張杉，周瑞澤，張文超，裴帆，史海良

（北京市食品安全監(jiān)控和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中心，北京100094）

腎上腺素（A或E）由腎上腺釋放，其生物合成主要是在髓質(zhì)嗜鉻細(xì)胞中先形成去甲腎上腺素，再進(jìn)一步經(jīng)苯乙胺-N-甲基轉(zhuǎn)移酶的作用，使去甲腎上腺素甲基化而形成。作為激素和神經(jīng)傳送體，腎上腺素可直接興奮腎上腺素α和β受體，使心臟收縮力上升，可擴(kuò)張心臟、肝以及筋骨附近的血管，同時(shí)收縮皮膚、黏膜的血管，臨床上主要用于過敏性休克[1]、急性哮喘[2-3]及心搏驟停[4-6]等。

多巴胺（dopamine，或 3-羥酪胺，3，4-二羥苯丙胺）是酪氨酸在代謝過程中經(jīng)二羥苯丙氨酸所產(chǎn)生的中間產(chǎn)物，又名兒茶酚乙胺或羥酪胺。作為神經(jīng)傳導(dǎo)物質(zhì)，多巴胺可幫助細(xì)胞傳送脈沖調(diào)控中樞神經(jīng)系統(tǒng)的多種生理功能。除了作為去甲腎上腺素的前體外，還是維持錐體外系神經(jīng)功能的重要神經(jīng)介質(zhì)。多巴胺具有β受體激動(dòng)作用，也有一定的α受體激動(dòng)作用，臨床上主要用于心臟手術(shù)[7-8]、腎功能衰竭[9]、心肌梗死[10]等各種類型的休克。

腎上腺素和多巴胺同屬于β-受體激動(dòng)劑（苯乙胺類藥物）中內(nèi)源性兒茶酚胺類神經(jīng)遞質(zhì)[11-12]，與人們的健康與疾病密切聯(lián)系，在人體組織系統(tǒng)的生理活動(dòng)中起著廣泛的調(diào)節(jié)作用。但這兩種藥物作為動(dòng)物生長(zhǎng)促進(jìn)劑的不規(guī)范使用并通過食物鏈進(jìn)入人體，會(huì)影響人體中樞神經(jīng)系統(tǒng)和心腎等器官的血液循環(huán)，出現(xiàn)各系統(tǒng)缺血癥狀和功能損害等不良反應(yīng)。2002年農(nóng)業(yè)部頒布的第235號(hào)公告中規(guī)定了腎上腺素在所有食品動(dòng)物中允許使用，但不需要制定殘留限量，未規(guī)定多巴胺的限量。2010年農(nóng)業(yè)部頒布的第176號(hào)公告規(guī)定了鹽酸多巴胺禁止在飼料和動(dòng)物飲用水中使用。2010年國(guó)家頒布的禁止在食品中添加的藥物品種名錄中明確規(guī)定在動(dòng)物食品中腎上腺素受體激動(dòng)劑類藥物均不得檢出，并未提及腎上腺素和多巴胺。目前國(guó)家尚未制定食品中相應(yīng)的殘留限量標(biāo)準(zhǔn)，只在2008年奧運(yùn)會(huì)的賽事食品監(jiān)測(cè)中規(guī)定了腎上腺素的臨時(shí)限量值。關(guān)于腎上腺素和多巴胺的研究多見于大鼠組織、人體血尿中的報(bào)道，檢測(cè)方法主要有毛細(xì)管電泳法[13-15]、電化學(xué)分析方法[15]，熒光光譜法[15]，分光光度法[16]、酶聯(lián)免疫分析法[17]、液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法[18-22]、液相色譜法[23-25]；現(xiàn)行國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 21036—2007《飼料中鹽酸多巴胺的測(cè)定高效液相色譜法》為飼料中鹽酸多巴胺的高效液相色譜檢測(cè)法，NY/T 3147—2017《飼料中腎上腺素和異丙腎上腺素的測(cè)定液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》為飼料中腎上腺素的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，未見食品中腎上腺素和多巴胺的標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法。因此，亟需出臺(tái)相關(guān)政策和檢測(cè)方法合理規(guī)范和監(jiān)控動(dòng)物源性食品中腎上腺素和多巴胺的殘留。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豬肉、牛肉、羊肉、熱狗腸、雞蛋、牛奶、蛋糕：市售。磷酸二氫鉀、乙二酸四乙酸二鈉、三氯乙酸、氨水（均為分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；乙酸銨、甲醇、乙腈、甲酸（均為色譜純）：德國(guó)Fisher公司；腎上腺素（純度99.7%）、鹽酸多巴胺（純度99.8%）：中國(guó)食品藥品檢定研究院；腎上腺素-D3（純度97.0%）：加拿大TRC公司；水為GB/T 6682規(guī)定的一級(jí)水；Waters Oasis WCX 固相萃取柱（3 mL，60 mg）：美國(guó) Waters公司；0.22 μm有機(jī)尼龍濾膜：美國(guó)博納艾杰爾公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent 1290超高效液相色譜串聯(lián)Agilent 6470三重四極桿質(zhì)譜儀，配有電噴霧電離源（ESI）：美國(guó)Agilent公司；GL-88B型渦旋混合器：中國(guó)海門市其林貝爾公司；KQ-5200型超聲波清洗儀：中國(guó)昆山市超聲儀器有限公司；冷凍離心機(jī)：美國(guó)Thermo公司；正壓固相萃取儀：美國(guó)J2公司。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

分別準(zhǔn)確稱取10 mg各標(biāo)準(zhǔn)品（精確至0.000 1 g），置于10 mL棕色容量瓶中，用0.1%甲酸甲醇溶液溶解并定容至刻度，配成濃度為1 000 mg/L標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，-18℃保存。

分別吸取適量腎上腺素和多巴胺標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用0.1%甲酸甲醇溶液稀釋并定容至刻度，配成濃度為1.0 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。

吸取適量腎上腺素-D3標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用0.1%甲酸甲醇溶液稀釋并定容至刻度，配成濃度為1.0 mg/L的內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.4 儀器條件

1.4.1 質(zhì)譜條件

電離方式：電噴霧電離，ESI；毛細(xì)管電壓：3 500 V；干燥氣：氮?dú)?；干燥氣溫度?25℃；干燥氣流速：5L/min；檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（multiple reaction monitoring，MRM）；霧化氣壓力：45 psi（1 psi=6.895 kPa）；鞘氣溫度：350℃；鞘流氣流量：11 L/min。

1.4.2 液相條件

色譜柱：Thermo Hypersil GOLD（50 mm×4.6 mm，1.9 μm）；流動(dòng)相流速：0.3 mL/min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：5 μL；流動(dòng)相A相為0.1%甲酸溶液，B相為乙腈；流動(dòng)相梯度洗脫條件見表1。

表1 液相色譜梯度洗脫條件Table 1 Gradient elution program

1.4.3 試樣的提取與凈化

1.4.3.1 提取

稱取約2.00 g肉及肉制品試樣（精確至0.01 g），加入100.0 μL同位素內(nèi)標(biāo)工作液，加入2 mL水，渦旋混勻，加入4%磷酸鹽緩沖液8 mL，渦旋30 s，20℃超聲10 min，4℃條件下9 500 r/min離心5 min，移取上清液5 mL，用氨水調(diào) pH6～7，待凈化。

稱取約2.00 g蛋、乳及蛋乳制品（精確至0.01 g），加入100.0 μL同位素內(nèi)標(biāo)工作液，渦旋混勻，加入4%磷酸鹽緩沖液8 mL，渦旋1 min，4℃條件下9 500 r/min離心5min，移取上清液5mL，用氨水調(diào)pH6～7，待凈化。

1.4.3.2 凈化

待凈化液過WCX固相萃取柱（依次用甲醇3 mL、水3 mL活化），20 mmol/L乙酸銨溶液3 mL、甲醇3 mL淋洗，50%乙腈溶液（含2%甲酸）2 mL洗脫，渦旋混勻洗脫液，0.22 μm有機(jī)尼龍濾膜過濾后供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜條件的確定

采用直接進(jìn)樣方式分別將濃度為100 ng/mL的腎上腺素、腎上腺素-D3和多巴胺注入離子源中，在正離子檢測(cè)方式下進(jìn)行母離子全掃描，得到腎上腺素、腎上腺素-D3和多巴胺的準(zhǔn)分子離子峰分別為m/z 184.1、187.1和154.1。以該準(zhǔn)分子離子峰為母離子，再對(duì)破碎電壓和碰撞能量等進(jìn)行優(yōu)化，使定性離子與定量離子產(chǎn)生的離子對(duì)強(qiáng)度比例達(dá)到最大時(shí)為最佳，得到腎上腺素、腎上腺素-D3和多巴胺的最佳質(zhì)譜參數(shù)，參數(shù)如表2。

表2 腎上腺素和多巴胺的質(zhì)譜參數(shù)Table 2 MS parameters for epinephrine and dopamine

2.2 液相條件的優(yōu)化

2.2.1 流動(dòng)相的優(yōu)化

比較甲醇和乙腈的洗脫效果，發(fā)現(xiàn)甲醇和乙腈對(duì)腎上腺素和多巴胺的洗脫能力相當(dāng)，出峰時(shí)間相似，在被測(cè)試的C18色譜柱上甲醇對(duì)基質(zhì)的分離效果不如乙腈好，選用乙腈和0.1%甲酸溶液梯度洗脫，分離效果較好。因此，確定流動(dòng)相為A相0.1%甲酸溶液，B相乙腈。

2.2.2 色譜柱的選擇

以乙腈和0.1%甲酸溶液為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，在ESI正模式下，比較了①Waters ACCQ-TAGTMULTRA C18（100mm×2.1mm，1.7μm）、②資生堂ADMN（100mm×2.1mm，5μm）、③Waters HILLC（100mm×2.1mm，1.7μm）和④Thermo Hypersil GOLD（50 mm×4.6 mm，1.9 μm）4種色譜柱對(duì)腎上腺素和多巴胺的分離效果。目標(biāo)化合物在不同色譜柱上的色譜圖見圖1。

如圖1所示，在ULTRA C18色譜柱上，腎上腺素和多巴胺的保留時(shí)間為0.6 min，保留較差，且響應(yīng)值低于2×103；腎上腺素和多巴胺在ADMN色譜柱上保留時(shí)間為1.4 min和1.6 min，但多巴胺的峰形很差；HILLC色譜柱在2.5 min后出現(xiàn)多個(gè)色譜峰，標(biāo)準(zhǔn)系列工作液不成線性關(guān)系，無法確認(rèn)兩種化合物的出峰時(shí)間；Hypersil GOLD色譜柱上目標(biāo)化合物的出峰時(shí)間在2 min左右，保留時(shí)間偏差小于2.5%，且能有效地排除基質(zhì)干擾。因此選擇Thermo Hypersil GOLD色譜柱（50 mm×4.6 mm，1.9 μm）進(jìn)行后續(xù)方法優(yōu)化及樣品分析。

圖1 目標(biāo)化合物在不同色譜柱上的色譜圖Fig.1 Chromatogram of target compounds on different columns

2.3 提取溶劑的選擇

腎上腺素和多巴胺在動(dòng)物組織和生物樣品中主要以硫酸軛合物或葡萄醛酸軛合物等形式存在，樣品要先進(jìn)行水解，使待測(cè)物游離或從組織中釋放以進(jìn)行后續(xù)的溶劑提取。有機(jī)溶劑和pH值直接影響提取效率[15]。

本試驗(yàn)選取了豬肉作為基質(zhì)，選取了80%乙腈溶液（含2%甲酸）、80%乙腈溶液（含5%甲酸）、4%磷酸鹽緩沖液（含有三氯乙酸）、0.1 mol/L鹽酸和0.4 mol/L高氯酸作為提取液，通過加入200 ng/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液考察提取效果，結(jié)果如圖2。

圖2 不同提取溶劑回收率對(duì)比Fig.2 Effect of extraction solvents on the recoveries

由圖2可知，其中兩種含酸的乙腈溶液的回收率為40%～60%，而且重現(xiàn)性較差[相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）大于 20%]，由于高氯酸具有氧化性，兒茶酚類化合物容易被氧化，所以0.4 mol/L高氯酸的回收率只有40%，使用含有三氯乙酸的4%磷酸鹽緩沖液提取目標(biāo)化合物時(shí)，回收率均超過了80%（RSD小于10%），所以采用4%磷酸鹽緩沖液提取目標(biāo)化合物。

2.4 超聲條件的選擇

超聲時(shí)間和超聲溫度的優(yōu)化結(jié)果見圖3、圖4。

圖3 超聲時(shí)間的優(yōu)化Fig.3 Optimization of ultrasonic time

由于動(dòng)物源性食品中含有脂肪、蛋白質(zhì)等成分，會(huì)對(duì)待測(cè)物質(zhì)產(chǎn)生較大的影響，因此，在選擇提取方式時(shí)，既要降低基質(zhì)的干擾，又要提高提取效率。勻漿提取容易造成試樣的交叉污染，且操作繁瑣；振蕩提取需要的時(shí)間較長(zhǎng)；超聲提取操作簡(jiǎn)便，不易損失，不易造成交叉污染，但要控制好溫度和時(shí)間。選取了功率為1 200 W的超聲波清洗儀，首先，超聲溫度為20℃時(shí)，考察豬肉試樣在不同的超聲時(shí)間（10、20、30 min）對(duì)目標(biāo)化合物的提取效率，結(jié)果顯示隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，目標(biāo)化合物的提取回收率明顯下降（圖3）；然后，超聲時(shí)間為10 min時(shí)，考察豬肉試樣在不同的超聲溫度（20、30、40℃）對(duì)目標(biāo)化合物的提取效率，而隨著超聲溫度的升高，回收率也有下降的趨勢(shì)（圖4），最終采用20℃超聲10 min提取試樣中的目標(biāo)化合物。

圖4 超聲溫度的優(yōu)化Fig.4 Optimization of ultrasonic temperature

2.5 待凈化液pH值的選擇

待凈化液在不同pH值范圍的凈化效果見如圖5。

圖5 目標(biāo)化合物在不同pH值范圍的色譜圖Fig.5 Chromatograms of target compounds in different pH ranges

從圖5中可看出，當(dāng)待凈化液pH＞8時(shí)沒有色譜峰，而且樣液是渾濁的；當(dāng)pH＜5時(shí)，有色譜峰，但響應(yīng)值不高；而pH6～7時(shí)，目標(biāo)化合物的色譜峰明顯，回收率均高于80%。所以采用氨水調(diào)節(jié)待凈化液的pH值范圍為6～7。同時(shí)也考察了1%氫氧化鈉和氨水兩種溶液來調(diào)節(jié)pH值，使用1%氫氧化鈉時(shí)，待測(cè)物有時(shí)可以檢出，有時(shí)無法檢出，極為不穩(wěn)定，故選擇了氨水來調(diào)節(jié)pH值。

2.6 凈化手段的選擇

不同固相萃取柱[①HLB固相萃取柱（3mL，60mg）、②WCX 固相萃取柱（3 mL，60 mg）、③MCX 固相萃取柱（3 mL，60 mg）]的凈化能力見圖 6、圖 7。

圖6 不同固相萃取柱回收率的比較Fig.6 Comparison of recovery rates of different SPE columns

圖7 多巴胺在不同固相萃取柱時(shí)的色譜圖Fig.7 Chromatogram of dopamine on different SPE columns

圖6結(jié)果表明，腎上腺素在MCX固相萃取柱上的回收率只有40%，而在前兩種固相萃取柱上的回收率均大于80%。由圖7可知，多巴胺在WCX固相萃取柱的回收率更好，基質(zhì)干擾更少，可達(dá)到更低的檢出限。因此，最后選定使用WCX固相萃取柱（3 mL，60mg）。

2.7 方法驗(yàn)證

2.7.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限和定量限

吸取適量混合標(biāo)準(zhǔn)工作液以及同位素內(nèi)標(biāo)工作液，用50%乙腈溶液（含2%甲酸）配成濃度分別為10、20、50、100、200、500 ng/mL 的標(biāo)準(zhǔn)系列工作液，標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定液中同位素內(nèi)標(biāo)溶液濃度為50 ng/mL。將標(biāo)準(zhǔn)系列工作液按濃度由低到高分別進(jìn)樣5 μL，測(cè)定結(jié)果經(jīng)線性回歸，得回歸方程（Y為峰面積；X為質(zhì)量濃度，ng/mL），本方法在10 ng/mL～500 ng/mL范圍內(nèi)腎上腺素和多巴胺的線性良好，相關(guān)系數(shù)大于0.999，結(jié)果見表3。

表3 腎上腺素和多巴胺標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程和線性關(guān)系Table 3 Regression equations,correlation coefficients,and linear ranges of epinephrine and dopamine

向空白基質(zhì)中添加不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，以3倍信噪比和10倍信噪比分別測(cè)定方法的檢出限和定量限。畜肉及其制品的檢出限為10 μg/kg，定量限為 25 μg/kg；蛋、乳及蛋奶制品的檢出限為 20 μg/kg，定量限為 50 μg/kg。

2.7.2 回收率與精密度

分別選取具有代表性的試樣進(jìn)行回收率與精密度試驗(yàn)。每組準(zhǔn)確稱取樣品6份，每份2 g，共3組，分別定量加入混合標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，豬牛羊的添加水平1～3分別為 25、50、250 μg/kg，蛋和液體乳的添加水平 1～3 分別為 50、100、500 μg/kg，按確定的檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)，不同濃度的加標(biāo)回收率為81.7%～113.7%，平均相對(duì)標(biāo) 準(zhǔn)偏差為1.0%～10.4%（n=6），結(jié)果見表4。

表4 7種基質(zhì)中腎上腺素和多巴胺加標(biāo)回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差結(jié)果（n=6）Table 4 Recovery and relative standard deviation of epinephrine and dopamine in 7 kinds of matrix（n=6）

3 結(jié)論

本方法采用了含有三氯乙酸的磷酸鹽緩沖液提取，WCX弱陽離子交換固相萃取柱凈化，使用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定動(dòng)物源性食品中的腎上腺素和多巴胺。所得試樣凈化效果好，可將待測(cè)物和干擾物很好的分隔開，重復(fù)性好，可檢測(cè)的基質(zhì)種類多，定量準(zhǔn)確。所以，此法可以同時(shí)對(duì)動(dòng)物源性食品中腎上腺素和多巴胺進(jìn)行有效且準(zhǔn)確的定性定量分析。