用。單純用激光照射未經(jīng)HMME處理過的細(xì)胞,其存活率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);光強度為2 J/cm2時,細(xì)胞存活率為(94.68±2.73)%(P=0.44);光強度為4 J/cm2時,細(xì)胞存活率為(92.62±6.22)%(P=0.48);當(dāng)光強度增加至8 J/cm2時,存活率為(92.40±6.34)%(P=0.41)下降不明顯。當(dāng)與激光照射結(jié)合時,不同濃度的HMME可以實現(xiàn)不同程度的細(xì)胞抑制作用,即使使用最低濃度的HMME(0.25 mg/L)也可顯著降低胃癌細(xì)胞MGC-803的存活率(P<0.01)。不同強度的光照亦存在這樣的趨勢。經(jīng)4 mg/LHMME和8 J/cm2的激光處理后,胃癌細(xì)胞MGC-803的存活率幾乎降低到最小值(5.63±1.51)%。當(dāng)HMME濃度達(dá)到8 mg/L,腫瘤細(xì)胞的存活率沒有再明顯降低(P=0.15)。見圖4a。

使用固定濃度的HMME作為光敏劑,不同強度的光照射對MGC-803細(xì)胞產(chǎn)生不同程度的生長抑制作用。研究發(fā)現(xiàn),胃癌細(xì)胞MGC-803的存活率與光動力學(xué)因子B呈近似e指數(shù)衰減關(guān)系。光動力因子B=光輸出功率×照射時間×HMME濃度(B=I0×t×C)。見圖4b。

圖4 胃癌細(xì)胞MGC-803的存活率測定及分析圖。a. 與對照組比較,★P<0.05,★★P<0.01,NS代表差異無統(tǒng)計學(xué)意義;b. 實心圓表示細(xì)胞存活率,紅色曲線顯示其與光動力學(xué)參數(shù)B的指數(shù)擬合

3 討論

光動力療法(PDT)是治療胃癌的新興替代方案,基于其靶向能力強、毒性低、治療效果好等特點,有學(xué)者認(rèn)為PDT是食管癌、胃癌和結(jié)腸癌患者的一線潛在療法[5,7]。光敏劑的選擇是充分發(fā)揮PDT療效的一個重要途徑,本研究使用的血卟啉單甲醚(HMME)為新開發(fā)的光敏劑,再次證明了PDT的功效,驗證了HMME順利進(jìn)入MGC-803細(xì)胞。根據(jù)熒光檢測光譜的數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn),MGME-803細(xì)胞中HMME在90 min時達(dá)到濃度峰值,孵育時間過長會導(dǎo)致細(xì)胞損傷甚至死亡,從而影響實驗結(jié)果。后續(xù)的實驗中均采取最佳孵育時間即90 min,以求在最佳時間內(nèi)達(dá)到最好的治療效果。HMME必須被激光激發(fā)以產(chǎn)生化學(xué)反應(yīng),如產(chǎn)生誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的活性氧(ROS)[5],單純使用HMME處理腫瘤細(xì)胞是沒有殺傷效應(yīng)的(P>0.05),而濃度超過2 mg/L時可單獨產(chǎn)生細(xì)胞毒性作用(P<0.05),由此可證明HMME對正常細(xì)胞的低毒性作用。本實驗還發(fā)現(xiàn),HMME一旦結(jié)合激光照射就會展現(xiàn)其高效的殺傷效應(yīng),腫瘤細(xì)胞死亡率達(dá)90%以上。PDT有三個重要元素,光輸出功率、照射時間和光敏劑濃度,前兩者的乘積可表示為光強度。實驗中MGC-803細(xì)胞的增殖能力受到顯著抑制,與光動力因子B密切相關(guān),光動力因子B=光輸出功率×照射時間×HMME濃度(B=I0×t×C)。隨著B值在20 W·mg/L·min范圍內(nèi)增加,存活細(xì)胞明顯減少,總趨勢呈指數(shù)衰減曲線。當(dāng)B值達(dá)到30 W·mg/L·min時,細(xì)胞存活率幾乎達(dá)到最小值。從擬合曲線可以看出,只要B值保持恒定,通過調(diào)節(jié)光強度或HMME濃度值,均可達(dá)到幾乎相同的細(xì)胞殺傷效果。臨床上,對于合并肝腎功能不全的患者,在確保相同治療效果的情況下,可以適當(dāng)降低HMME的濃度,增加光強度即通過增加曝光時間或輸出功率,可最大程度地降低肝腎損害。與其他腫瘤不同,胃腸道腫瘤通常需要內(nèi)窺鏡裝置來引導(dǎo)PDT進(jìn)入消化道,因此曝光時間也應(yīng)該考慮在內(nèi),對于不能反復(fù)進(jìn)行內(nèi)窺鏡檢查或長時間治療的患者,需要縮短接觸時間或降低治療頻率,通過增加HMME濃度或光輸出功率以確保最佳治療,同時使得其他器官受損最小化。

綜上,HMME介導(dǎo)的PDT是抑制MGC-803細(xì)胞增值的有效方法,光動力因子B與細(xì)胞存活率之間的關(guān)系曲線可指導(dǎo)PDT的臨床應(yīng)用,但還需進(jìn)一步實踐評估其作用價值。

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