應(yīng)夢(mèng)迪，謝雨珊，朱麗君，王立萍，區(qū)曉君，劉中秋

廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，國際中醫(yī)藥轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究所，廣東 廣州 510006

異莨菪亭，又名6-羥基-7-甲氧基香豆素，主要分布于木犀科植物苦櫪白蠟樹Fraxinus rhynchophyllaHance、白蠟樹F.chinensisRoxb.、尖葉白蠟樹F.szaboanaLingelsh.的樹皮中，是中藥秦皮的主要活性成分之一[1-2]。異莨菪亭具有較好的抗氧化、抗炎、抗癌和抗病毒等活性[3-6]，易被葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶（UDP-glucuronosyltransferases，UGTs）如UGT1A10、UGT1A9和UGT1A6等催化代謝生成異莨菪亭葡萄糖醛酸苷[7]，但異莨菪亭在體內(nèi)的暴露形式、處置特征及相關(guān)調(diào)控機(jī)制鮮有研究，其成藥性數(shù)據(jù)及特征尚不清晰。乳腺癌耐藥蛋白（breast cancer resistance protein，BCRP）和多藥耐藥相關(guān)蛋白2（multidrug resistance-associated protein 2，MRP2）是三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族成員，是影響藥物體內(nèi)處置以及藥理作用的關(guān)鍵因素[8-9]。目前BCRP和MRP2對(duì)異莨菪亭體內(nèi)處置的影響及調(diào)控機(jī)制尚不清楚。因此，本研究采用外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因敲除小鼠模型，探討B(tài)CRP和MRP2對(duì)異莨菪亭及其葡萄糖醛酸化代謝產(chǎn)物體內(nèi)處置的影響及調(diào)控機(jī)制。

1 材料

1.1 動(dòng)物

雄性FVB背景Bcrp1-/-小鼠和Mrp2-/-小鼠購自上海南方模式生物科技有限公司，動(dòng)物合格證號(hào)分別為99612800000279、99612800000278。雄性野生型FVB小鼠來源于雜合Bcrp1-/-小鼠或Mrp2-/-小鼠親代的野生型子代，Bcrp1-/-/Mrp2-/-小鼠由純合Bcrp1-/-小鼠和Mrp2-/-小鼠雜交獲得，采用PCR-STR技術(shù)對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行基因分型。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物周齡為6～8周，飼養(yǎng)于溫度（25±2）℃、相對(duì)濕度50%～60%的SPF級(jí)動(dòng)物房中。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號(hào)2020R0005、2020R0006）。

1.2 藥品與試劑

異莨菪亭（質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%，批號(hào)3620）購自上海詩丹德標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)有限公司，其化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖1；內(nèi)標(biāo)華法林（質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%，批號(hào)012801MT-AC）購自美國AccuStandard公司；尿苷二磷酸葡萄糖醛酸（批號(hào)SLBW7477）、β-葡萄糖醛酸苷酶（批號(hào)069M4017V）、葡萄糖二酸單內(nèi)酯（批號(hào)0000028759）、丙甲菌素（批號(hào)118M4018V）、Hank’s平衡溶液（HBSS，批號(hào)SLBL7680V）、HEPES緩沖液（批號(hào)SLCF4739）購自美國Sigma-Aldrich公司；乙腈、甲醇、甲酸購自德國Merck公司。

圖1 異莨菪亭化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 Structure of isoscopoletin

1.3 儀器

6460超高效液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用儀（UHPLC-MS/MS）、6540超高效液相色譜-四極桿飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜（UHPLC-Q-TOF/MS）、1200高效液相色譜儀（美國Aglient公司）；5810R冷凍高速離心機(jī)（德國Eppendorf公司）；電子分析天平（北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；WS27-2型恒溫水浴搖床、真空干燥儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）；XW-80A型渦旋混合儀（上海滬西分析儀器廠）；Benchmark Plus酶標(biāo)儀（美國Bio-Rad公司）。

2 方法

2.1 異莨菪亭-6-O-β-葡萄糖醛酸苷（isoscopoletin-6-O-β-glucuronide，I-6-G）的制備與鑒定

由于無I-6-G商業(yè)化對(duì)照品，本研究采用酶催化法合成代謝物I-6-G，其化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖2[10]。葡萄糖醛酸化孵育體系含50 mmol/L磷酸鹽緩沖液、5 mmol/L尿苷二磷酸葡萄糖醛酸、5 mmol/L氯化鎂溶液、25 μg/mL丙甲菌素、10 mmol/L葡萄糖二酸單內(nèi)酯、1 mg/mL肝微粒體及80 mmol/L異莨菪亭，將以上試劑混合均勻，于37 ℃水浴中孵育18 h，加入100 μL乙腈溶液，渦旋3 min，14 000 r/min離心30 min，取上清，經(jīng)HPLC分離收集I-6-G。采用UHPLC-Q-TOF/MS鑒定I-6-G，并通過轉(zhuǎn)換因子確定I-6-G的濃度。

圖2 I-6-G的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.2 Structure of I-6-G

2.2 UHPLC-MS/MS分析方法

2.2.1 色譜條件 Aglient Zorbax SB-C18色譜柱（100 mm×3 mm，1.8 mm），流動(dòng)相為0.1%甲酸水溶液（A）和乙腈（B），梯度洗脫：0～1.5 min，10%B；1.5～3.0 min，10%～50% B；3.0～4.0 min，50%～100% B；4.0～5.0 min，100%～10% B。柱溫為37 ℃；體積流量為0.4 mL/min；進(jìn)樣量為2 μL。

2.2.2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源正離子模式（ESI＋）；多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)（multiple reaction monitoring，MRM）模式掃描；毛細(xì)管電壓為4.0 kV；干燥氣溫度為300 ℃；噴嘴電壓為500 V；鞘氣溫度為350 ℃；氮?dú)怏w積流量為5 mL/min；鞘氣體積流量為12 mL/min；用于定量分析的離子對(duì)和碰撞能分別為異莨菪亭（m/z193.0→133.0，20 eV）、I-6-G（m/z369.0→193.0，15 eV）、華法林（m/z309.0→163.2，20 eV）。

2.3 方法學(xué)考察

根據(jù)文獻(xiàn)方法[11]，對(duì)小鼠血漿中異莨菪亭和I-6-G的定量分析方法進(jìn)行專屬性、線性范圍、準(zhǔn)確度和精密度、提取回收率和基質(zhì)效應(yīng)、穩(wěn)定性考察。

2.3.1 樣品處理 小鼠斷尾采血，收集于肝素鈉離心管中，6000 r/min離心8 min，取上層血漿，于-20 ℃保存?zhèn)溆?。?0 μL血漿樣品加入10 μL 50%乙腈，再加入180 μL含20 nmol/L華法林的乙腈溶液，渦旋3 min，14 000 r/min離心10 min，吸取上清于真空干燥儀干燥；加入80 μL 50%乙腈復(fù)溶，渦旋3 min，14 000 r/min離心30 min，取上清進(jìn)行UHPLC-MS/MS分析。

2.3.2 專屬性 異莨菪亭、I-6-G和華法林的總離子流圖見圖3，I-6-G、異莨菪亭和華法林的出峰時(shí)間分別為3.5、4.1、5.0 min。待測(cè)組分及內(nèi)標(biāo)之間的分離效果較好，峰形理想且不受內(nèi)源性物質(zhì)等其他成分的干擾。

圖3 空白血漿 (A)，空白血漿加入異莨菪亭、I-6-G和華法林 (B)，ig異莨菪亭后的血漿樣品 (C) 的總離子流圖Fig.3 Total ion chromatogram of blank plasma (A), blank plasma spiked with isoscopoletin, I-6-G and warfarin (B)and mouse plasma sample after ig isoscopoletin (C)

2.3.3 線性范圍 配制一系列濃度的異莨菪亭和I-6-G混合對(duì)照品溶液，取10 μL，加入10 μL空白血漿，按“2.3.1”項(xiàng)下方法處理。以各成分與內(nèi)標(biāo)峰面積比值為橫坐標(biāo)（Y），各成分濃度為縱坐標(biāo)（X），進(jìn)行線性回歸分析，求得的回歸方程即為標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)信噪比為10計(jì)算各成分的定量限。異莨菪亭與I-6-G的標(biāo)準(zhǔn)曲線、相關(guān)系數(shù)、線性范圍及定量限見表1。

表1 異莨菪亭和I-6-G在小鼠空白血漿中的標(biāo)準(zhǔn)曲線、相關(guān)系數(shù)、線性范圍和定量限Table 1 Standard curves, correlation coefficients, linear ranges, and limit of quantitation of isoscopoletin and I-6-G in plasma of mice

2.3.4 精密度與準(zhǔn)確度 取10 μL空白血漿，分別制備濃度為5 000.00、625.00、39.06 nmol/L的異莨菪亭和濃度為2 000.000、250.000、15.625 nmol/L的I-6-G混合對(duì)照品溶液作為高、中、低濃度的質(zhì)控樣品，按“2.3.1”項(xiàng)下方法處理，各濃度樣品平行制備6份，樣品分別在1 d內(nèi)測(cè)定3次和連續(xù)測(cè)定3 d，考察日內(nèi)、日間精密度及準(zhǔn)確度。如表2所示，高、中、低濃度質(zhì)控樣品的日內(nèi)、日間精密度均小于7%，準(zhǔn)確度為88%～111%，符合生物樣品測(cè)定要求。

表2 異莨菪亭和I-6-G的日內(nèi)、日間精密度和準(zhǔn)確度 (±s , n=6)Table 2 Precision and accuracy of intra-day and inter-day of isoscopoletin and I-6-G (±s , n=6)

表2 異莨菪亭和I-6-G的日內(nèi)、日間精密度和準(zhǔn)確度 (±s , n=6)Table 2 Precision and accuracy of intra-day and inter-day of isoscopoletin and I-6-G (±s , n=6)

成分 濃度/(nmol·L-1) 日內(nèi) 日間實(shí)測(cè)濃度/(nmol·L-1) 精密度RSD/% 準(zhǔn)確度RE/% 實(shí)測(cè)濃度/(nmol·L-1) 精密度RSD/% 準(zhǔn)確度RE/%異莨菪亭 0039.060 38.33±1.52 6.98 106.58 36.08±2.42 7.01 111.33 0625.000 667.14±4.59 2.22 93.05 679.40±35.51 5.23 91.30 5 000.000 5 162.16±26.83 0.86 94.82 5 264.43±28.51 5.42 94.71 I-6-G 0015.625 16.29±0.54 3.31 95.76 17.04±0.85 4.97 90.92 0250.000 230.91±4.08 1.76 107.99 246.85±12.88 5.23 103.00 2 000.000 2 169.23±36.84 1.69 91.54 2 231.27±65.29 2.92 88.44

2.3.5 提取回收率與基質(zhì)效應(yīng) 取高、中、低濃度質(zhì)控樣品，按“2.3.1”項(xiàng)下方法處理，各濃度樣品平行制備6份，進(jìn)樣得到各成分與內(nèi)標(biāo)峰面積比值（P1）；取10 μL空白血漿，加入180 μL含20 nmol/L華法林的乙腈溶液，渦旋3 min，再加入10 μL高、中、低濃度混合對(duì)照品溶液，按“2.3.1”項(xiàng)下方法處理，進(jìn)樣得到各成分與內(nèi)標(biāo)峰面積比值（P2）；取10 μL高、中、低濃度混合對(duì)照品溶液，加入10 μL 50%乙腈溶液，按“2.3.1”項(xiàng)下方法處理，進(jìn)樣得到各成分與內(nèi)標(biāo)峰面積比值（P3）。以P1與P2比值計(jì)算提取回收率，P1與P3比值計(jì)算基質(zhì)效應(yīng)。如表3所示，異莨菪亭和I-6-G的測(cè)定受生物基質(zhì)干擾較小，提取回收率穩(wěn)定，符合樣品測(cè)定要求。

表3 異莨菪亭和I-6-G在小鼠血漿中的提取回收率和基質(zhì)效應(yīng) (±s , n=6)Table 3 Recovery and matrix effect of isoscopoletin and I-6-G in plasma of mice (±s , n=6)

表3 異莨菪亭和I-6-G在小鼠血漿中的提取回收率和基質(zhì)效應(yīng) (±s , n=6)Table 3 Recovery and matrix effect of isoscopoletin and I-6-G in plasma of mice (±s , n=6)

成分 濃度/(nmol·L-1) 提取回收率 基質(zhì)效應(yīng)平均值/% RSD/% 平均值/% RSD/%異莨菪亭 39.06 82.67 6.02 111.58 1.40 625.00 82.31 10.21 107.09 1.89 5 000.00 94.38 6.25 107.49 2.13 I-6-G 15.625 81.36 5.74 105.76 4.44 250.000 87.56 6.40 103.61 3.65 2 000.000 102.41 3.22 109.76 2.57

2.3.6 穩(wěn)定性 取高、中、低濃度質(zhì)控樣品，分別按“2.3.1”項(xiàng)下方法處理，每份樣品平行制備6份，分別于室溫放置4 h后考察短期穩(wěn)定性，于-20 ℃冰箱放置14 d后考察長期穩(wěn)定性，從-20 ℃至室溫反復(fù)凍融3次考察凍融穩(wěn)定性。小鼠血漿中的異莨菪亭和I-6-G在不同處理?xiàng)l件下的穩(wěn)定性數(shù)據(jù)見表4，表明本實(shí)驗(yàn)中的生物樣品短期穩(wěn)定性、長期穩(wěn)定性和凍融穩(wěn)定性良好，滿足生物樣品分析條件。

表4 小鼠血漿中異莨菪亭和I-6-G的穩(wěn)定性 ()Table 4 Stability of isoscopoletin and I-6-G in plasma of mice ()

表4 小鼠血漿中異莨菪亭和I-6-G的穩(wěn)定性 ()Table 4 Stability of isoscopoletin and I-6-G in plasma of mice ()

成分 濃度/(nmol·L-1) 室溫放置4 h -20 ℃放置14 d -20 ℃至室溫反復(fù)凍融3次RSD/% RE/% RSD/% RE/% RSD/% RE/%異莨菪亭 39.06 4.77 109.85 7.48 106.88 3.48 109.93 625.00 5.02 97.27 4.14 92.36 4.19 90.30 5 000.00 7.19 105.53 2.16 92.27 4.15 92.68 I-6-G 15.625 1.59 96.39 7.36 90.84 2.37 94.37 250.000 1.98 109.34 1.85 95.26 7.92 103.30 2 000.000 7.72 103.17 1.33 87.93 2.20 91.09

2.4 異莨菪亭在小鼠體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)研究

野生型FVB小鼠、Bcrp1-/-小鼠、Mrp2-/-小鼠和Bcrp1-/-/Mrp2-/-小鼠分別ig異莨菪亭（2 mg/kg）或尾iv異莨菪亭（1 mg/kg），分別于給藥后0、3、5、10、15、20、30、60、120、240、360、480 min斷尾采血收集于肝素鈉離心管中，按“2.3.1”項(xiàng)下方法處理，取上清進(jìn)行UHPLC-MS/MS分析。藥動(dòng)學(xué)參數(shù)采用WinNonlin?3.3非房室模型擬合。

2.5 異莨菪亭在體腸灌流研究

采用小鼠在體單向腸灌流模型，模擬異莨菪亭的腸道處置過程。小鼠在體單向腸灌流手術(shù)操作參照本課題組前期研究[12]。含40 μmol/L異莨菪亭的HBSS緩沖液以10 mL/h恒速灌流十二指腸和結(jié)腸，預(yù)灌流30 min后，每15分鐘于十二指腸和結(jié)腸出口處收集灌流液。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后測(cè)量每個(gè)腸段的長度，并收集血漿和膽汁。取50 μL灌流液樣品加入450 μL含20 nmol/L華法林的乙腈溶液，渦旋3 min后，14 000 r/min離心30 min，取上清進(jìn)樣UHPLCMS/MS分析。采用重量法計(jì)算異莨菪亭在小腸和結(jié)腸的表觀滲透系數(shù)（P*eff）。

P*eff＝(1－Cm/Co)/4Gz

其中Cm和Co分別代表腸腔入口和出口藥物濃度，Gz是與流量、腸道的長度和擴(kuò)散系數(shù)有關(guān)的轉(zhuǎn)換參數(shù)

2.6 異莨菪亭在小鼠肝微粒體和小腸微粒體中的酶動(dòng)力學(xué)研究

小鼠肝微粒體和小腸微粒體的制備及濃度測(cè)定參照本課題組前期研究[13]。肝微粒體質(zhì)量濃度為0.025 mg/mL，小腸微粒體質(zhì)量濃度為0.05 mg/mL，底物異莨菪亭濃度為0.1～5.2 μmol/L。底物分別與肝微粒體和小腸微粒體于37 ℃水浴鍋恒溫孵育10 min后，加入100 μL含20 nmol/L華法林的乙腈溶液，渦旋3 min，14 000 r/min離心30 min，取上清進(jìn)行UHPLC-MS/MS分析。使用GraphPad Prism 5軟件計(jì)算異莨菪亭的酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)，以代謝速率與底物濃度的比值（V/C）為橫坐標(biāo)，代謝速率（V）為縱坐標(biāo)，做Eaide-Hofstee圖，判斷異莨菪亭在小鼠肝微粒體和小腸微粒體中的代謝動(dòng)力學(xué)模型。

3 結(jié)果

3.1 I-6-G的鑒定

異莨菪亭經(jīng)肝微粒體代謝后，可檢測(cè)到1個(gè)單葡萄糖醛酸化代謝物。如圖4所示，通過UHPLC-Q-TOF/MS負(fù)離子模式檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)該代謝物的準(zhǔn)分子離子峰為m/z367.066 7[M－H]-，伴隨有特征碎片離子m/z191.034 5，即丟失1分子葡萄糖醛酸殘基（－176），與理論m/z367.067 1的誤差為1.09，推測(cè)該代謝物為I-6-G。

圖4 I-6-G的提取離子流質(zhì)譜圖Fig.4 Extracted ion chromatogram of I-6-G

3.2 異莨菪亭和I-6-G在小鼠體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)

ig異莨菪亭（2 mg/kg）后，異莨菪亭和I-6-G在野生型FVB小鼠、Bcrp1-/-小鼠、Mrp2-/-小鼠和Bcrp1-/-/Mrp2-/-小鼠體內(nèi)的藥-時(shí)曲線見圖5，藥動(dòng)學(xué)參數(shù)見表5。異莨菪亭在體內(nèi)吸收迅速，吸收后被快速代謝成I-6-G，在血漿中主要以I-6-G的形式暴露。異莨菪亭在野生型FVB小鼠、Bcrp1-/-小鼠、Mrp2-/-小鼠和Bcrp1-/-/Mrp2-/-小鼠的生物利用度分別為7.85%、3.54%、5.76%、10.27%。與野生型FVB小鼠相比，Bcrp1-/-小鼠體內(nèi)異莨菪亭的表觀分布容積（Vd）和清除率（CL/F）分別下降了67.02%、58.54%（P＜0.05）；Mrp2-/-小鼠體內(nèi)異莨菪亭的藥-時(shí)曲線下面積（AUC0～t）和達(dá)峰濃度（Cmax）分別增加了2.8、3.0倍，CL/F下降了78.8%（P＜0.05、0.001）；Bcrp1-/-/Mrp2-/-小鼠體內(nèi)異莨菪亭的AUC0～t增加了5.6倍，CL/F下降了86.8%（P＜0.05、0.01）。與野生型FVB小鼠相比，Bcrp1-/-小鼠體內(nèi)I-6-G的AUC0～t和半衰期（t1/2）分別增加了0.6、4.1倍（P＜0.05）；Mrp2-/-小鼠體內(nèi)I-6-G的AUC0～t和Cmax分別增加了1.0、1.2倍（P＜0.001）；Bcrp1-/-/Mrp2-/-小鼠體內(nèi)I-6-G的AUC0～t、Cmax和t1/2分別增加了8.2、3.5、1.6倍（P＜0.01、0.001）。

圖5 小鼠ig異莨菪亭后，異莨菪亭及I-6-G的血藥濃度-時(shí)間曲線 (±s , n=6)Fig.5 Plasma drug concentration-time curve of isoscopoletin and I-6-G in mice after ig isoscopoletin (±s , n=6)

表5 小鼠ig異莨菪亭后異莨菪亭及I-6-G的藥動(dòng)學(xué)參數(shù) (±s , n=6)Table 5 Pharmacokinetic parameters of isoscopoletin and I-6-G in mice after ig isoscopoletin (±s , n=6)

表5 小鼠ig異莨菪亭后異莨菪亭及I-6-G的藥動(dòng)學(xué)參數(shù) (±s , n=6)Table 5 Pharmacokinetic parameters of isoscopoletin and I-6-G in mice after ig isoscopoletin (±s , n=6)

與FVB野生型小鼠比較：*P＜0.05 **P＜0.01 ***P＜0.001*P ＜ 0.05 **P ＜ 0.01 ***P ＜ 0.001 vs FVB mice

參數(shù) 單位 異莨菪亭 I-6-G FVB Bcrp1-/- Mrp2-/- Bcrp1-/-/Mrp2-/- FVB Bcrp1-/- Mrp2-/- Bcrp1-/-/Mrp2-/-Cmax μmol·L-1 0.12±0.05 0.21±0.10 0.48±0.29* 0.32±0.09** 8.16±2.60 12.19±3.86 17.67±1.01*** 36.99±10.44**tmax min 8.33±5.53 7.60±4.36 8.00±5.00 16.00±8.60* 8.67±2.36 12.00±6.78 8.00±4.00 25.00±17.89**AUC0～t min·μmol·L-1 2.73±1.58 3.40±1.37 10.44±1.82*** 18.00±5.85** 340.92±112.05 565.08±103.43* 698.03±92.38*** 3 145.45±549.34***t1/2 min 21.00±11.08 17.16±9.92 44.72±17.01* 40.32±22.83 28.32±3.84 144.43±20.10* 48.51±34.51 74.09±17.35**MRT0～t min 19.00±6.29 17.66±6.80 37.54±6.86** 41.59±7.16** 33.13±3.50 44.87±17.65 35.05±5.80 76.95±20.51*Vd L·kg-1 10.34±4.25 3.41±1.53* 5.42±2.08* 2.97±1.78* — — — —CL/F mL·min-1·kg-1 0.41±0.23 0.17±0.11* 0.09±0.01* 0.05±0.01* — — — —

尾iv異莨菪亭（1 mg/kg）后，異莨菪亭和I-6-G在野生型FVB小鼠、Bcrp1-/-小鼠、Mrp2-/-小鼠和Bcrp1-/-/Mrp2-/-小鼠體內(nèi)的藥-時(shí)曲線見圖6，藥動(dòng)學(xué)參數(shù)見表6。與野生型FVB小鼠相比，Bcrp1-/-小鼠體內(nèi)異莨菪亭的Vd下降了75%（P＜0.05）；Mrp2-/-小鼠體內(nèi)異莨菪亭的AUC0～t和CL/F分別增加了4.0、1.5倍（P＜0.01、0.001）；Bcrp1-/-/Mrp2-/-小鼠體內(nèi)異莨菪亭的AUC0～t和CL/F分別增加了3.8、2.5倍（P＜0.05、0.001）。與野生型FVB小鼠相比，Bcrp1-/-小鼠體內(nèi)I-6-G的AUC0～t增加了2.1倍（P＜0.01）；Mrp2-/-小鼠體內(nèi)I-6-G的t1/2增加了0.2倍（P＜0.001）；Bcrp1-/-/Mrp2-/-小鼠體內(nèi)I-6-G的AUC0～t增加了9.1倍（P＜0.01）。

表6 小鼠iv異莨菪亭后異莨菪亭及I-6-G的藥動(dòng)學(xué)參數(shù) (±s , n=6)Table 6 Pharmacokinetic parameters of isoscopoletin and I-6-G in mice after iv isoscopoletin (±s , n=6)

表6 小鼠iv異莨菪亭后異莨菪亭及I-6-G的藥動(dòng)學(xué)參數(shù) (±s , n=6)Table 6 Pharmacokinetic parameters of isoscopoletin and I-6-G in mice after iv isoscopoletin (±s , n=6)

與FVB野生型小鼠比較：*P＜0.05 **P＜0.01 ***P＜0.001*P ＜ 0.05 **P ＜ 0.01 ***P ＜ 0.001 vs FVB mice

參數(shù) 單位 異莨菪亭 I-6-G FVB Bcrp1-/- Mrp2-/- Bcrp1-/-/Mrp2-/- FVB Bcrp1-/- Mrp2-/- Bcrp1-/-/Mrp2-/-AUC0～t min·μmol·L-1 21.21±5.80 56.60±36.74 105.85±39.22** 103.06±74.10* 296.45±65.97 934.68±256.56** 326.83±59.37 3 006.22±944.97**t1/2 min 12.93±8.32 5.38±4.12 25.16±8.06* 12.76±5.01 25.27±0.87 32.28±5.41* 30.85±2.07*** 24.39±1.96 MRT0～t min 5.10±1.31 4.16±1.09 26.64±9.63* 12.74±5.52* 33.17±1.53 37.98±6.73 41.33±4.83** 49.30±10.36*Vd L·kg-1 0.44±0.25 0.11±0.11* 0.20±0.10 0.14±0.10* — — — —CL/F mL·min-1·kg-1 0.002±0.001 0.013±0.008 0.005±0.002*** 0.007±0.004*** — — — —

圖6 小鼠iv異莨菪亭，異莨菪亭及I-6-G的血藥濃度-時(shí)間曲線 (±s , n=6)Fig.6 Plasma drug concentration-time curve of isoscopoletin and I-6-G in mice after iv isoscopoletin (±s , n=6)

3.3 異莨菪亭在體腸灌流研究

異莨菪亭在小鼠十二指腸段和結(jié)腸段吸收和代謝特征如圖7所示，異莨菪亭在野生型FVB小鼠、Bcrp1-/-小鼠、Mrp2-/-小鼠和Bcrp1-/-/Mrp2-/-小鼠十二指腸段和結(jié)腸段的P*eff均高于1，表明異莨菪亭小鼠腸道內(nèi)的吸收較好。異莨菪亭在十二指腸段的P*eff高于結(jié)腸段，表明異莨菪亭在十二指腸段的吸收優(yōu)于結(jié)腸段。相比于野生型FVB小鼠，Bcrp1-/-小鼠、Mrp2-/-小鼠和Bcrp1-/-/Mrp2-/-小鼠體內(nèi)I-6-G外排入十二指腸腸腔的量下降了55.7%～58.4%（P＜0.05、0.01）；Bcrp1-/-/Mrp2-/-小鼠膽汁中異莨菪亭和I-6-G的累積量分別降低了90.3%、79.1%，Mrp2-/-小鼠膽汁中I-6-G的累積量下降了90.1%（P＜0.05）；Bcrp1-/-小鼠血漿中異莨菪亭的暴露量增加了3.5倍；Bcrp1-/-/Mrp2-/-小鼠血漿中異莨菪亭和I-6-G的暴露量分別增加了1.3、0.7倍（P＜0.05）。

圖7 異莨菪亭在小鼠腸灌流模型的吸收與代謝的特征 (±s , n=5)Fig.7 Absorption and metabolism of isoscopoletin in mouse intestinal perfusion model (±s , n=5)

3.4 異莨菪亭在小鼠肝微粒體和小腸微粒體中的葡萄糖醛酸化代謝特征

異莨菪亭經(jīng)野生型FVB小鼠、Bcrp1-/-小鼠、Mrp2-/-小鼠和Bcrp1-/-/Mrp2-/-小鼠肝微粒體和小腸微粒體孵育后，代謝生成I-6-G。如圖8所示，野生型FVB小鼠、Bcrp1-/-小鼠、Mrp2-/-小鼠和Bcrp1-/-/Mrp2-/-小鼠肝微粒體介導(dǎo)的異莨菪亭葡萄糖醛酸化反應(yīng)均符合米氏方程，由小腸微粒體介導(dǎo)的異莨菪亭葡萄糖醛酸化反應(yīng)均符合底物抑制方程。如表7所示，相比于野生型FVB小鼠，Bcrp1-/-小鼠、Mrp2-/-小鼠和Bcrp1-/-/Mrp2-/-小鼠肝微粒體中I-6-G的清除率（CLint）均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，小腸微粒體中I-6-G的CLint均增加了0.8倍（P＜0.05），表明外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白BCRP和MRP2的缺失對(duì)異莨菪亭在小鼠體內(nèi)的葡萄糖醛酸化反應(yīng)速率影響較小。

圖8 異莨菪亭在小鼠肝微粒體 (A) 和小腸微粒體 (B) 中的酶動(dòng)力學(xué)曲線 (±s , n=3)Fig.8 Enzyme kinetics of isoscopoletin in mouse liver microsomes (A) and intestinal microsomes (B) (±s , n=3)

表7 異莨菪亭在小鼠肝微粒體和小腸微粒體中的酶動(dòng)力學(xué)參數(shù) (±s , n=3)Table 7 Enzyme kinetics parameters of isoscopoletin in mouse liver microsomes and intestine microsomes (±s , n=3)

表7 異莨菪亭在小鼠肝微粒體和小腸微粒體中的酶動(dòng)力學(xué)參數(shù) (±s , n=3)Table 7 Enzyme kinetics parameters of isoscopoletin in mouse liver microsomes and intestine microsomes (±s , n=3)

與FVB野生型小鼠比較：*P＜0.05*P ＜ 0.05 vs FVB mice

組別 肝微粒體 小腸微粒體Vmax/(nmol·mg-1·min-1) Km/(μmol·L-1) CLint/(μL·mg-1·min-1) Vmax/(nmol·mg-1·min-1) Km/(μmol·L-1) CLint/(μL·mg-1·min-1)FVB 5.48±1.42 721.30±195.50 7.90±2.37 4.06±0.19 659.32±69.28 06.20±0.62 Bcrp1-/- 5.60±2.04 672.34±168.56 8.12±1.40 7.70±0.77 714.68±140.02 11.04±1.41*Mrp2-/- 3.86±1.39 521.03±95.32 8.05±3.74 3.83±0.37 346.19±74.10 11.44±2.17*Bcrp1-/-/Mrp2-/- 4.74±1.18 664.63±102.01 7.04±0.66 4.21±1.24 381.21±101.63 11.07±1.81*

4 討論

異莨菪亭是中藥秦皮的主要活性成分之一，具有多種藥理活性，目前關(guān)于異莨菪亭在體內(nèi)的處置特征及調(diào)控機(jī)制尚不清楚。本研究開展了小鼠藥動(dòng)學(xué)實(shí)驗(yàn)、在體腸灌流實(shí)驗(yàn)和酶動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)異莨菪亭在小鼠血漿中主要以葡萄糖醛酸化代謝產(chǎn)物I-6-G的形式暴露，外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白BCRP和MRP2對(duì)異莨菪亭及I-6-G的體內(nèi)處置具有調(diào)控作用。

ig異莨菪亭后在體內(nèi)吸收迅速，tmax且消除半衰期短，在野生型FVB小鼠、Bcrp1-/-小鼠、Mrp2-/-小鼠和Bcrp1-/-/Mrp2-/-小鼠血漿中I-6-G的AUC0～t顯著高于異莨菪亭的AUC0～t，表明異莨菪亭可以以原型形式透過細(xì)胞膜，進(jìn)而在體內(nèi)發(fā)生廣泛的葡萄糖醛酸化代謝。ig或尾iv異莨菪亭后，與野生型FVB小鼠相比，Mrp2-/-小鼠體內(nèi)異莨菪亭的AUC0～t顯著增加（P＜0.01、0.001），而Bcrp1-/-小鼠體內(nèi)異莨菪亭的AUC0～t無顯著性差異，表明異莨菪亭的體內(nèi)暴露主要由MRP2介導(dǎo)；Bcrp1-/-小鼠和Mrp2-/-小鼠體內(nèi)I-6-G的AUC0～t與野生型FVB小鼠相比均顯著增加（P＜0.05、0.01、0.001），表明I-6-G的外排受BCRP和MRP2調(diào)控，且BCRP和MRP2對(duì)I-6-G的外排作用相當(dāng)。在Bcrp1-/-/Mrp2-/-小鼠體內(nèi)，異莨菪亭和I-6-G的AUC0～t與野生型FVB小鼠相比均顯著增加（P＜0.05、0.01、0.001），且增加倍數(shù)遠(yuǎn)大于單敲除小鼠與野生型FVB小鼠的差異。以上結(jié)果表明，BCRP和MRP2對(duì)異莨菪亭及其代謝物I-6-G藥動(dòng)學(xué)特征的影響呈協(xié)同互補(bǔ)的關(guān)系。外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白BCRP和MRP2在腸和肝細(xì)胞的頂側(cè)面均有表達(dá)，對(duì)底物的外排呈相互協(xié)調(diào)和合作互補(bǔ)的作用[14-16]。當(dāng)BCRP和MRP2同時(shí)敲除后，他們之間的協(xié)同互補(bǔ)關(guān)系被打破，與Bcrp1-/-小鼠和Mrp2-/-小鼠相比，異莨菪亭和I-6-G受到的外排作用更小。

小鼠灌流異莨菪亭后，異莨菪亭在十二指腸段和結(jié)腸段的吸收程度較好（P*eff＞1），且不受外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白BCRP或MRP2的影響，表明被動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)可能是異莨菪亭通過細(xì)胞膜的主要形式。小鼠腸上皮細(xì)胞中I-6-G外排入十二指腸腸腔的量高于外排入結(jié)腸腸腔的量，可能是由于十二指腸上皮細(xì)胞和結(jié)腸上皮細(xì)胞中UGT酶和外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（BCRP和MRP2）表達(dá)程度的不同引起的[17-18]。與野生型FVB小鼠相比，敲除外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白BCRP和MRP2后，I-6-G外排入十二指腸腸腔和膽汁的量均顯著下降（P＜0.05、0.01），表明外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白BCRP和MRP2參與I-6-G的外排。異莨菪亭酶動(dòng)力學(xué)結(jié)果顯示，與野生型FVB小鼠相比，Bcrp1-/-小鼠、Mrp2-/-小鼠和Bcrp1-/-/Mrp2-/-小鼠肝微粒體中I-6-G的CLint無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，小腸微粒體中I-6-G的CLint均增加了0.8倍（P＜0.05），表明外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白BCRP和MRP2的缺失對(duì)異莨菪亭在小鼠體內(nèi)的葡萄糖醛酸化反應(yīng)速率影響較小。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突