孫培利，談花，王曉燕，曹效海，王樹林，2*

（1.青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院，青海西寧810016；2.青海大學(xué)省部共建三江源生態(tài)與高原農(nóng)牧業(yè)國家重點實驗室，青海西寧810016）

膠原蛋白主要分布在動物皮膚及軟骨組織中，占總蛋白質(zhì)的25%～30%，I型膠原蛋白由3條α鏈組成，每條α鏈約由1 014個氨基酸組成，分布相對較廣[1-3]。因膠原蛋白具有一定的功能特性，如低免疫原性、生物可分級性、生物相容性、親水性、易加工性等[1]，引起廣大學(xué)者的興趣，通過對其提取方法及理化性質(zhì)的研究發(fā)現(xiàn)，膠原蛋白是一種可降解的生物材料，應(yīng)用領(lǐng)域廣泛[4]，具有難以替代的生物學(xué)價值。

目前，關(guān)于膠原蛋白的提取工藝因原料或所需產(chǎn)品的性質(zhì)而有所不同。Muralidharan等[5]用胃蛋白酶提取鰱魚膠原蛋白，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electro－pheresis，SDS-PAGE）及微觀結(jié)構(gòu)表征其為Ⅰ型膠原蛋白。王曉軍等[6]以牦牛骨為原料，提取酸溶性及酶溶性膠原蛋白，發(fā)現(xiàn)采用酶解法提取的牦牛骨膠原蛋白提取率較高。溫慧芳等[7]通過堿法提取鮰魚皮膠原蛋白，發(fā)現(xiàn)在料液比 1∶10（g/mL）、溫度 70℃條件下，添加1.6%的氫氧化鈣提取9 h，提取率高達(dá)79.67%。Kim等[8]采用超聲輔助酸法提取魚皮膠原蛋白，發(fā)現(xiàn)在0.1 mol/L乙酸介質(zhì)中，以80%振幅處理魚皮3 h與只添加乙酸處理相比，得率高出4.4倍?？梢?，膠原蛋白的提取方法各異，且提取材料多集中在魚類加工副產(chǎn)物中，而對牦牛蹄筋膠原蛋白的提取鮮有報道。牦牛蹄筋作為烹飪原料，有悠久的食用歷史[9]，較高的膠原蛋白含量（約19%）使其成為獲取膠原蛋白的原料之一。青海省在國內(nèi)擁有牦牛數(shù)量最多，其牦牛蹄筋資源豐富，將其作為原料生產(chǎn)膠原蛋白，具有廣闊的市場前景。

本試驗以牦牛蹄筋為原料，采用熱水法及酶解法提取牦牛蹄筋膠原蛋白，優(yōu)化提取工藝，獲得最佳提取方法，旨在充分利用青海牦牛蹄筋資源，為牦牛蹄筋新資源的開發(fā)提供新的方法及研究數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

青海牦牛蹄筋：青海百德食品有限公司；胃蛋白酶（200 U/mg）：河南三化生物科技有限公司；L-羥脯氨酸（純度>99%）：中國食品藥品檢定研究院；高氯酸：天津政成化學(xué)制品有限公司；氯胺T：福晨化學(xué)試劑有限公司；氫氧化鈉：天津市河?xùn)|區(qū)紅巖試劑廠；正丁醇：天津市凱通化學(xué)試劑有限公司；對二甲氨基苯甲醛：天津市瑞金特化學(xué)品有限公司；硫酸：江蘇彤晟化學(xué)試劑有限公司。以上化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

冷凍干燥機(jī)（CS55-9）：北京博醫(yī)康儀器有限公司；紫外可見分光光度計（UV-1780）：島津企業(yè)管理有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 牦牛蹄筋膠原蛋白提取工藝

牦牛蹄筋→預(yù)處理→去雜→脫脂→提取→離心→鹽析→離心→透析→冷凍干燥→成品

1.3.2 關(guān)鍵操作點

1.3.2.1 樣品預(yù)處理

牦牛蹄筋樣品的處理參照盧靜等[10]的方法。將冷凍牦牛蹄筋解凍，切碎后加入NaOH溶液，浸泡除去雜蛋白和部分色素，用蒸餾水洗至中性，加入正丁醇進(jìn)行脫脂處理，用蒸餾水洗至中性，充分瀝干備用。

1.3.2.2 熱水法提取牦牛蹄筋膠原蛋白

熱水法提取牦牛蹄筋膠原蛋白參照溫慧芳等[11]的方法。

1.3.2.3 酶解法提取牦牛蹄筋膠原蛋白

酶解法提取牦牛蹄筋膠原蛋白參照王杉杉[4]的方法。

1.3.3 提取方法的比較研究

試驗采用熱水法和酶解法對牦牛蹄筋中膠原蛋白進(jìn)行提取。均進(jìn)行3次平行試驗，通過測定膠原蛋白得率、提取率及純度，比較兩種提取方法的差異，篩選適宜的提取方法。

1.3.4 酶解法提取牦牛蹄筋膠原蛋白工藝單因素試驗

按1.3.2.3酶解法，固定牦牛蹄筋膠原蛋白料液比1∶15（g/mL），溫度 37 ℃，時間 12 h，加酶量 3%，調(diào)節(jié)pH 3，以牦牛蹄筋膠原蛋白得率、提取率及純度為測定指標(biāo)，考察料液比[1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30（g/mL）]、溫度（35、37、39、41、43 ℃）、時間（6、9、12、15、18 h）和加酶量（1%、2%、3%、4%、5%）對牦牛蹄筋膠原蛋白提取工藝的影響。

1.3.5 酶解法正交試驗

在單因素試驗基礎(chǔ)上，選擇料液比、溫度、時間和加酶量為因素，以牦牛蹄筋膠原蛋白得率、提取率及純度為指標(biāo)，對酶解法提取牦牛蹄筋膠原蛋白工藝進(jìn)行L9（34）正交優(yōu)化試驗，因素水平見表1。

表1 酶解法提取牦牛蹄筋膠原蛋白正交試驗因素水平設(shè)計Table 1 Factor and level of orthogonal test for extracting collagen by enzyme digestion

1.4 指標(biāo)的測定方法

1.4.1 膠原蛋白得率計算

獲得的膠原蛋白粗品與提取原料的比值即為膠原蛋白得率。計算公式如下。

1.4.2 膠原蛋白提取率計算

L-羥脯氨酸含量的測定參照GB/T 9695.23—2008《肉與肉制品羥脯氨酸含量測定》[12]。以L-羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出L-羥脯氨酸濃度與吸光值的回歸方程為y=0.1438x+0.092(R2=0.999)。

膠原蛋白提取率按公式（2）、（3）、（4）計算。

式中：X為試樣中羥脯氨酸的含量，%；C為試樣中羥脯氨酸的濃度，μg/mL；m為稱取試樣的質(zhì)量，g；V為濾液體積，mL。

1.4.3 膠原蛋白純度測定

膠原蛋白純度計算公式如公式（5）。

1.5 數(shù)據(jù)處理

使用Excel 2010和Spss 20.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。試驗結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取方法的篩選

熱水法和酶解法提取牦牛蹄筋膠原蛋白結(jié)果如圖1所示。

圖1 不同提取方法下膠原蛋白的得率、提取率及純度Fig.1 Yield,extraction rate and purity of collagen under different extraction methods

結(jié)果顯示，酶解法和熱水法提取的膠原蛋白得率分別為10.62%、12.91%，其中酶解法獲得的膠原蛋白的提取率及純度分別為63.94%、78.44%，熱水法獲得的膠原蛋白的提取率及純度分別為49.67%、57.78%。熱水法提取溫度超過40℃，部分膠原蛋白變性成為明膠且發(fā)生水解，使膠原蛋白提取率和純度均有明顯降低[14]。而酶解法提取條件溫和，僅水解膠原蛋白非螺旋結(jié)構(gòu)區(qū)域，提取效果較好[15]。Jeong等[16]研究發(fā)現(xiàn)胃蛋白酶能夠特異性地切割蛇頭魚鱗的膠原端肽區(qū)，這也可能是酶解法的提取率及純度較高的原因。綜合上述分析，選取酶解法進(jìn)行下一步試驗。

2.2 酶解法提取膠原蛋白工藝單因素試驗

2.2.1 料液比對牦牛蹄筋膠原蛋白提取效果的影響

不同料液比對膠原蛋白得率的影響見圖2。

圖2 不同料液比對膠原蛋白得率的影響Fig.2 Effect of different ratios of solid-to-liquid ratios on collagen yield

由圖2可見，牦牛蹄筋膠原蛋白得率隨溶劑體積增加整體呈先升高后降低趨勢，當(dāng)料液比為1∶15（g/mL）時，得率最高為12.83%。由于加酶量與牦牛蹄筋質(zhì)量一定，當(dāng)料液比從 1∶10（g/mL）到 1∶15（g/mL）時，酶能夠充分與底物接觸，從而使牦牛蹄筋膠原蛋白得率增加，而當(dāng)溶劑體積繼續(xù)增加，體系中的酶被過度稀釋，不能與底物充分結(jié)合，導(dǎo)致牦牛蹄筋膠原蛋白得率下降，這與王錫念等[17]的研究結(jié)果相似。

不同料液比對膠原蛋白提取率和純度的影響見圖3。

圖3 不同料液比對膠原蛋白提取率及純度的影響Fig.3 Effect of different solid-to-liquid ratios on collagen extraction rate and purity

由圖3可知，牦牛蹄筋膠原蛋白提取率及純度隨溶劑體積的增加均呈先上升后下降趨勢，在料液比為1∶15（g/mL）時，提取率和純度均達(dá)到最大值，分別為64.09%，78.94%。宋樂等[18]對駱駝?wù)颇z原蛋白的提取中同樣發(fā)現(xiàn)，當(dāng)料液比為1∶15（g/mL），提取率最高。可見，過高的溶劑體積不利于膠原蛋白的提取。綜上結(jié)果分析，在牦牛蹄筋膠原蛋白提取過程中料液比應(yīng)控制在1∶15（g/mL）左右。

2.2.2 溫度對牦牛蹄筋膠原蛋白提取效果的影響

溫度對牦牛蹄筋膠原蛋白得率的影響見圖4。

由圖4可見，隨著溫度升高膠原蛋白得率呈上升趨勢。何云等[19]研究發(fā)現(xiàn)用胃蛋白酶提取鮟鱇魚骨膠原蛋白時，當(dāng)提取溫度超過40℃，膠原蛋白含量急劇下降，與該試驗結(jié)果相反。可能是因為隨著溫度升高，反應(yīng)速率增加，使牦牛蹄筋中其它非膠原物質(zhì)溶出。

圖4 不同溫度對膠原蛋白得率的影響Fig.4 Effect of different temperatures on collagen yield

溫度對牦牛蹄筋膠原蛋白提取率和純度的影響見圖5。

圖5 不同溫度對膠原蛋白提取率及純度的影響Fig.5 Effect of different temperature on collagen extraction rate and purity

由圖5可見，膠原蛋白提取率及純度隨著溫度增加呈先上升后趨于平緩趨勢。當(dāng)溫度為41℃時，膠原蛋白提取率達(dá)到65.07%；而當(dāng)溫度為39℃時，膠原蛋白純度最大，為70.69%?？梢娞崛÷屎图兌茸顑?yōu)值不在同一溫度條件下。研究發(fā)現(xiàn)胃蛋白酶的最適作用溫度在40℃左右[17]，酶促反應(yīng)受溫度的影響較大，溫度過高或過低會影響酶活性及反應(yīng)速率[20]。當(dāng)溫度為41℃時，胃蛋白酶活性較高，因此使膠原蛋白提取率增加。Muyonga等[21]研究發(fā)現(xiàn)，生活在寒冷環(huán)境中的魚類的膠原蛋白羥脯氨酸含量低，熱穩(wěn)定性差。牦牛生活環(huán)境寒冷，因此其膠原蛋白熱穩(wěn)定性可能較低，溫度的升高會使膠原蛋白易發(fā)生降解。相關(guān)研究表明膠原蛋白在較高的溫度下結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，進(jìn)而使膠原蛋白結(jié)構(gòu)中的α-肽鏈被切斷，產(chǎn)生多肽[22]，致使膠原蛋白純度下降。綜上結(jié)果分析，牦牛蹄筋膠原蛋白提取溫度控制在41℃時較為適宜。

2.2.3 時間對牦牛蹄筋膠原蛋白提取效果的影響

時間對牦牛蹄筋膠原蛋白得率的影響見圖6。

圖6 不同時間對膠原蛋白得率的影響Fig.6 Effect of different time on collagen yield

由圖6可見，隨著時間延長膠原蛋白得率呈先上升后下降的變化趨勢，在9 h時牦牛蹄筋膠原蛋白得率最大，為12.09%。研究報道，膠原蛋白的等電點在pH6～9之間[23]，表明膠原蛋白在微酸性及堿性體系中溶解度相對較大[24]，當(dāng)時間超過12 h時，提取出的膠原蛋白在酸性環(huán)境中復(fù)溶于提取液，并在酶的作用下降解，在透析過程中流失[6]，從而使膠原蛋白得率降低。

時間對牦牛蹄筋膠原蛋白提取率和純度的影響見圖7。

圖7 不同時間對膠原蛋白提取率及純度的影響Fig.7 Effect of different time on collagen extraction rate and purity

由圖7可見，隨著時間延長，膠原蛋白提取率及純度均呈先升高后降低的趨勢。當(dāng)時間9 h時，提取率和純度均達(dá)到最大，分別為66.92%、79.69%。原因可能是，隨著提取時間的延長，提取出的膠原蛋白被水解為膠原蛋白肽。同時，牦牛蹄筋膠原蛋白中羥脯氨酸的含量較高[25]，長時間的水解可能對羥脯胺酸產(chǎn)生不利的影響[7]，從而導(dǎo)致牦牛蹄筋膠原蛋白提取率及純度降低。綜合上述分析，并結(jié)合實際能源節(jié)約問題，牦牛蹄筋膠原蛋白在提取過程中酶解時間應(yīng)控制在9 h時較為適宜。

2.2.4 加酶量對牦牛蹄筋膠原蛋白提取效果的影響

加酶量對牦牛蹄筋膠原蛋白得率的影響見圖8。

由圖8可見，隨著加酶量增加，牦牛蹄筋膠原蛋白得率總體呈先升高后降低趨勢，在加酶量為2%時，得率最高為15.05%。原因可能是：當(dāng)所添加的酶與底物充分反應(yīng)后，繼續(xù)增加酶的量，只會將所得的膠原蛋白降解，并不能提高其得率。

圖8 不同加酶量對膠原蛋白得率的影響Fig.8 Effect of different enzyme additions on collagen yield

加酶量對牦牛蹄筋膠原蛋白提取率及純度的影響見圖9。

由圖9可見，提取率及純度均呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢。當(dāng)加酶量在2%～3%時，提取率分別為64.93%、63.41%，之后迅速下降；純度分別為79.16%、78.45%，之后迅速下降。這可能是由于在提取過程中，持續(xù)增加胃蛋白酶量可能導(dǎo)致酶相互附著，降低胃蛋白酶與底物的傳質(zhì)效率[26]，影響膠原蛋白的溶解提取，同時會破壞膠原蛋白的三螺旋結(jié)構(gòu)[27]，使提取的牦牛蹄筋膠原蛋白發(fā)生酶解，產(chǎn)生低分子量的肽，從而使膠原蛋白提取率及純度下降[28]。綜合上述分析，在牦牛蹄筋膠原蛋白提取過程中，加酶量應(yīng)控制在2%較為適宜。

圖9 不同酶添加量對膠原蛋白提取率及純度的影響Fig.9 Effect of different enzyme addition on collagen extraction rate and purity

2.3 正交試驗結(jié)果

酶解法提取牦牛蹄筋膠原蛋白正交試驗結(jié)果見表2。

表2 酶解法提取牦牛蹄筋膠原蛋白正交試驗結(jié)果分析Table 2 Results of orthogonal test for extraction of yak tendon collagen by enzymolysis

以牦牛蹄筋膠原蛋白得率、提取率及純度為考察指標(biāo)，由極差分析得，各因素對膠原蛋白得率影響大小為 rB＞rC＞rA＞rD，最優(yōu)提取工藝 A2B3C3D2；各因素對膠原蛋白提取率影響大小為RB＞RC＞RA＞RD，最優(yōu)提取工藝A1B3C3D3；各因素對膠原蛋白純度影響大小為ZA＞ZB＞ZC＞ZD，最優(yōu)提取工藝 A1B2C3D3。 可見各因素對牦牛蹄筋膠原蛋白得率、提取率及純度的影響大小有差異，最優(yōu)提取工藝也不相同。由極差分析數(shù)據(jù)可知，加酶量對牦牛蹄筋膠原蛋白得率、提取率、純度的影響均最小，綜合考慮，選擇牦牛蹄筋膠原蛋白提取最優(yōu)工藝組合為A1B3C3D3，即加酶量2.5%，料液比1∶12（g/mL），溫度 43 ℃，時間 11 h，膠原蛋白的得率、提取率及純度分別為14.91%、69.94%和89.44%。

2.4 驗證試驗

為進(jìn)一步確定酶解法提取牦牛蹄筋最佳工藝條件，對正交試驗的提取工藝組合A1B3C3D3進(jìn)行3次重復(fù)試驗，結(jié)果表明，牦牛蹄筋膠原蛋白平均提取率為（69.82±0.32）%，得率為（15.11±0.85）%，純度為（89.95±1.16）%。

3 結(jié)論

從牦牛蹄筋膠原蛋白得率、提取率和純度可以看出酶解法更有利于提取牦牛蹄筋膠原蛋白。通過正交優(yōu)化試驗發(fā)現(xiàn)，酶解法的最佳工藝條件為：料液比1∶12（g/mL）、溫度 43℃、時間 11 h、加酶量 2.5%，此時的平均提取率為（69.82±0.32）%，得率為（15.11±0.85）%，純度為（89.95±1.16）%。料液比、溫度、時間、加酶量等因素影響膠原蛋白的提取，因此在試驗過程中應(yīng)嚴(yán)格把控酶解條件，以獲得更高的膠原蛋白提取率。試驗所建立的工藝流程為高原牦牛蹄筋中深加工膠原蛋白的規(guī)?；a(chǎn)提供了有力依據(jù)。