張偉蘭 毛玉山

甲狀腺乳頭狀癌（PTC）是甲狀腺癌的最常見亞型，轉(zhuǎn)移是導致PTC患者死亡的主要原因，近一半轉(zhuǎn)移患者在5年內(nèi)死亡［1］。微小RNA（miRNA）是一類保守短鏈非編碼RNA［2］，研究發(fā)現(xiàn)，miRNA參與PTC發(fā)生、發(fā)展［3-5］。多種 miRNA在 PTC 中表達異常［6-7］，在部分PTC患者循環(huán)血中miR-222存在高表達，并與淋巴結轉(zhuǎn)移和腫瘤晚期階段密切相關［1，8］。但目前有關miR-222在PTC的侵襲、轉(zhuǎn)移中的作用及機制的研究較少。p53-2促凋亡蛋白（ASPP2）是p53家族成員中的腫瘤抑制因子，ASPP2下調(diào)與癌癥侵襲表型和不良預后相關［9］。由miRNA調(diào)控ASPP2的潛在機制及其對PTC的影響尚待闡明。筆者擬通過體內(nèi)外研究明確miR-222對PTC侵襲和轉(zhuǎn)移的影響，并探索miR-222通過調(diào)控ASPP2影響PTC進展。

1 材料與方法

1.1 材料 （1）細胞與試劑：人甲狀腺正常細胞系Nthy-ori 3-1、人甲狀腺乳頭癌BCPAP和K1細胞均購自浙江如耀生物科技有限公司。K1、BCPAP和Nthy-ori 3-1細胞使用RPMI 1640加10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素，在37℃含有5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。（2）實驗動物：24只雄性SPF級BALB/c小鼠（5～6周齡）購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司，飼養(yǎng)在寧波大學實驗動物中心SPF屏障系統(tǒng)。動物實驗方案經(jīng)寧波大學實驗動物倫理委員會批準。

1.2 研究方法 （1）質(zhì)粒轉(zhuǎn)染：從NCBI上獲取miR-222序列，進行過表達及沉默的引物設計。利用pCDH-H1-GFP-puro和pLKO.1-puro質(zhì)粒分別構建miR-222穩(wěn)定表達和沉默質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染293T細胞得到慢病毒，感染PTC細胞后嘌呤霉素篩選，獲得miR-222穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株，采用RT-PCR檢測miR-222的轉(zhuǎn)染效率。miR-222過表達引物序列，XbaI-上游引物-5'-TGC TCT AGA GCT GCT GGA AGG TGT AGG TA-3'、EcoRI-下游引物-5'-CCG GAA TTC GTA CCT ACA CCT TCC AGC AG-3'；miR-222沉默引物序列，上游引物-5'-CCG GCC AGT GTA GAT CCT GTC TTT CCT CGA GGA AAG ACA GGA TCT ACA CTG GTT TTT G-3'、下游引物-5'-AAT TCA AAA ACC AGT GTA GAT CCT GTC TTT CCT CGA GGA AAG ACA GGA TCT ACA CTG G-3'。（2）Transwell侵襲實驗 ：在包被有Matrigel的Transwell小室中，加入100 μL密度為4×105細胞/mL的單細胞懸液，下室加入含血清的完全培養(yǎng)液，培養(yǎng)48 h后取出小室，4%多聚甲醛固定，結晶紫染色，顯微鏡下計數(shù)侵襲細胞數(shù)。（3）遷移實驗：細胞鋪板后，匯合度100%時，用20 μL的吸頭進行劃痕處理，待24 h后于倒置顯微鏡下觀察、拍照。（4）雙熒光素酶報告基因檢測：用TargetScan和miRanda軟件預測miR-222潛在的靶基因及結合序列，合成ASPP2的野生型和突變型序列的引物，使用pISO質(zhì)粒構建雙熒光素酶報告基因質(zhì)粒，pRL-TK作為內(nèi)參質(zhì)粒。293T細胞在60%～80%融合度時用Lipo 3000進行轉(zhuǎn)染，miR-222 mimic及mimic NC 各2.5 μL（金唯智公司合成），終濃度為100 nM。結合promega的雙熒光素酶報告系統(tǒng)，使用Promega GloMax進行測量，相對熒光素酶活性以螢火蟲熒光素酶活性與Renilla熒光素酶活性的比值來表示。其中，野生型ASPP2擴增引物序列，ScaI-上游引物-5'-AAA GAG CTC ATT ATA TGA GTT TTT GTA GCA-3'、XbaI-下游引物-5'-TGC TCT AGA CTT GCT ACA GAC TTA CCC GTA-3'；突變型ASPP2擴增引物序列，ScaI-上游引物-5'-AAA GAG CTC TTT ATA AGA GTT TTA CAT CGA-3'、XbaI- 下游引物-5'-TGC TCT AGA CTT GCT ACA GAC TTA CCC GTA-3'。（5）免疫印跡：收集細胞，加入蛋白裂解液，冰上裂解5 min，取部分裂解液，BCA法測定蛋白濃度。剩余蛋白煮沸變性后，SDS-PAGE分離，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶封閉2 h，加入兔抗ASPP2抗體（貨號：ET1702-79，華安抗體公司），1∶1000比例稀釋，4 ℃孵育過夜。棄一抗，加羊抗兔IgG-HRP二抗（貨號：HA1001，華安抗體公司）室溫孵育1.5 h～2 h，ECL發(fā)光液顯色，UVP蛋白成像儀進行曝光拍攝，以β-actin為內(nèi)參蛋白對目標蛋白進行相對定量。（6）qPCR檢測ASPP2表達：采用Trizol法提取細胞以及臨床樣本的RNA，參照一步法PCR試劑盒和RT-PCR相關試劑盒的說明書，得到cDNA。熒光定量檢測試劑盒檢測ASPP2的表達情況。ASPP2 qPCR引物序列如下，上游：5'-AGC ACT GGG AAT GCT CTG GAT C-3'，下游：5'-GGC ATT GGA CTG GTC TAC TGC A-3'；GAPDH qPCR引物序列，上游：5'-GTC TCC TCT GAC TTC AAC AGC G-3'，下游：5'-ACC ACC CTG TTG CTG TAG CCA A-3'。以GAPDH為內(nèi)參，計算相對表達量，2-△△Ct=（Ct實驗組目的基因-Ct實驗組內(nèi)參基因）-（Ct對照組目的基因-Ct對照組內(nèi)參基因）。（7）qPCR檢測miR-222表達：采用Trizol法提取細胞及臨床樣本的RNA，以U6為內(nèi)參，參照miRcute增強型miRNA定量檢測試劑盒說明書，檢測miR-222的表達情況，基因相對表達量計算同（6）。其中，miR-222 qPCR引物序列，上游引物為5'-CTC AGT AGC CAG TGT AG-3'，下游引物為5'-GAA CAT GTC TGC GTA TCT C-3'；U6 內(nèi)參引物序列，上游引物為5'-CTC GCT TCG GCA GCA CAT-3'，下游引物為 5'-TTT GCG TGT CAT CCT TGC G-3'。（8）肺轉(zhuǎn)移能力測定：將24只雄性SPF級BALB/c小鼠分為空白對照組（Control組）、pCDH-miR-222過表達組和pLKO-miR-222沉默組，每組各8只。將100 μL細胞懸液通過尾靜脈注入小鼠體內(nèi)，1×106細胞/每只，6周后處死小鼠，肺組織在福爾馬林中固定24 h，石蠟包埋，4 μm厚度連續(xù)切片，切片進行蘇木精-伊紅染色。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件。所有實驗單獨重復3次，計量資料以（）表示，多組間比較采用單因素方差分析（ANOVA）法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 miR-222在不同甲狀腺癌細胞中的表達水平 甲狀腺癌細胞BCPAP、K1的miR-222表達水平高于正常人甲狀腺細胞Nthy-ori 3-1約6～7倍，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖1A。慢病毒感染后miR-222在甲狀腺癌細胞系中的表達水平顯著上調(diào)，沉默miR-222后的甲狀腺癌細胞miR-222的表達水平顯著下調(diào)，與各自Control組比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），見圖1B。

圖1 A. qPCR檢測miR-222基因表達水平，與Nthy-ori3-1組比較，★P＜0.05；B. qPCR檢測慢病毒感染后甲狀腺癌細胞中miR-222的基因表達水平，與各自control組比較，★★P＜0.01

2.2 miR-222與PTC細胞遷移和侵襲 在BCPAP和K1細胞中穩(wěn)定過表達miR-222后，BCPAP和K1細胞系的遷移和侵襲能力顯著增強。沉默miR-222后，BCPAP和K1細胞系遷移和侵襲能力顯著減弱。結果顯示，miR-222在體外顯著增強PTC細胞的遷移力和侵襲性。見圖2。

圖2 A-B. 細胞劃痕實驗及其統(tǒng)計量化結果；C-D. Transwell細胞侵襲實驗及其統(tǒng)計量化結果。與各自control組比較，★P＜0.05，★★P＜0.01

2.3 miR-222靶向抑制ASPP2基因表達 miR-222可能與ASPP2 存在可結合位點，見圖3。雙熒光素酶基因報告系統(tǒng)檢測結果顯示，野生型ASPP2組中轉(zhuǎn)染miR-222 mimic后，與mimic NC組比較，熒光強度被顯著抑制（P＜0.05），而突變型ASPP2組并未觀察該現(xiàn)象。通過檢測miR-222穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株發(fā)現(xiàn)，miR-222沉默組中ASPP2的基因和蛋白表達顯著高于miR-222過表達組（P＜0.05），見圖4-6。在miR-222過表達的2個細胞株中轉(zhuǎn)染ASPP2的過表達質(zhì)粒后，顯著削弱由miR-222引起的細胞遷移和侵襲能力增加，與對照組pCDH-miR-222比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖7。2.4 miR-222在體內(nèi)增強肺轉(zhuǎn)移 見圖8。與對照組比較，注射過表達miR-222的PTC細胞的小鼠肺轉(zhuǎn)移性結節(jié)的發(fā)生率顯著增高（P＜0.05），而miR-222沉默組PTC細胞的肺轉(zhuǎn)移發(fā)生率顯著降低（P＜0.05）。

圖3 生物信息學分析結果

圖4 A. ASPP2與miR-222的結合位點以及ASPP2的突變序列；B. 雙熒光素酶活性報告檢測結果，★★P＜0.01

圖5 A. qPCR檢測ASPP2的基因表達水平，與Nthy-ori 3-1細胞比較，★P＜0.05；B. qPCR檢測過表達或沉默miR-222時BCPAP和K1的ASPP2的基因表達水平，與各自control組比較，★★P＜0.01

圖6 免疫印跡檢測BCPAP和K1的ASPP2蛋白表達水平，與各自control組比較，★P＜0.05

圖7 A. 表達ASPP2后對miR-222過表達細胞遷移距離的影響；B.表達ASPP2后對miR-222過表達細胞侵襲性的影響；與pCDH-miR-222比較，★P＜0.05

圖8 A. HE染色結果；B-C. 肺結節(jié)生成數(shù)量化結果，與空白對照組比較，★P＜0.05

3 討論

甲狀腺乳頭狀癌（PTC）的發(fā)生是一個多因素、多步驟、多基因參與的復雜過程，基因突變、原癌基因激活、抑癌基因失活與一系列信號轉(zhuǎn)導異常等改變貫穿始終。因此，根據(jù)分子機制尋找PTC發(fā)生發(fā)展的潛在作用靶點，在分子水平層面輔助PTC早期診斷、監(jiān)測并干預病情發(fā)展，對指導PTC的臨床診療具有重要意義。研究顯示，miRNA在癌癥的發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用，通過調(diào)節(jié)細胞增殖、代謝、凋亡與侵襲進而促進癌變和轉(zhuǎn)移過程［10］，其中miR-222因其在甲狀腺癌、結腸直腸癌和胰腺癌等多種癌癥中的表達上調(diào)，引起眾多學者的關注。HE等［11］在甲狀腺乳頭狀癌的研究中發(fā)現(xiàn)了5個過度表達的miRNA，miR-146、miR-221、miR-222、miR-21、miR-181，其中miR-222的表達水平高達正常組織的19倍。XIANG等［2］研究發(fā)現(xiàn)，miR-222在PTC中的表達明顯高于正常甲狀腺組織，且其表達水平與PTC的嚴重程度具有相關性，表明miR-222的表達水平在PTC風險分層中具有潛在參考價值。膠質(zhì)瘤的相關研究發(fā)現(xiàn)，miR-222可能還參與癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移［12］，主要通過與蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶基因3'-UTR結合，下調(diào)該蛋白在膠質(zhì)瘤中表達，進而促進細胞的侵襲和遷移。卵巢癌上皮細胞通過外泌體分泌的miR-222，可以促進單核細胞向腫瘤相關巨噬細胞轉(zhuǎn)化，從而促進腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移［13］?？梢姡琺iR-222的表達異常與腫瘤的進展密切相關［14］，但miR-222在PTC侵襲、轉(zhuǎn)移過程中的作用機制仍然未知。LIU等［15］研究證實，ASPP2與p53結合可以激活p53的抑癌功能，而ASPP2除了能夠調(diào)控細胞凋亡，還可以調(diào)控腫瘤轉(zhuǎn)移。所以，ASPP2蛋白很可能參與PTC的發(fā)生、發(fā)展、侵襲與轉(zhuǎn)移過程，但miR-222與ASPP2的相關研究尚未見報道。

本文通過Transwell和雙熒光素酶活性報告、肺轉(zhuǎn)移實驗來分析miR-222與PTC發(fā)展之間的關系，研究發(fā)現(xiàn)在體外增加miR-222可增強PTC細胞的遷移和侵襲能力，在體內(nèi)可促進肺轉(zhuǎn)移；miR-222可下調(diào)ASPP2表達，回復ASPP2表達后削弱由miR-222促進的PTC侵襲和轉(zhuǎn)移。綜前，miR-222通過下調(diào)ASPP2的水平可能是促進PTC侵襲與轉(zhuǎn)移的機制之一，下一步研究可考慮設計miR-222特異性抑制劑，利用體內(nèi)外模型考察抑制PTC轉(zhuǎn)移的效果。