劉夢麗，余函紋，單婷玉，吳君賢，彭華勝, ，程銘恩，查良平*，桂雙英,

1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，安徽 合肥 230038

2.中國中醫(yī)科學(xué)院 中藥資源中心，道地藥材國家重點實驗室培育基地，北京 100700

3.安徽省中醫(yī)藥科學(xué)院藥物制劑研究所，安徽 合肥 230012

4.現(xiàn)代藥物制劑安徽省教育廳工程技術(shù)研究中心，安徽 合肥 230012

5.藥物制劑技術(shù)與應(yīng)用安徽省重點實驗室，安徽 合肥 230012

天麻始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》列為上品，原名“赤箭”，因其莖似箭，端有花，遠看如箭有羽而得名[1]。天麻為蘭科植物天麻Gastrodia elataBl.的干燥塊莖，性甘、平，歸肝經(jīng)，具有息風止痙、平抑肝陽和祛風通絡(luò)的功效[2]。天麻作為藥食同源滋補保健類藥材，包含酚類、有機酸類、多糖類等多種活性成分[3-4]，具有抗驚厥、鎮(zhèn)靜催眠、鎮(zhèn)痛、保護神經(jīng)細胞、改善記憶及延緩衰老等藥理作用[5]。

糖基轉(zhuǎn)移酶（glycosyltransferase，GTs）是一類高度分化的多基因家族酶，廣泛存在于動物、植物和微生物中，GTs能催化糖基團從供體分子轉(zhuǎn)移到特異性受體分子，形成各種糖苷化合物[6-8]。天麻中很多活性成分是以糖苷化的形式存在，包括天麻素、巴利森苷等主要活性成分，糖基化反應(yīng)是由GTs介導(dǎo)的植物體內(nèi)的一種重要的次生代謝反應(yīng)，通過糖基化修飾，能改善天然藥物的水溶性、穩(wěn)定性和生物利用度等[9]。

近年來，已經(jīng)從霍山石斛[10]、布渣葉[11]、穿心蓮[12]、地黃[13]、長春花[14]、花楸[15]等藥用植物中克隆出了GTs基因。本研究以天麻作為實驗材料，利用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式擴增（reverse transcriptionpolymerase chain reaction，RT-PCR）技術(shù)克隆天麻糖基轉(zhuǎn)移酶基因（glycosyltransferase，GeGT1）的cDNA全長序列，構(gòu)建原核表達載體并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌進行表達，研究GeGT1不同器官表達模式，為后期研究GeGT1及其生物學(xué)功能奠定了理論基礎(chǔ)。

1 材料與試劑

1.1 材料

供試天麻材料來源于安徽省六安市金寨縣金山寨食（藥）用菌種植專業(yè)合作社，經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院彭華勝教授鑒定為蘭科植物Gastrodia elataBl.。天麻進入花期后，收集天麻的塊莖、莖和花，迅速放入液氮中，帶回實驗室后保存于-80 ℃冰箱。

1.2 試劑

RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、TB Green?Premix Ex Taq?購自于TaKaRa公司；高保真酶購自于NEB公司；切膠回收試劑盒、感受態(tài)細胞Trans1-T1、感受態(tài)細胞Transetta（DE3）購自于北京全式金生物技術(shù)有限公司。所需引物由上海生工生物有限公司合成。

2 方法

2.1 基因數(shù)據(jù)獲取

GeGT1基因序列來源于天麻轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)（本實驗室），經(jīng)冗余序列去除、序列組裝，功能注釋后分類。其他物種的氨基酸序列均來自于GenBank數(shù)據(jù)庫。

2.2 總RNA的提取和cDNA的合成

按照RNA prep Pure Plant Kit試劑盒操作說明提取天麻塊莖總RNA，并用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA完整性。ND2000（Denovix DS-11＋，S-03512）測定天麻總RNA的A260和A280值，選擇A260/A280為1.8～2.0的總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以RNA為模板，采用TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒（PrimeScript? II 1st Strand cDNA Synthesis Kit）進行反轉(zhuǎn)錄，得到天麻的cDNA，合成產(chǎn)物保存于-20 ℃冰箱中。

2.3 GeGT1基因的克隆

根據(jù)天麻轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫，用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計基因特異性引物。上游引物：GT1-F：5’-ATGGTAGCAGCGGCACAGAATCCAT-3’；下游引 物：GT1-R：5’-TTACAAAAAAAAGGTCCCC TTCCAT-3’，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。以天麻的cDNA為模板進行PCR擴增，PCR擴增采用Phusion High-Fidelity酶（NEB，M0501S），PCR體系為98 ℃預(yù)變性2 min；98 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，需40個循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測、回收，然后使用EasyPure Quick Gel Extraction Kit切膠回收試劑盒回收目的條帶，并將擴增產(chǎn)物連接至克隆載體pUC-GW-Amp，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌中，挑菌并進行菌液PCR驗證，挑選8個陽性克隆菌液送至蘇州金唯智公司完成測序。

2.4 GeGT1基因的生物信息學(xué)分析

利用NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）在線工具BLAST對基因核苷酸序列和氨基酸序列進行相似性比對分析；ORF Finder（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）查找基因開放閱讀框（open reading frame，ORF）；ExPASy（https://web.expasy.org/protparam/）預(yù)測GeGT1基因編碼的蛋白理化性質(zhì)；NPS（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/ npsa_automat.pl?page=npsa_gor4.html）進行蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)分析；Swiss Model（http://swissmodel.expasy.org/），進行三維結(jié)構(gòu)建模，結(jié)合PyMOL軟件預(yù)測蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)；CDD（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ Structure/ cdd/wrpsb.cgi）進行蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域分析；TMHMM（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）進行蛋白序列的跨膜結(jié)構(gòu)域分析；SinalP4.0Server（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）進行蛋白序列的信號肽預(yù)測分析。運用ClustalW軟件與其他植物的氨基酸序列進行比對，用 MEGA 6.06軟件構(gòu)建鄰接（neighbor-joining）系統(tǒng)進化樹，bootstrap重復(fù)次數(shù)為1000次。

2.5 GeGT1基因的原核表達

對測序后的序列進行分析，設(shè)計含有接頭序列的無縫拼接引物，上游引物：GeGT1-BamH I-F：5’-GACAGCAAATGGGTCGCGGAATGGTAGCAG CGGCACAGAATCCAT-3’；下游引物：GeGT1-BamH I-R：5’-CGACGGAGCTCGAATTCGGATTACAAAAAAAAGGTCCCCTTCCAT-3’。以重組質(zhì)粒為模板，進行PCR擴增，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并進行切膠回收。用BamH I限制性內(nèi)切酶將pET-28a進行單酶切，并進行切膠回收。目的基因片段與原核表達載體進行無縫拼接，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌Trans1-T1感受態(tài)細胞，涂在卡那霉素抗性固體培養(yǎng)基上，挑取單菌落，菌液PCR驗證并將8個陽性菌液送至公司測序。將測序陽性的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌Transetta（DE3）感受態(tài)細胞，于LB液體培養(yǎng)基中37 ℃ 200 r/min振蕩培養(yǎng)，至A600值為0.6～0.8，加0.4 mmol/L IPTG于28 ℃誘導(dǎo)12 h，收集菌液，進行SDS-PAGE檢測。

2.6 GeGT1基因的表達水平分析

運用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）的方法檢測GeGT1基因在天麻塊莖、莖、花的相對表達量。以天麻β-actin基因為內(nèi)參基因，運用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計實時熒光定量引物。GeGT1基因qRT-PCR上游引物：GT1-RT-F：5’-TGTTGGCGTTAGATGTTTGGA-3’；下游引物：GT1-RT-R：5’-ACCACCCAAACAAACGGA-3’，β-actin基因?qū)崟r熒光定量 PCR 上游引物：β-actin-1-F：5’-GGGGATGAAGCACAGTCCAA-3’；下游引物：β-actin-1-R：5’-GCCGTGGTTGTGAAGGAGTA-3’，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。按照“2.2”項方法，提取天麻塊莖、莖和花中的總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成c DNA，稀釋10倍備用。應(yīng)用Mx3000P實時熒光定量PCR儀（安捷倫，美國）進行PCR擴增。反應(yīng)體系為25 μL，包括TB Green Premix Ex Taq II（Tli RNaseH Plus）（2×）12.5 μL、ROX Reference Dye（50×）0.25 μL、ROX Reference Dye II（50×）0.25 μL、GT1-RT-F 1 μL、GT1-RT-R 1 μL、c DNA 2 μL、ddH2O 8 μL。PCR條件：95 ℃、30 s，95 ℃、15 s，60 ℃、30 s，72 ℃、15 s，40個循環(huán)。實驗中重復(fù)3次，繪制熔解曲線，采用2-ΔΔCt法分析基因的相對表達量。

3 結(jié)果與分析

3.1 GeGT1基因克隆和序列分析

以天麻的cDNA為模板，通過RT-PCR進行目的基因擴增，PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，電泳條帶約為1503 bp（圖1-A），與目的基因片段大小吻合。重組質(zhì)粒pUC-GWAmp-GeGT1經(jīng)MluI和AscI雙酶切，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測得目的基因條帶，約為1503 bp（圖1-B），利用DNAMAN軟件結(jié)合ORF Finder在線軟件對GeGT1基因cDNA序列進行分析，GeGT1基因開放閱讀框（ORF）全長1 503 bp，編碼500個氨基酸。通過Genebank中BLASTX功能，對GeGT1蛋白序列進行同源比對分析，比對結(jié)果顯示，GeGT1基因與鐵皮石斛Dendrobium catenatumKimura et Migo同源相似性為58.56%，與小蘭嶼蝴蝶蘭Phalaenopsis equestris(Schauer)Rchb.同源相似性為55.48%，與深圳擬蘭Apostasia shenzhenicaZ.J.Liu & L.J.Chen同源相似性為55.14%。比對結(jié)果表明所獲基因?qū)儆贕Ts家族，將該基因命名為GeGT1，GenBank 注冊號為MW015078。

圖1 GeGT1 (A) 和pUC-GW-Amp-GeGT1 (B) 的基因克隆Fig.1 Cloning of GeGT1 (A) and pUC-GW-Amp-GeGT1 (B)

3.2 GeGT1蛋白理化性質(zhì)分析

利用在線工具ExPASy對GeGT1基因編碼蛋白進行理化性質(zhì)分析，結(jié)果顯示，GeGT1編碼蛋白由500個氨基酸殘基組成，蛋白理論等電點為5.51，相對分子質(zhì)量為55 494.33，不穩(wěn)定系數(shù)為40.12，脂肪指數(shù)為80.34，可初步判斷GeGT1蛋白為穩(wěn)定的酸性蛋白。

3.3 GeGT1蛋白二級和三級結(jié)構(gòu)預(yù)測分析

利用NPS在線軟件對GeGT1蛋白的二級結(jié)構(gòu)進行預(yù)測分析。結(jié)果顯示（圖2-A），GeGT1蛋白二級結(jié)構(gòu)元件中無規(guī)卷曲（random coil）所占的比例最高，包含245個氨基酸，占49%；α-螺旋包含141個氨基酸，占28.2%；延伸鏈包含114個氨基酸，占22.8%。

利用SWISS-MODEL Workspace在線軟件對GeGT1蛋白進行同源建模，結(jié)合PyMOL軟件預(yù)測得到GeGT1三維空間模型（圖2-B）及GeGT1活性中心氨基酸序列（圖2-C），通過ExPAsy structure assessment程序評測推導(dǎo)，GeGT1蛋白模型6lzx.1.B序列相似性42%，全球性模型質(zhì)量估測（global model quality estimation，GMQE）值為0.68。

圖2 GeGT1蛋白的二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)Fig.2 Secondary and tertiary structure of GeGT1

3.4 GeGT1蛋白結(jié)構(gòu)功能域、跨膜結(jié)構(gòu)域以及信號肽分析

利用NCBI的Conserved domains在線工具對GeGT1蛋白進行結(jié)構(gòu)域分析（圖3-A），GeGT1的17～418 aa具有UDP-GTs的保守結(jié)構(gòu)域，結(jié)果表明GeGT1蛋白屬于GTB型超家族。利用TMHMM2.0在線工具對GeGT1進行跨膜結(jié)構(gòu)區(qū)域預(yù)測（圖3-B），結(jié)果表明，GeGT1蛋白含有一個顯著的跨膜螺旋區(qū)，460～482 aa位于跨膜結(jié)構(gòu)域，1～459 aa位于膜外側(cè)，483～500 aa位于膜內(nèi)側(cè)，說明GeGT1屬于跨膜蛋白。利用SinalP4.0 Server預(yù)測分析GeGT1蛋白的信號肽（圖3-C），結(jié)果顯示存在信號肽的概率為0.17%，故推測GeGT1蛋白不存在信號肽，是非分泌蛋白。

圖3 GeGT1的結(jié)構(gòu)功能域與跨膜結(jié)構(gòu)域Fig.3 Structural functional domains and transmembrane domains of GeGT1

3.5 GeGT1的氨基酸序列同源比對

利用DNAMAN軟件對GeGT1氨基酸序列與其他植物基因進行氨基酸序列同源比對。將GeGT1序列與鐵皮石斛糖基轉(zhuǎn)移酶（DcSGT，XP_020677364.1）、深圳擬蘭糖基轉(zhuǎn)移酶（AsUGT，PKA65321.1）、番紅花糖基轉(zhuǎn)移酶（CsUGT，AIF79773.1）進行多序列比對分析（圖4），結(jié)果顯示，這4種植物的同源性為60.25%，其中GeGT1與DcSGT的同源性最高，為58.56%。

圖4 天麻、鐵皮石斛、深圳擬蘭和番紅花GTs氨基酸序列同源性比對Fig.4 Amino acid sequence homology alignment of Gastrodia elata Bl, Dendrobium catenatum, Apostasia shenzhenica and Crocus sativus L.glycosyltransferase

3.6 GeGT1的系統(tǒng)進化樹分析

選取GenBank中記載的25種植物的GTs基因的氨基酸序列：用MEGA 6.0軟件采用鄰接法構(gòu)建GTs氨基酸序列的系統(tǒng)進化樹（圖5）。結(jié)果顯示，來源于不同物種GTs基因的蛋白被聚成雙子葉植物、單子葉植物、裸子植物、藻類和菌類，其中GeGT1與鐵皮石斛、深圳擬蘭和小蘭嶼蝴蝶蘭GTs序列位于同一分支點，表明親緣關(guān)系高，進一步證實了蘭科植物GTs基因的同源性。

圖5 GeGT1與其他物種GTs氨基酸序列的系統(tǒng)進化樹分析Fig.5 Phylogenetic tree analysis of GeGT1 and other species glycosyltransferase amino acid sequences

3.7 GeGT1基因的原核表達

將重組質(zhì)粒pET-28a-GeGT1轉(zhuǎn)入大腸桿菌Transetta（DE3）感受態(tài)細胞中，菌液PCR檢測陽性菌株。以pET-28a轉(zhuǎn)入Transetta（DE3）感受態(tài)細胞作為對照，在0.4 mmol/L IPTG、28 ℃誘導(dǎo)12 h條件下觀察重組融合蛋白的表達。同時重組菌株表達后收集菌體并進行破碎裂解，上清液進行SDS-PAGE電泳檢測，結(jié)果顯示（圖6），經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后的pET-28a-GeGT1菌株和上清液在63 000處出現(xiàn)明顯的目的蛋白條帶。

圖6 GeGT1蛋白原核表達分析Fig.6 Prokaryotic expression of GeGT1 protein

3.8 天麻不同器官的GeGT1基因表達差異分析

運用qRT-PCR檢測了天麻塊莖、莖、花的GeGT1基因表達差異（圖7）。結(jié)果顯示，GeGT1基因在天麻各個器官中均有表達，GeGT1基因在花中的表達水平最高，其次是塊莖，在莖中的表達水平最低。

圖7 天麻不同部位的GeGT1基因表達水平Fig.7 Gene expression levels of GeGT1 in different organ

4 討論

天麻是我國名貴的中藥材，以塊莖入藥，含有酚酸類、有機酸類、脂類、多糖類等多種成分，被譽為“治風之神藥”，是一種藥食同源的中草藥[16]，目前已入選安徽十大皖藥，被衛(wèi)建委列入藥食同源試點品種?，F(xiàn)代藥理研究表明，天麻具有鎮(zhèn)靜、抗驚厥、鎮(zhèn)痛、祛風濕、明目增智及延緩衰老等功效[17]。天麻中很多活性成分是以糖苷化的形式存在，包括天麻素、巴利森苷等主要活性成分。因此對天麻糖苷類化合物代謝途徑酶基因的研究有利于提高天麻藥用植物資源的應(yīng)用價值。GTs在天麻糖苷類化合物合成過程中，起著至關(guān)重要的作用，目前在其他植物上已有廣泛的報道，然而，天麻中關(guān)于該基因的研究較少。本研究成功克隆了1條GeGT1，ORF全長1 503 bp，編碼500個氨基酸，蛋白相對分子質(zhì)量為55 494.33。通過生物信息學(xué)分析該蛋白具有UDP-GTs的保守結(jié)構(gòu)域，屬于GTB型超家族。構(gòu)建了重組質(zhì)粒pET-28a-GeGT1，在大腸桿菌中誘導(dǎo)出可溶性蛋白，為進一步研究GeGT1基因的體外功能奠定基礎(chǔ)。

GTs是一個功能多樣化的多成員基因家族，根據(jù)其氨基酸序列的相似性、底物特異性、反應(yīng)機制、反應(yīng)類型和三維結(jié)構(gòu)，將GTs分為97個家族（GT1～GT97），其中GT1是含有GTs數(shù)量最多的家族[18]。GTs主要包括2種空間結(jié)構(gòu)：GT-A和GT-B，GT1均采用GT-B折疊結(jié)構(gòu)。在植物細胞中，GT1主要對小相對分子質(zhì)量的大量生物活性天然產(chǎn)物進行糖基化。通過研究發(fā)現(xiàn)，GeGT1屬于含有GT-B結(jié)構(gòu)的GT1家族。GeGT1能夠催化天麻素、巴利森苷等多種次生代謝產(chǎn)物的糖基化反應(yīng)，并且其通常是生物合成中的最后一步。通過對天麻不同部位化學(xué)成分研究表明[19]，天麻素及17種氨基酸和總氨基酸含量大小順序為花序＞莖＞根莖，與GeGT1在花和莖中的表達模式具有相似性。

在葡萄風信子中，葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因在根、鱗莖、葉、花中均有表達，在花中的表達量最高，在根、鱗莖和葉中微量表達[20]；在地黃中，地黃糖基轉(zhuǎn)移酶基因主要在葉和根中表達，在莖中的表達量偏低[13]，這與本實驗得到的GeGT1基因組織表達特異性結(jié)果一致。以上研究表明GeGT1蛋白在不同植物的不同器官中具有不同的表達模式。本研究中對GeGT1基因的克隆及生物信息學(xué)分析彌補了蘭科藥用植物天麻GeGT1基因的空缺，建立了原核表達體系，為其在分子水平上的進一步研究奠定物質(zhì)基礎(chǔ)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突