謝靜 林湘林 林芝 丁熙

慢性牙周炎（CP）是菌斑微生物引起的牙周支持組織進(jìn)行性破壞的炎癥性疾病，脂多糖（LPS）在發(fā)病過程中起重要作用［1］，其通過腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白介素-1β（IL-1β）等促炎因子和在細(xì)胞外基質(zhì)降解過程中起關(guān)鍵作用的基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）［2］啟動聯(lián)級反應(yīng)，進(jìn)而引起牙周組織的損傷及基質(zhì)纖維的降解。大蒜素對多種口腔疾病具有良好療效［3］，其在牙周基質(zhì)組織的形成過程中可起重要作用［4］。本研究采用不同濃度LPS作用于hPDLCs，加入6 μg/ml大蒜素，觀察大蒜素對不同程度牙周炎的抗炎及抗基質(zhì)降解的作用，為臨床上使用大蒜素治療牙周炎提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試劑 大蒜素（3 mg/ml）購自山東魯抗辰欣藥業(yè)有限公司，LPS購自Sigma公司，DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶均購自Gibco公司，抗波形絲蛋白單克隆抗體、角蛋白單克隆抗體、Human total MMP-1 ELISA試劑盒、TNF-α ELISA試劑盒、IL-1β ELISA試劑盒均購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.2 組織來源 收集于本院口腔科就診患者因正畸而拔除的無齲壞牙、無牙周疾病的前磨牙和阻生牙，刮取根中1/3牙周膜用于細(xì)胞培養(yǎng)。供牙者年齡12～20歲，無結(jié)締組織疾病，未全身應(yīng)用皮質(zhì)類固醇等藥物，均知情同意。

1.3 研究方法 （1）hPDLCs體外培養(yǎng)：采用組織塊貼壁法，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，免疫組化法進(jìn)行細(xì)胞鑒定，酶消化法常規(guī)傳代，取第5代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。（2）分組：四甲基偶氮唑鹽微量酶反應(yīng)比色法（MTT法）測定細(xì)胞活性，10 cm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)24 h。根據(jù)LPS濃度及大蒜素濃度分組，每組設(shè)6復(fù)孔，具體如下：①空白對照組：含2%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液；②調(diào)零對照組：6 μg/ml大蒜素+含2%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液；③0.1 μg/ml LPS組：0.1 μg/ml LPS+含2%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液；④0.1 μg/ml LPS+6 μg/ml大蒜素組：0.1 μg/ml LPS+6 μg/ml大蒜素+含2%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液；⑤1 μg/ml LPS組：1 μg/ml LPS+含2%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液；⑥1 μg/ml LPS+6 μg/ml大蒜素組：1 μg/ml LPS+6 μg/ml大蒜素+含2%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液；⑦10 μg/ml LPS組：10 μg/ml LPS+含2%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液；⑧10 μg/ml LPS+6 μg/ml大蒜素組：10 μg/ml LPS+6 μg/ml大蒜素+含2%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液。（3）大蒜素對不同濃度LPS誘導(dǎo)的hPDLCs分泌TNF-α、IL-1β及MMP-1的含量測定：取生長狀態(tài)良好的第5代細(xì)胞以2×105/孔接種于96孔板，在溫度37 ℃、5% CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)24 h，棄原培養(yǎng)液，使用無菌磷酸緩沖鹽溶液（PBS）清洗3次，按上述分組方案加藥，37℃、5% CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)48 h，之后收集培養(yǎng)液，采用ELISA試劑盒檢測各組TNF-α、IL-1β及MMP-1的含量，于550 nm處讀取酶標(biāo)儀上的吸光度值（OD值），并通過標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得待測樣本各指標(biāo)的濃度值。各LPS濃度下，各指標(biāo)的抑制率=（1-觀察組值/對照組值）×100%。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件。計量資料以（）表示，進(jìn)行雙尾檢驗(yàn)。采用析因設(shè)計的方差分析比較各組數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學(xué)差異，單獨(dú)效應(yīng)分析采用One-way ANOVA，組間兩兩比較采用Bonferroni法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組TNF-α表達(dá)情況比較 見表1。

表1 各組TNF-α表達(dá)情況比較［pg/ml，（）］

表1 各組TNF-α表達(dá)情況比較［pg/ml，（）］

LPS（μg/ml） 0 0.1 1 10大蒜素 0 15.59±1.1938.65±4.5186.12±9.37106.13±8.0412.333 ＜0.001 6 17.34±1.0833.46±4.0765.02±5.85 75.74±5.28 14.330 ＜0.001抑制率（%） -11.22 13.43 24.50 28.63 F值 7.119 4.373 21.884 59.930 P值 0.024 0.063 0.001 ＜0.001組別F值 P值作用濃度

2.2 各組IL-1β的表達(dá)情況比較 見表2。

表2 各組IL-1β的表達(dá)情況比較［pg/ml，（）］

表2 各組IL-1β的表達(dá)情況比較［pg/ml，（）］

LPS（μg/ml） 0 0.1 1 10大蒜素 0 11.71±2.0431.18±4.81 74.01±4.65104.78±8.75336.726 ＜0.001 6 14.47±2.7528.65±3.39 57.67±4.07 70.99±6.10 221.968 ＜0.001抑制率（%） -23.57 8.11 22.08 32.25 F值 3.913 1.113 41.919 60.274 P值 0.076 0.316 ＜0.001 ＜0.001組別F值 P值作用濃度

2.3 各組MMP-1表達(dá)情況比較 見表3。

表3 各組MMP-1表達(dá)情況比較［ng/ml，（）］

表3 各組MMP-1表達(dá)情況比較［ng/ml，（）］

LPS（μg/ml） 0 0.1 1 10大蒜素 0 29.08±2.1157.67±3.5380.01±4.1698.42±8.03 10.510 ＜0.001 6 30.78±2.3648.95±5.6361.15±3.8071.61±5.03 95.927 ＜0.001抑制率（%） -5.85 15.12 23.57 27.24 F值 1.741 10.338 67.346 48.061 P值 0.216 0.009 ＜0.001 ＜0.001組別F值 P值作用濃度

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)，在患有嚴(yán)重牙周附著喪失及牙槽骨吸收的牙周炎患者的牙周組織中，TNF-α、IL-1β的表達(dá)明顯升高，表明其在炎癥中發(fā)揮關(guān)鍵作用［5］。TNF-α作為主要的促炎因子之一，可刺激機(jī)體產(chǎn)生多種炎癥因子，并誘導(dǎo)破骨細(xì)胞成熟、促進(jìn)骨組織吸收破壞，從而導(dǎo)致疾病進(jìn)展［6］。在TNF-α拮抗劑的作用下，齦溝液中TNF-α的表達(dá)明顯降低，牙齦炎癥狀況可得到改善［7］。此外，IL-1β也是牙周炎中的關(guān)鍵細(xì)胞因子，可趨化炎癥細(xì)胞及相關(guān)因子在炎癥區(qū)域聚集浸潤，促進(jìn)破骨效應(yīng)，誘導(dǎo)骨質(zhì)流失，促進(jìn)牙周炎進(jìn)展。有研究顯示，牙周炎患者深部牙周袋中IL-1β濃度明顯升高，而在有效治療后其濃度明顯下降［8］。MMPs是一種可降解細(xì)胞外基質(zhì)的蛋白水解酶，可通過直接降解膠原蛋白或激活纖溶蛋白酶級聯(lián)反應(yīng)破壞結(jié)締組織，是牙周炎進(jìn)展的重要因子。MMP-1是成纖維細(xì)胞型膠原酶，可特異性降解Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型膠原，參與有機(jī)基質(zhì)和膠原纖維的降解。

筆者前期有研究大蒜素對LPS作用下hPDLCs膠原代謝的影響，發(fā)現(xiàn)6 μg/ml濃度的大蒜素對細(xì)胞的刺激較小，降低LPS對hPDLCsⅠ型膠原合成及分泌的抑制作用的效果也較明顯［4］，故本研究觀察組的大蒜素濃度設(shè)定為6 μg/ml。本研究結(jié)果顯示，在未添加大蒜素的情況下，隨著LPS濃度的逐漸增高，TNF-α、IL-1β及MMP-1的表達(dá)也呈增高趨勢，提示不同濃度LPS對hPDLCs具有不同程度的炎癥刺激作用，一定范圍內(nèi)較高濃度的LPS刺激產(chǎn)生炎癥因子的能力較強(qiáng)。同時LPS作用于hPDLCs后也可促進(jìn)MMP-1的分泌，分泌程度也呈LPS濃度依賴性。在添加6 μg/ml大蒜素后，雖然LPS濃度越高，TNF-α、IL-1β及MMP-1的增高趨勢未變，但總體上與未添加大蒜素時相比均有所下降。在0.1 μg/ml LPS作用下，6 μg/ml大蒜素組與未添加大蒜素組比較，TNF-α、IL-1β及MMP-1均有所下降，但TNF-α、IL-1β差異無統(tǒng)計學(xué)意義，提示6 μg/ml大蒜素對低濃度LPS刺激下的hPDLCs抑制炎癥因子作用不明顯。在1 μg/ml、10 μg/ml LPS作用下，6 μg/ml大蒜素組與未添加大蒜素組比較，TNF-α、IL-1β及MMP-1均有較大幅度的下降，三者差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，并且10 μg/ml LPS作用下6 μg/ml大蒜素對三者的抑制率高于1 μg/ml LPS作用下6 μg/ml大蒜素對三者的抑制率。以上結(jié)果提示，6 μg/ml大蒜素對較高濃度LPS刺激下的hPDLCs抑制炎癥因子及MMP-1作用較明顯，且在一定范圍內(nèi)LPS濃度越高，其抑制的效率也越高；與輕度牙周炎患者相比，大蒜素針對中、重度牙周炎患者可能具有更好的抗炎及抗基質(zhì)降解作用。值得注意的是，在無LPS刺激的情況下，6 μg/ml大蒜素組與未添加大蒜素組比較，TNF-α、IL-1β及MMP-1均有所增高，雖然僅TNF-α差異有統(tǒng)計學(xué)意義，但此結(jié)果是否提示大蒜素本身的刺激對hPDLCs具有促炎及促基質(zhì)降解作用，尚需進(jìn)一步的研究探討。

綜上，不同濃度LPS作用于hPDLCs后可促進(jìn)TNF-α、IL-1β及MMP-1的分泌，分泌程度呈LPS濃度依賴性。6 μg/ml大蒜素對不同濃度LPS刺激下的hPDLCs炎癥因子及MMP-1具有抑制作用，其抑制效率在一定范圍內(nèi)與LPS濃度成正比，提示大蒜素對中、重度牙周炎患者可能具有更好的抗炎及抗基質(zhì)降解作用。