賀揚(yáng)潔，張學(xué)俊，，*，謝 玲，陶 菡，*，張萌萌，韓 凌，胡川渝

（1.貴州大學(xué) 貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽 550025；2.貴州大學(xué) 釀酒與食品工程學(xué)院，貴州 貴陽 550025；3.貴州艾科米亞生物科技有限公司，貴州 貴陽 550002）

杜仲樹的含膠活性器官樹皮、樹葉和翅果皮經(jīng)生物酶有針對地降解植物組織，溶出高生物活性天然藥物后，余留的固形物中富含原生態(tài)杜仲膠絲。但此時(shí)杜仲膠絲的純度不超過80%，不能用作工業(yè)原料，該杜仲膠絲稱為粗膠。長絲杜仲粗膠具有憎水性，在酶解水溶液中纏繞成團(tuán)，裹挾大量的未被降解完全的植物組織碎片，嚴(yán)重降低了杜仲橡膠的純度。

當(dāng)前酶生物技術(shù)的研究發(fā)展還不完善，所發(fā)現(xiàn)的生物酶種類有限，未發(fā)現(xiàn)可將植物組織完全降解的生物酶種，從而限制了生物酶解技術(shù)制備杜仲精膠，即僅依靠生物酶的降解技術(shù)不可能獲得純度達(dá)到90%以上的原生態(tài)杜仲精膠，而工信部印發(fā)的《重點(diǎn)新材料首批次應(yīng)用示范指導(dǎo)目錄（2019年版）》中對生物基杜仲橡膠純度的要求為94%～99%，因此不破壞杜仲膠絲天然特性的超聲波物理純化法成為制備高純度杜仲橡膠的必由補(bǔ)償途徑。

目前最常見的杜仲粗膠純化方法為有機(jī)溶劑溶解分離法。利用不飽和烷烴杜仲橡膠易溶于有機(jī)溶劑的特性，杜仲粗膠經(jīng)氯仿、甲苯、二甲苯、汽油、石油醚、正己烷、環(huán)己烷等溶劑溶解后，與不溶的植物組織分離，得到杜仲純膠（塊狀凝聚態(tài)，痕量有機(jī)溶劑），但是溶劑法杜仲純膠也存在細(xì)胞壁碎片殘留的問題，純度不超過96%。

有機(jī)溶劑法杜仲純膠改變了杜仲膠絲的原生態(tài)高級結(jié)構(gòu)，呈塊狀凝聚態(tài)，而超聲波水基純化（物理）法制備的杜仲精膠（水作純化溶劑，呈天然松散絲束狀凝聚態(tài)，無有機(jī)溶劑）則維持了膠絲原有形貌及其物理和化學(xué)性質(zhì)。兩者最大的區(qū)別在于溶劑法杜仲純膠含有殘留溶劑，呈比表面小的塊狀結(jié)構(gòu)，而超聲波水基法杜仲精膠不含有機(jī)溶劑，具有分散性好的大比表面積絲狀結(jié)構(gòu)。

生物基橡膠高聚物是由單體異戊二烯分子經(jīng)細(xì)胞中橡膠聚合酶聚合而成的大分子聚合物。杜仲橡膠是由眾多單根聚異戊二烯高分子長鏈絲彼此獨(dú)立集合成的束狀，具有三級結(jié)構(gòu)：①單體組成成分為一級結(jié)構(gòu)，也叫近程結(jié)構(gòu)；②單根聚合鏈的單體分子鏈接方式為二級結(jié)構(gòu)，或遠(yuǎn)程結(jié)構(gòu)，主要為烯鍵的反式結(jié)構(gòu)；③眾多單根高分子聚合物長鏈分子集中在一起的結(jié)構(gòu)為三級結(jié)構(gòu)或高級結(jié)構(gòu)，也稱為材料的聚集態(tài)。杜仲橡膠呈多根膠絲的固體束狀，三葉橡膠呈顆粒膠的乳液流動狀。

有機(jī)溶劑溶解杜仲橡膠的純化過程是物理和化學(xué)變化過程，雖不會改變其一級和二級結(jié)構(gòu)，但其天然的三級聚集態(tài)結(jié)構(gòu)（晶態(tài)、非晶態(tài)、取向態(tài)、液晶態(tài)、織態(tài)等）卻在溶解和析出過程中發(fā)生巨大變化而失去原有的物理和化學(xué)特征，杜仲膠絲纏繞結(jié)團(tuán)，成品膠為塊狀結(jié)構(gòu)。天然杜仲橡膠的分子為獨(dú)立單鏈，其呈彼此分散的絲狀松散束狀結(jié)構(gòu)。杜仲橡膠屬于半硬性橡膠，不具有粘性，膠絲之間相互獨(dú)立的特性通過水基純化能完整地保留下來，更有利于杜仲橡膠加工過程中的良好分散、分布以及保持其固有特性和功能。

1 縫隙水分子層空化的杜仲橡膠超聲波純化理論

本研究在大量試驗(yàn)探索的基礎(chǔ)上建立并提出了縫隙水分子層空化剝離植物組織碎片以純化杜仲橡膠的超聲波理論。

物理和化學(xué)純化法是制備高純度杜仲橡膠不可或缺的補(bǔ)充手段。相比之下，物理純化法更具有保持杜仲橡膠原有物理和化學(xué)特性的優(yōu)勢。超聲波純化法是一種物理方法，但超聲波在空氣中會被大量吸收，而在液體中吸收較少，因此超聲波純化杜仲橡膠在水溶液中進(jìn)行。

頻率在20 kHz以上的聲波即為超聲波，其以頻率高和波長短而有別于普通聲波，具有近似于光學(xué)的某些性質(zhì)。超聲波頻率越高波長愈短，近場區(qū)范圍愈寬，束射性愈強(qiáng)和定向能力愈大。超聲波定向傳播時(shí)，在兩種不同媒質(zhì)界面上會出現(xiàn)類似光波的透射、反射和折射現(xiàn)象。超聲波傳播時(shí)媒介會吸收其一部分能量，隨著路程的延長和能量的轉(zhuǎn)換，聲波的強(qiáng)度會逐漸減弱。超聲波頻率越高，介質(zhì)的吸收性越強(qiáng)，傳播距離越短，故超聲波純化杜仲橡膠只能小批量、分批進(jìn)行。

根據(jù)有關(guān)聲學(xué)試驗(yàn)，106Hz的超聲波能量比同振幅頻率103Hz的可聽聲波大106倍，即超聲波擁有巨大的能量。聲波的振動使得杜仲橡膠和植物組織碎片隨之受迫振動，接受超聲波的媒介水分子與受迫振動物質(zhì)分子的振動頻率是一致的，物質(zhì)分子的振動狀態(tài)取決于受迫振動的速度，振動頻率越高，振動速度越大。運(yùn)動物體的動能（E）與其質(zhì)量（M）和運(yùn)動速度（v）的關(guān)系為：E＝（1/2）Mv2。根據(jù)上式可知，高速運(yùn)動使物質(zhì)分子具有很大的動能，這就是超聲波擁有巨大能量的緣故。

杜仲橡膠的超聲波純化是高能超聲波剝離、清除杜仲橡膠表面植物組織碎片的過程，是基于超聲波在水溶液中的空化作用以撕裂水分子團(tuán)而形成空腔微氣泡[1]。當(dāng)超聲波空化作用發(fā)生在杜仲橡膠與植物組織碎片之間的縫隙水分子層中時(shí)，形成大量微氣泡，高頻振動的微氣泡帶動杜仲橡膠和植物組織碎片高頻振動，而兩種材料的基本物質(zhì)不同且具有的固有振動頻率不同，其固有頻率差致使彼此間差頻振動而分離。同時(shí)微氣泡膨脹和內(nèi)爆產(chǎn)生的撕裂和巨大擠壓力形成高速的微射流，氣泡內(nèi)爆瞬間產(chǎn)生的沖擊波使氣泡周圍產(chǎn)生1012～1013Pa的壓力及局部高溫[2]，沖擊波破壞植物組織碎片，將植物組織碎片從杜仲膠絲上剝離，凈化膠絲表面。這就是超聲波空化所產(chǎn)生的巨大壓力和振動引起植物組織碎片振動疲勞，使植物碎片對杜仲橡膠表面的附著力減小而剝離。

當(dāng)超聲波作用在水溶液中時(shí)，對水溶液會產(chǎn)生空化、輻射壓和聲流等物理效應(yīng)。液體內(nèi)局部出現(xiàn)拉應(yīng)力而形成負(fù)壓，壓力的降低使原來溶于液體的氣體過飽和，從液體中逸出，成為小氣泡。強(qiáng)大的超聲波拉應(yīng)力把液體“撕開”成一空洞，稱為空化[3]。

當(dāng)超聲波振動使水分子擠壓壓縮時(shí)，水分子所受到壓力是大氣壓加上水分子壓縮時(shí)受到的“聲壓”壓力，而當(dāng)聲波擴(kuò)張疏拉時(shí)水分子被撕扯向四面八方[4]，水分子氫鍵鍵力承受不住撕扯力形成空腔化氣泡。水分子超聲波空化作用集中在拉扯應(yīng)力集中的超聲界面反射密集區(qū)（如圖1所示），氣泡出現(xiàn)在杜仲橡膠與植物組織碎片之間的縫隙水分子層中，如圖1所示。

圖1 杜仲橡膠和植物組織碎片與其縫隙中水分子層形成的界面密集區(qū)Fig.1 Interface dense area formed by eucommia rubber and plant tissue fragments and water molecule layers in crevices

杜仲橡膠是烷烴鏈非極性疏水物質(zhì)，而植物組織是富含親水基團(tuán)羥基、羧基、甲氧基等的極性親水物質(zhì)，兩種物質(zhì)彼此間無任何共價(jià)鍵、離子鍵和氫鍵相連。兩者之間存在著天然的縫隙，但因緊密的生理結(jié)構(gòu)而無法形成縫隙水。酶解除去含膠細(xì)胞壁之后，植物組織與杜仲橡膠之間空出厚度達(dá)12 μm以上的縫隙。從圖1可以看出，縫隙水分子層由于兩組界面層緊密疊加，形成了水分子氫鍵鍵力變化的應(yīng)力集中區(qū)和界面反射的超聲波疊加區(qū)，此區(qū)域內(nèi)空化作用生成大量微氣泡，即水分子氫鍵鍵力變化的應(yīng)力集中區(qū)的水分子團(tuán)承受不住超聲波的擴(kuò)張撕裂作用形成氣泡。這一現(xiàn)象最容易發(fā)生在有雜質(zhì)存在的表面張力差異顯著的水分子層中，即杜仲橡膠、植物組織碎片與水分子接觸的界面集中區(qū)縫隙中，因?yàn)榇藚^(qū)域水分子氫鍵鍵力不連續(xù)且波動明顯。

綜上所述，由于杜仲橡膠、植物組織和水溶液是三類截然不同的物質(zhì)，彼此結(jié)合形成緊鄰的液-固界面，差異明顯的表面張力疊加使其成為超聲波空化小氣泡的集中生成區(qū)。

超聲純化理論指出，微小空化氣泡并不是如許多文獻(xiàn)認(rèn)為的在水體中生成后再鉆進(jìn)縫隙，而是由于兩界面區(qū)不同的表面張力層緊密相鄰，超聲波直接在縫隙水分子層中撕開水層生成大量微氣泡，即應(yīng)力集中區(qū)的縫隙水助力超聲波撕開水體生成空化氣泡，水的空化使其處于低壓力、高流速的狀態(tài)，當(dāng)水壓力小于飽和蒸汽壓力時(shí)，水中的氣泡就會不斷膨脹，體積變大，拉開杜仲橡膠與植物組織碎片的距離。而隨著水運(yùn)動，氣泡到達(dá)高壓力、低流速區(qū)域之后，氣泡就會塌縮、爆裂，引起植物組織碎片的脫落。另一方面，高頻超聲波使微小空化氣泡快速振動，杜仲橡膠和植物組織碎片受迫隨之高速振動，兩種不同物質(zhì)具有不同的固有振動頻率，兩者間的差頻振動使附著在杜仲橡膠上的植物組織碎片脫離?？p隙水分子層氣泡的膨脹和振動是剝離植物組織碎片的原生動力。

縫隙水分子層的超聲波空化原理是從杜仲粗膠中分離植物組織碎片而制備杜仲精膠的基本原理，這就是超聲波剝離杜仲橡膠上的植物組織碎片的超聲波純化理論。

2 實(shí)驗(yàn)

2.1 原材料及化學(xué)試劑

杜仲樹皮，采自貴州省遵義地區(qū)，樹齡為10～20年；杜仲籽皮粗膠，即使杜仲翅果開口后取出果仁，與果仁分離后的籽皮在酶解器中經(jīng)pH緩沖溶液激活后的ZH·Euco-pro蛋白酶、ZH·Euco-pect果膠酶、ZH·Euco-cell纖維素酶酶解籽皮植物組織并提取其桃葉珊瑚苷、綠原酸、京尼平苷酸等天然藥物后，再經(jīng)多次自來水清洗的含膠固體。

ZH·Euco-pro蛋白酶（酶活力為50 000 U·g-1）、ZH·Euco-pect果膠酶（酶活力為50 000 U·g-1）、ZH·Euco-cell纖維素酶（酶活力為50 000 U·g-1）和ZH·Hemicell（酶活力為40 000 U·g-1），市售飼料級食用酶制劑；檸檬酸（食品添加劑，純度99%）和檸檬酸鈉（食品添加劑，純度99%），濰坊英軒實(shí)業(yè)有限公司產(chǎn)品；無水乙醇（分析純99.7%），天津市富宇精細(xì)化工有限公司產(chǎn)品；氫氧化鈉溶液、月桂醇硫酸鈉、蒸餾水和SZ-96A石英蒸餾器，實(shí)驗(yàn)室自制。

2.2 主要儀器

SHA-CA型數(shù)顯水浴恒溫振蕩器，常州普天儀器制造有限公司產(chǎn)品；多頻道超聲儀，寧波新芝生物科技股份有限公司產(chǎn)品；CP214型電子天平，上海奧豪斯儀器有限公司產(chǎn)品；Thermo Heraeus Multifuge X3R型通用臺式離心機(jī)，賽默飛世爾科技公司產(chǎn)品；XW-80A型旋渦混合儀，海門市其林貝爾儀器制造有限公司產(chǎn)品；DF-101S型集熱式恒溫水浴鍋，邦西儀器科技（上海）有限公司產(chǎn)品。

2.3 試驗(yàn)方法

2.3.1 堿液預(yù)處理和生物酶降解細(xì)胞壁試驗(yàn)

將杜仲樹皮（尺寸為6 cm×2 cm）浸泡于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.01的氫氧化鈉溶液中并在40 ℃恒溫振蕩器上振搖48 h，經(jīng)蒸餾水多次洗滌后再放入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.02的氫氧化鈉溶液繼續(xù)浸泡并在40 ℃恒溫振蕩器上振搖24 h，再經(jīng)蒸餾水洗成中性。然后將其放入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.03的半纖維素酶pH緩沖溶液中，在48 ℃恒溫振蕩器上振搖24 h，之后用清水在恒溫振蕩器上洗滌3次，放入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.03的纖維素酶pH緩沖溶液中，在50 ℃恒溫振蕩器上振搖40 h，中間取下3次用玻棒攪拌分散均勻。最后將固形物用自來水洗凈，得到不含任何細(xì)胞壁碎片的杜仲精膠。

2.3.2 超聲波-表面活性劑純化試驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取5 g酶解后杜仲籽皮粗膠，與水溶液混合后進(jìn)行超聲波分離提取。設(shè)定超聲波頻率和功率（400 W），在50 ℃下超聲波作用6 h后停止，固形物過濾并反復(fù)清洗，60 ℃真空烘干，獲得超聲波處理后的杜仲粗膠。將粗膠放入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.02的表面活性劑十二烷基硫酸鈉中，在80 ℃下于磁力攪拌50 h后靜置，由于膠絲密度小于水，因此浮于液面上，收集膠絲并反復(fù)清洗，得到原生態(tài)杜仲精膠。

3 結(jié)果與討論

3.1 杜仲膠絲與植物組織碎片之間的縫隙

杜仲橡膠與植物組織碎片之間一旦有縫，超聲波便能在縫隙水分子層中撕裂水分子形成大量微氣泡，縫隙水分子層中氣泡的振動、內(nèi)爆致使植物組織碎片剝離。由此可見，杜仲膠絲與植物組織碎片之間縫隙的存在是提高超聲純化杜仲橡膠效率的一個(gè)關(guān)鍵因素。

杜仲橡膠和植物組織是完全不同的兩類物質(zhì)，杜仲橡膠的一級結(jié)構(gòu)化學(xué)物質(zhì)是異戊二烯單體，而植物組織碎片的一級結(jié)構(gòu)主體化學(xué)物質(zhì)是糖類聚合物（聚糖、木葡聚糖、甘露聚糖和混聯(lián)型葡聚糖等）。異戊二烯聚合物是疏水的有機(jī)烷烴，糖類聚合物則是富含羥基的六碳糖和五碳糖為主的以α苷鍵和β苷鍵聚合的親水雜多糖聚合物。杜仲橡膠與植物組織僅僅是兩類生物體的生理結(jié)合，彼此間并不存在相連化學(xué)鍵，而是相互獨(dú)立存在[5]，但具有細(xì)微間隔。杜仲橡膠和植物組織這種生理和生物性質(zhì)為超聲波空化剝離杜仲橡膠表面的植物組織碎片提供了基礎(chǔ)條件。

此外，生長在含膠細(xì)胞之中的杜仲橡膠與植物組織之間天生隔著細(xì)胞壁，且與細(xì)胞壁也僅是生理附著并無化學(xué)鍵的連接，為了增大杜仲橡膠與植物組織之間的間隙，強(qiáng)化縫隙中水分子層的空化和振動作用，可以酶促降解杜仲橡膠上殘留的細(xì)胞壁，在杜仲橡膠與植物組織碎片之間留出縫隙。

在杜仲植物的活性器官中含有大量的杜仲橡膠，與三葉橡膠樹生長在樹干形成層的乳管乳液中的三葉橡膠顆粒不同，杜仲橡膠是固體半硬性橡膠，生長在杜仲樹植物組織的含膠細(xì)胞中，而三葉橡膠樹橡膠顆粒的含膠細(xì)胞在成熟時(shí)就已退化消失，只留下無細(xì)胞壁的裸露橡膠顆粒分散在乳管乳液中。成熟的杜仲橡膠始終被含膠細(xì)胞的細(xì)胞壁緊緊包裹。

無論植物組織多復(fù)雜，包裹杜仲橡膠多緊密，在杜仲橡膠與植物組織之間始終存在著一層含膠細(xì)胞的細(xì)胞壁。細(xì)胞壁由胞間層、初生壁和次生壁構(gòu)成，杜仲植物組織中的生理結(jié)構(gòu)關(guān)系依次為：杜仲橡膠、細(xì)胞壁（次生壁、初生壁、胞間層）、植物組織。

由杜仲橡膠在植物組織中的生理結(jié)構(gòu)排列次序可以發(fā)現(xiàn)，杜仲橡膠與植物組織之間被含膠細(xì)胞的細(xì)胞壁分隔，細(xì)胞壁厚達(dá)12～15 μm，細(xì)胞壁組成中纖維素占40%～50%，還有10%～30%的半纖維素，以及細(xì)胞壁特化時(shí)在纖維素形成的細(xì)胞壁框架內(nèi)填充的20%～30%木質(zhì)素，若用纖維素酶和半纖維素酶等有針對性降解除去細(xì)胞壁，細(xì)胞壁的消失會在杜仲橡膠和植物組織之間留下至少12 μm的縫隙。

含膠細(xì)胞在生長過程中其細(xì)胞壁的組成變化十分復(fù)雜[6]，因?yàn)榧?xì)胞壁主要是由纖維素構(gòu)成，在生長環(huán)境影響和生理機(jī)能的作用下發(fā)生各種不同的特化，在纖維素形成的細(xì)胞壁框架內(nèi)填充了其他物質(zhì)，從而改變了細(xì)胞壁的理化性質(zhì)，完成了一定的生理機(jī)能，特別是木質(zhì)化和木栓化的特化阻擋了纖維酶與底物（纖維素）結(jié)合。因此，僅依靠纖維素酶和半纖維素酶無法完全降解細(xì)胞壁。

3.2 超聲波頻率

在制備杜仲精膠的過程中，需兩次采用超聲波處理，一次是纖維素酶降解細(xì)胞壁之前，一次是在細(xì)胞壁被降解之后。這兩次超聲波處理的目的不同，所采用的超聲波頻率不同。

酶解之前，杜仲粗膠中存在大量的杜仲植物組織碎片，相對分子質(zhì)量巨大的纖維素酶分子無法直接趨近和結(jié)合在細(xì)胞壁上并在底物上準(zhǔn)確定向和定位附著[7]。所以必須先用25 kHz左右的低頻超聲波破壞和疏解植物組織結(jié)構(gòu)，以暴露出杜仲橡膠表面的細(xì)胞壁，便于活性生物酶趨近底物。酶解之后，為了剝離杜仲橡膠表面尚未被水解的植物組織碎片，純化且保護(hù)杜仲橡膠的原生態(tài)長絲，采用較高頻率（≥40 kHz）超聲波進(jìn)行處理。

超聲波頻率越低，撕裂水分子能力越強(qiáng)，在水分子層中產(chǎn)生的空化氣泡越少，氣泡越大。低頻率超聲波不但對植物組織碎片有破壞作用，也引起杜仲膠絲的水蝕斷裂。高頻率超聲波方向性強(qiáng)，空化氣泡微小，空化能力小，適合于精細(xì)、柔軟的杜仲橡膠清洗。隨著超聲頻率的增大，氣泡細(xì)化且增多，有利于杜仲膠絲與植物組織碎片剝離，且爆破沖擊力減小，避免了杜仲膠絲的斷裂。

在超聲波處理杜仲橡膠時(shí)涉及功率和頻率。頻率是超聲波引起介質(zhì)單位時(shí)間振動的次數(shù)，僅與材料性質(zhì)有關(guān)，不同材料具有不同吸收和共振頻率；而功率則是某一固定頻率的振幅，振幅越大超聲賦予的能量越大，聲流越強(qiáng)。

純化杜仲橡膠常用的超聲波頻率在20～130 kHz之間，對于大塊植物組織碎片的破壞、分離，一般使用20～40 kHz的超聲波頻率，而對在小間隙、窄狹縫、深孔和盲孔中的細(xì)小植物組織碎片的清除，則需用不低于40 kHz的高頻超聲波，甚至100 kHz超聲波，這樣可大大降低超聲波對杜仲膠絲的水點(diǎn)腐蝕和破壞。試驗(yàn)證實(shí)超聲波處理杜仲橡膠的最佳溫度在50～75 ℃之間。所以酶解之前所用超聲波頻率約為25 kHz，而酶解之后所用超聲波頻率約為60 kHz。

3.3 杜仲橡膠細(xì)胞壁的酶解

杜仲橡膠含膠細(xì)胞的細(xì)胞壁是包圍在原生質(zhì)體外面的具有一定硬度和彈性的薄層，是由原生質(zhì)體分泌的非生命物質(zhì)（纖維素、半纖維素和果膠質(zhì)）組成。在光學(xué)顯微鏡下可以看到果膠將相鄰兩個(gè)細(xì)胞粘連所共有的細(xì)胞壁。

由于環(huán)境的影響和生理機(jī)能不同，細(xì)胞壁會因侵入原生質(zhì)分泌的化學(xué)物質(zhì)變化而引發(fā)其性質(zhì)變化，即木質(zhì)化、木栓化、角質(zhì)化、粘液質(zhì)化和礦質(zhì)化，這稱為特化。其中阻礙纖維素酶和半纖維素酶降解細(xì)胞壁的主要原因是細(xì)胞壁中增生了木質(zhì)素的木質(zhì)化和使細(xì)胞原生質(zhì)體與外界隔離而壞死（成為死細(xì)胞）的木栓化。

酶解除去細(xì)胞壁后，杜仲橡膠與植物組織碎片之間的縫隙中形成的水分子層供超聲波空化作用而產(chǎn)生大量的微氣泡。

目前纖維素酶的酶學(xué)性質(zhì)研究已較清晰。纖維素酶的酶解反應(yīng)與一般酶的酶降解反應(yīng)不同，其最主要的區(qū)別在于纖維素酶不是多酶復(fù)合體而是一個(gè)多酶組成的多酶體系，且底物的結(jié)構(gòu)也極其復(fù)雜。

酶的降解機(jī)理如下。

纖維素酶可使纖維素生成D-葡萄糖、纖維二糖和寡糖。酶的降解作用分3步完成。

（1）趨近效應(yīng)和定向效應(yīng)。酶解反應(yīng)第1步是酶首先趨近底物、識別并與底物取向結(jié)合，這是底物降解的先決條件。底物則需先暴露以便酶的活性中心趨近與之直接結(jié)合。

（2）張力作用。與底物的結(jié)合誘導(dǎo)大分子酶的電子云分布發(fā)生相應(yīng)改變，酶的三、四級結(jié)構(gòu)構(gòu)象隨之發(fā)生變化，對底物產(chǎn)生張力作用，使底物扭曲，結(jié)合部位被作用的分子鏈鍵力減弱而易于斷裂。

（3）酸堿催化作用。酶的活性中心具有某些氨基酸殘基（功能基團(tuán)），這些基團(tuán)往往是良好的質(zhì)子供體或受體，在水溶液中這些廣義的酸性基團(tuán)或堿性基團(tuán)是許多分子鏈斷裂的強(qiáng)力催化劑。

由此可見，在酶解反應(yīng)中，趨近效應(yīng)和隨之發(fā)生的識別定位效應(yīng)是酶解的開始。然而，由于植物組織的復(fù)雜性和組織結(jié)構(gòu)的致密性，杜仲橡膠含膠細(xì)胞的細(xì)胞壁被其他的植物組織緊密地包裹，阻斷了酶向底物的趨近，即使水溶液對植物組織有明顯的浸潤膨脹作用，但相對分子質(zhì)量巨大的纖維素酶分子也無法趨近和定位在細(xì)胞壁底物上。

因此，在纖維素酶降解細(xì)胞壁之前，必須除去和疏解植物組織使細(xì)胞壁底物直接裸露在酶解液中，特別是預(yù)先降解阻擋纖維素酶連續(xù)水解纖維素的木質(zhì)化木質(zhì)素。為此在酶解之前采用破壞植物組織能力強(qiáng)的低頻率（25 kHz）超聲波打散含膠細(xì)胞與植物組織的結(jié)合，破壞植物組織的結(jié)構(gòu)，使纖維素酶能夠直接趨近暴露在外的細(xì)胞壁底物。

試驗(yàn)顯示經(jīng)過生物酶降解后的杜仲膠絲上仍附著有褐色的細(xì)胞壁碎片（見圖2），這是因?yàn)槟举|(zhì)素沉積在纖維素和半纖維素的細(xì)胞壁表層，阻礙了纖維素酶在纖維素上的附著和定位結(jié)合，無法降解纖維素。

圖2 含膠細(xì)胞的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)示意Fig.2 Schematic diagram of cell wall structure of gutta-containing cell

3.4 超聲波剝離植物組織碎片

含膠細(xì)胞的細(xì)胞壁被酶解后，杜仲橡膠與植物組織碎片之間空出至少12 μm厚的縫隙而形成水分子層。超聲波處理之前加入表面活性劑以使水分充分充盈縫隙以觸及到杜仲膠絲，提高杜仲橡膠表面的潤濕性，使水分子更好滲進(jìn)杜仲橡膠與植物組織碎片之間的縫隙中，形成水-膠和水-植物組織碎片界面。

超聲波純化理論指出，超聲波剝離杜仲橡膠表面的植物組織碎片是基于縫隙中水分子層的超聲波空化效應(yīng)，其中低頻超聲波空化效應(yīng)所產(chǎn)生的巨大壓力破壞不溶性植物組織碎片而使它們?nèi)苡谒芤褐?，高頻超聲波空化效應(yīng)使杜仲橡膠與植物組織碎片產(chǎn)生差頻振動，減小了植物組織碎片對杜仲橡膠表面的附著力，氣泡的振動和內(nèi)爆引起植物組織碎片從杜仲橡膠表面剝離，并對杜仲膠絲表面有清潔作用。

不低于40 kHz頻率的高頻超聲波產(chǎn)生的空化氣泡數(shù)多、體積小，集中于縫隙中，穿透力大，內(nèi)爆力小，對杜仲橡膠不會造成任何損害。并且在相同聲強(qiáng)下，40 kHz頻率超聲波產(chǎn)生的空化氣泡數(shù)量比25 kHz頻率超聲波成倍提高，微射流穿透力小，而微小氣泡宜進(jìn)入小縫隙和形狀復(fù)雜的盲孔，適合除去與杜仲橡膠表面結(jié)合力較小的植物組織碎片。

由于細(xì)胞壁與杜仲橡膠表面結(jié)合力大，很難直接用超聲波純化除凈，圖3示出了超聲波-表面活性劑純化的白色籽皮杜仲精膠。

圖3 40 kHz超聲波-表面活性劑純化的籽皮杜仲精膠Fig.3 Seed peel eucommia essence rubber purified by 40 kHz ultrasonic-surfactant

從圖3可以看出，纖維素酶深度酶解的杜仲粗膠經(jīng)過超聲波和表面活性劑純化后，仍然殘留褐色碎片，這種褐色碎片就是含膠細(xì)胞的細(xì)胞壁，因?yàn)榧?xì)胞壁與杜仲橡膠結(jié)合最為緊密，附著力大，很難被超聲波剝離，這也說明了纖維素酶沒能完全降解細(xì)胞壁。分析認(rèn)為，這是因?yàn)槟举|(zhì)化的細(xì)胞壁由于木質(zhì)素的存在阻礙了纖維素酶對纖維素底物的趨近和識別定位，阻斷了纖維素酶降解纖維素的反應(yīng)，從而留下部分細(xì)胞壁碎片。這也是目前本方法制備的杜仲精膠純度無法突破96%的原因。

經(jīng)過氫氧化鈉溶液的水解，除去了木質(zhì)素的細(xì)胞壁暴露出其構(gòu)成胞壁骨架的纖維素組織，使纖維素酶和半纖維素酶得以趨近裸露的組織，并識別底物，定向在相關(guān)對應(yīng)基團(tuán)上相互結(jié)合，當(dāng)酶的電子云分布改變，酶蛋白構(gòu)象發(fā)生變構(gòu)，引起了纖維素和半纖維素分子定位斷鍵，生成單糖或寡糖而溶于水中以被除去，得到的杜仲橡膠顯現(xiàn)出純白色絲絮狀原貌，如圖4所示。

圖4 堿液預(yù)處理和生物酶降解除去細(xì)胞壁的高純度杜仲橡膠Fig.4 High-purity eucommia rubber with cell wall removed by alkali pretreatment and biological enzymatic degradation

酶解前低濃度堿液的預(yù)處理，證實(shí)了杜仲橡膠含膠細(xì)胞的細(xì)胞壁表面確實(shí)有木質(zhì)化的木質(zhì)素存在，也確實(shí)阻礙了纖維素酶的降解作用，所以纖維素酶降解細(xì)胞壁之前必須先行木質(zhì)素降解。

3.5 杜仲橡膠的親水疏解和分散純化

植物組織碎片是親水的，可以分散在水溶液中，而烷烴的杜仲膠絲卻是疏水的，在水溶液中易纏繞成團(tuán)。只有提高杜仲膠絲與水的親和性和降低分散自由能，打開杜仲膠絲纏繞，使其自由地展開，剝離后被裹挾的植物組織碎片才能掙脫杜仲膠絲的束縛而分散在水溶液中，如圖5所示。

圖5 浮于水上的自由分散的杜仲膠絲Fig.5 Freely dispersed ecommia filaments floating on water

提高杜仲膠絲與水的親和力和在水溶液中的分散性，必須降低兩相的表面張力，顯然表面活性劑有助于兩相表面張力的下降，特別是強(qiáng)潤濕作用的表面活性劑，能有效地提高杜仲膠絲與水的親和性，使杜仲膠絲在水溶液中呈自由分散狀態(tài)，促進(jìn)杜仲橡膠的水溶液溶解向分散熱力學(xué)平衡方向移動。

表面活性劑分子具有獨(dú)特的兩親性：一端為極性基團(tuán)（-OH，-COOH，-SO3H，-NH2等），具有親水性，另一端為非極性基團(tuán)（如烷基、芳香基），而非極性烷烴鏈一般含有8個(gè)以上碳原子，具有親油性和憎水性[8]。性能截然相反的基團(tuán)分處于同一分子的兩端并以化學(xué)鍵相連接，形成了一種不對稱的極性結(jié)構(gòu)，因而賦予了表面活性劑既親水又親油，但又不是整體親水或親油的特性，而是將極性與非極性的物質(zhì)組成了一個(gè)整體。表面活性劑的這種特有結(jié)構(gòu)通常稱之為雙親結(jié)構(gòu)，兩相（杜仲膠絲與水）與表面活性劑分子間不存在界面。

降低兩相間相親的熱力學(xué)能壘，就降低了兩相的表面張力和杜仲膠絲在水中分散的表面自由能?；钚詣┓肿优帕性趦上嘀g，使兩相的表面轉(zhuǎn)入本體相內(nèi)部。在恒溫恒壓條件下杜仲膠絲可以自由伸展，與水接觸的表面積增大，對水溶液本體做的功（即表面自由能）大大降解[9]，從而使得卷曲纏繞的膠絲自由地伸展開。

未經(jīng)超聲波處理的籽皮粗膠直接用表面活性劑分離植物組織碎片，此時(shí)的杜仲橡膠呈籽皮的片狀結(jié)構(gòu)（如圖6所示），沒有釋放出其中夾雜的植物組織碎片，純度不超過92%。潤濕性表面活性劑是最為有效和直接的助劑。十二烷基硫酸鈉的極性基團(tuán)硫酸鈉為親水端，非極性烷烴鏈與杜仲橡膠烷烴鏈相親。

圖6 表面活性劑純化的籽皮杜仲粗膠Fig.6 Seed peel eucommia crude rubber purified by surfactant

反式1，4-聚異戊二烯的杜仲橡膠分子鏈上存在大量的折疊結(jié)晶區(qū)，鏈中單體分子排列規(guī)整、堆砌緊密，相互作用力大、結(jié)晶能高，活性劑分子難滲入，即晶態(tài)杜仲橡膠的溶解比非晶態(tài)三葉橡膠困難[10-13]。杜仲橡膠溶解時(shí)通過加熱破壞晶格而變成非晶態(tài)，就易于與表面活性劑結(jié)合而分散在水溶液中，從而使松散的杜仲膠絲在水溶液中打開，與釋放出的剝離植物組織碎片一起分散在水溶液中而彼此分離，即密度小于水的杜仲膠絲浮于水上層，而密度大于水的植物組織碎片則沉于水底。

超聲波-表面活性劑純化的絮狀杜仲籽皮精（膠離心后的干品）如圖7所示。

圖7 超聲波-表面活性劑純化的絮狀籽皮杜仲精膠Fig.7 Flocculent seed peel eucommia essence rubber purified by ultrasonic-surfactant

從圖7可知，結(jié)團(tuán)打開的杜仲膠絲處于松散絮狀，但有許多細(xì)胞壁碎片殘留在杜仲膠絲表面。

對于相對分子質(zhì)量相同的同種化合物，支化聚合物比線性聚合物更易與水親和。杜仲橡膠是結(jié)晶性直鏈聚合物，其可溶于芳香烴及氯代烴中，但在植株中已形成的結(jié)晶形式降低了其在溶劑中的溶解度，且杜仲橡膠不溶于酮和低級醇等極性較大的有機(jī)溶劑。在加熱條件下，能溶解杜仲橡膠的溶劑種類增多，如石油醚和乙酸乙酯都能使杜仲橡膠發(fā)生溶脹和溶解。結(jié)晶態(tài)杜仲橡膠在常溫下為半硬質(zhì)固體，因?yàn)槎胖傧鹉z結(jié)晶時(shí)生成α型和β型兩種晶體。α型晶體的熔點(diǎn)為65 ℃，β型晶體的熔點(diǎn)為55 ℃，所以溫度達(dá)65 ℃以上杜仲橡膠才能完全熔融[14]。處于熔融態(tài)的杜仲橡膠在許多溶劑中的溶解度明顯提高，而80 ℃是杜仲橡膠特殊的溫度節(jié)點(diǎn)，其物理和化學(xué)性質(zhì)發(fā)生驟變，杜仲膠絲得以解晶打開，比表面積顯著增大，溶解度陡增，表面活性劑能顯著提高杜仲橡膠的分散和溶解。

4 結(jié)論

本研究基于縫隙水分子層超聲波空化效應(yīng)剝離杜仲橡膠與植物組織碎片以制備高純度杜仲精膠，并提出相應(yīng)的指導(dǎo)生產(chǎn)理論。在該理論的指導(dǎo)下，采用纖維素酶降解含膠細(xì)胞的細(xì)胞壁，形成杜仲橡膠與植物組織碎片之間的縫隙，但因木質(zhì)素的存在不能充分降解杜仲橡膠表面附著的全部細(xì)胞壁，導(dǎo)致超聲波純化杜仲橡膠純度不超過96%。由于氫氧化鈉溶液屬苛性堿，不適合用于規(guī)?；a(chǎn)，篩選降解木質(zhì)素的新酶種勢在必行。

縫隙水分子層超聲波空化理論不僅適用于酶解杜仲粗膠的純化，也適用于多種被清潔件與表面附著不同類物質(zhì)的清除，這對超聲波實(shí)際應(yīng)用具有指導(dǎo)意義。

超聲波純化在杜仲精膠的制備上是一種行之有效的物理途徑，彌補(bǔ)了當(dāng)前生物酶解提取杜仲橡膠的不足，改善了杜仲精膠生產(chǎn)的工藝技術(shù)，其實(shí)際應(yīng)用安全可靠，生產(chǎn)環(huán)境優(yōu)良，純化的杜仲精膠純度與有機(jī)溶劑純化法相當(dāng)，達(dá)到96%。