趙梓丹，黃 為，和君建，馮 超

中南大學湘雅三醫(yī)院肝膽胰外科，湖南 長沙410013

肝細胞癌（HCC）是原發(fā)性肝癌的主要組織學形式，其發(fā)病率占肝癌的70%～90%［1］。截至2018年，肝癌在全世界上常見的癌癥中排第6，2018年肝癌相關死亡人數約為78.1 萬［2］。HCC 的高轉移率和復發(fā)率導致HCC的5年生存率很低［3］。因此研究HCC發(fā)生及其生殖調控機制對于肝癌的防治具有十分重要的意義。

自噬是一個高度保守的分解代謝過程，通過退化受損的細胞器和蛋白質來維持細胞內穩(wěn)態(tài)［4］。同時在HCC中發(fā)揮重要作用［5］。近年來，有關自噬與肝癌的研究越來越多［6,7］。自噬相關基因（ATGs）是啟動自噬的關鍵基因，ATG14作為PI3K復合物的特異亞基，被認為是肝癌細胞自噬的關鍵調節(jié)因子［8］。這提示ATG14介導的肝癌細胞自噬可作為治療肝癌的潛在靶點。

研究發(fā)現miRNA的表達與多種惡性腫瘤相關，可影響腫瘤細胞的增殖、凋亡、分化、侵襲和轉移［9,10］。且有文獻報道，miR-424-5p在肝癌的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用［11］，但其是否通過細胞自噬的作用肝癌細胞尚未被研究。

本研究以肝癌組織中低表達的miR-424為主要研究靶點，構建miR-424過表達和敲降的肝癌細胞模型，觀察miR-424對ATG14表達、自噬和肝癌細胞增殖的影響，從而為研究抑制肝癌細胞的生長、肝癌的有效防治奠定理論基礎。

1 材料和方法

1.1 方法

1.1.1 臨床資料 在中南大學湘雅三醫(yī)院進行部分肝切除術的HCC患者中，收集36例肝癌患者因手術切除的肝癌組織及癌旁組織，所有樣本的獲得及后續(xù)的實驗研究均通過我院倫理審查委員會審查和患者或家屬的知情同意。所有樣本離體后迅速放入液氮中保存，用于后續(xù)檢測miR-424-5p，ATG14的表達?；颊呷虢M要求：所有患者在手術前均未接受過放化療、射頻治療或生物治療等治療措施，術后病理學診斷為原發(fā)性HCC。

1.1.2 術后隨訪及生存分析 采用電話和門診復診方式隨訪，患者死于肝癌為終點事件，死于其他疾病、失訪或至隨訪結束時患者仍存活為截尾事件。隨訪指標為患者術后臨床檢驗指標和患者生存情況，Kaplan-Meier法繪制生存曲線。

1.1.3 細胞培養(yǎng) 人肝癌細胞系HepG2、SMMC-7721、Huh-7、MHCC97H、HCCLM3和人正常肝細胞LO2購買中國科學院上海細胞生物研究所。所有細胞系在含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基（Gibco,Grand Island,NY,USA）中培養(yǎng)，培養(yǎng)基中添加1%青霉素/鏈霉素，細胞置于37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。

1.1.4 細胞轉染miR-424-5p mimic 和miR-424-5p inhibitor（50 mg）及其陰性對照，ATG14過表達載體質粒（pcDNA3.1-ATG14，2 μg）及其陰性對照均購買自吉瑪基因公司（上海）。選取對數生長期的Huh-7、HCCLM3肝癌細胞，按照2×105/孔密度接種于24孔培養(yǎng)板中，待細胞密度達50%～70%時，更換為不含胎牛血清的RPMI 1640 培養(yǎng)基。Huh-7細胞實驗分組（n=3）：干擾miR-424-5p表達陰性對照組（in-NC組）：轉染miR-424-5p抑制劑的陰性對照；干擾miR-424-5p表達組（in-miR-424-5p 組）：轉染miR-424-5p 抑制劑；HCCLM3細胞實驗分組（n=3）實驗分組：過表達miR-424-5p陰性對照組（mi-NC組）：轉染miR-424-5p模擬劑的陰性對照；過表達miR-424-5p組（mi-miR-424-5p組）：轉染miR-424-5p模擬劑、；in-NC組、in-miR-424-5p組、過表達miR-424-5p陰性對照+過表達ATG14陰性對照組（mi-NC+NC組）：轉染miR-424-5p模擬劑的陰性對照和過表達ATG14陰性對照質粒；、過表達miR-424-5p 陰性對照+過表達ATG14 組（mi-NC+ATG14組）：轉染miR-424-5p 模擬劑的陰性對照和過表達ATG14質粒；、過表達miR-424-5p+過表達ATG14陰性對照組（mi-miR-424-5p+NC組）：轉染miR-424-5p模擬劑和過表達ATG14陰性對照質粒；、過表達miR-424-5p+過表達ATG14組（mi-miR-424-5p+ATG14組）：轉染miR-424-5p模擬劑和過表達ATG14質粒。轉染使用Lipofectamine 2000 試劑（Invitrogen,Carlsbad,CA,USA），按說明書的操作進行。

1.1.5 qRT-PCR 使用TRIZOL（Invitrogen）提取總RNA。mRNA利用逆轉錄試劑盒（TaKaRa）進行逆轉錄，mi RNA逆轉錄使用mi Script 逆轉錄試劑盒（Qiagen）合成。所有操作按試劑盒的使用說明進行。使用LightCycler 480（Roche）熒光定量PCR儀檢測基因的表達，反應條件按熒光定量PCR 試劑盒（SYBR Green Mix,Roche）的操作說明進行。熱循環(huán)參數為：95 ℃10 s，然后95 ℃5 s，60 ℃10 s，72 ℃10 s，共45個循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min。定量PCR 每個反應設置3 個重復。miRNA內參用U6，mRNA內參用GAPDH。數據分析采用2-ΔΔCt法，ΔΔCt=實驗組（Ct目標基因-Ct內參）-對照組（Ct目標基因-Ct內參）。各基因及其內參的擴增引物序列詳見表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.1.6 MTT法檢測細胞增殖情況 將各組分別培養(yǎng)24、48、72 h 后，每孔加MTT 液（5 mg/mL，Merck KGaA）20 μL，37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱孵育4 h，終止培養(yǎng)，棄去培養(yǎng)液。每孔再加入DMSO，劑量為150 μL，輕勻搖動10 min，促進結晶溶解。在酶聯免疫檢測儀上450 nm波長下測定各孔的吸光度值（A450nm）；將吸光度值設置為縱坐標，時間設置為橫坐標后繪制MTT曲線圖。每組的吸光度值重復測量3次取平均值。

1.1.7 流式細胞術檢測細胞凋亡水平 將細胞制成單細胞懸液，2000 r/min離心收集，PBS洗2次后，重懸于結合緩沖液中，在含有約105細胞的195 μL細胞懸液中加入5 μLAnnexin-V-FITC染色液和PI染色液，混合均勻，避光孵育10 min后使用流式細胞儀（BD Biosciences）檢測凋亡率。

1.1.8 Western blot檢測相關蛋白表達 使用RIPA裂解液（碧云天）裂解細胞，獲得蛋白樣品。利用BCA試劑盒（碧云天）測量蛋白濃度后，取相應體積的蛋白加入上樣緩沖液（碧云天）混勻，沸水浴加熱3 min，使蛋白變性。80 V 電泳30 min，待溴酚藍進入分離膠后改用120 V，電泳1～2 h。轉膜在冰浴中進行，轉膜電流為300 mA，時間為60 min。轉膜后把膜放入洗滌液中漂洗1～2 min，再將膜放入封閉液中室溫封閉60 min，或者4 ℃封閉過夜。室溫下，搖床上孵育一抗（GAPDH（5174S，1∶1000）、LC3-I/LC3-II（12741S，1∶1000）、Beclin1（3495S，1∶1000）、p62（88588S，1∶1000）、購于Cell Signaling,Boston,USA 和ATG14（ab241298，1∶1000）購于abcam，CA，USA）1 h，洗滌液洗滌3次，每次10 min。轉入二抗（辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG，1∶5000，北京康維世紀生物科技有限公司）中，室溫下孵育1 h，洗滌3次，每次10 min。在膜上滴加顯影液后，利用化學發(fā)光成像系統(tǒng)（Bio-rad）進行檢測。

1.1.9 雙熒光素酶報告基因實驗 通過StarBase 工具（http://starbase.sysu.edu.cn/）預測miR-424-5p與ATG14結合的位點。進入StarBase首頁，點擊miRNA-mRNA工具欄，隨后在target 該欄輸入ATG14，確定后，點擊“Quick Search”，隨后在Search這欄輸入miR-424-5p，結果表明miR-424-5p與ATG14存在結合位點。根據預測的結果，分別設計和合成結合位點的野生序列和突變序列（wt-ATG14和mut-ATG14）。分別將結合位點的野生序列和突變序列插入熒光素酶報告基因載體（pGL3-Basic）中，再分別與miR-424-5p mimic（50 nmol/L）或陰性對照（mimic NC）共轉染HCCLM3細胞。轉染后使用Promega GLOMAX 檢測儀器（Promega）檢測各組Firefly熒光素酶活性和Renilla熒光素酶活性，Renilla熒光素酶活性作為內參，Firefly熒光素酶與Renilla熒光素酶活性的比值為熒光素酶的相對活性。

1.2 統(tǒng)計學分析

用GraphPad prism7軟件進行統(tǒng)計學分析，所有數據用均數±標準差表示。兩組之間的比較采用t檢驗，多組之間的比較采用單因素方差分析，相關性采用Pearson相關分析，Kaplan-Meier用于生存分析。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 miR-424-5p在肝癌組織或細胞中低表達情況

2.1.1 miR-424-5p在肝癌組織中低表達 對36個肝癌組織和相匹配的癌旁樣本中miR-424-5p的檢測發(fā)現：miR-424-5p在肝癌組織中的表達顯著下調（圖1A，P=0.002）；進一步根據肝癌組織miR-424-5p平均相對表達量，將患者分為高、低兩表達組，低表達miR-424-5p與腫瘤大小，HBV感染，AFP含量，TNM分級有關，和年齡、性別無關（表2）。隨訪通過生存分析比較了兩組患者五年生存率的差異，與miR-424-5p 高表達的患者的生存率相比，miR-424-5p低表達的患者在五年內的生存率顯著降低（圖1B，P=0.04）。

表2 miR-424-5p的表達與HCC患者臨床特征的關系Tab.2 Association of miR-424-5p expression with clinicopathological characteristics of the patients with hepatocellular carcinoma

圖1 肝癌組織及癌旁組織中miR-424-5p的表達水平Fig.1 Quantification of miR-424-5p expressions in hepatocellular carcinoma tissues and adjacent tissues.A:miR-424-5p expression in hepatocellular carcinoma tissues and adjacent tissues.B:Kaplan-Meier survival analysis;**P＜0.01.

2.1.2 miR-424-5p在肝癌細胞中低表達 qRT-PCR法檢測了5個肝癌細胞系（HepG2、SMMC-7721、Huh-7、MHCC97H 和HCCLM3）和人正常肝細胞（LO2）中miR-424-5p的表達，結果顯示，miR-424-5p在5個肝癌細胞系中的表達均顯著低于LO2 細胞（P=0.02，P＜0.001），其中在Huh-7細胞中表達量最高，在HCCLM3細胞表達量最低，選擇Huh-7和HCCLM3細胞進行后續(xù)實驗（圖2）。

圖2 miR-424-5p在不同肝癌細胞和正常肝細胞的表達比較Fig.2 miR-424-5p expression in hepatocellular carcinoma cell lines and normal hepatocytes;*P＜0.05,***P＜0.001.

2.2 miR-424-5p抑制自噬和肝癌生長

2.2.1 qRT-PCR檢測qRT-PCR檢測Huh-7細胞和HCCLM3細胞中miR-424-5p表達水平，結果顯示：在HCCLM3細胞中mi-miR-424-5p組miR-424-5p的表達量均顯著高于mi-NC組（P＜0.001）；在Huh-7細胞中inmiR-424-5p組miR-424-5p的表達量均顯著低于in-NC組（P＜0.001，圖3）。

圖3 轉染miR-424-5p mimic/inhibitor肝癌細胞中miR-424-5p的表達水平Fig.3 Expression of miR-424-5p after the transfection with miR-424-5p mimic or inhibitor.A:qRTPCR for detecting the expression of miR-424-5p after the transfection with miR-424-5p mimic;B:qRT-PCR for detecting the expression of miR-424-5p after the transfection with miR-424-5p inhibitor.***P＜0.001.

2.2.2 MTT法檢測 采用MTT法檢測細胞增殖活力，結果顯示在HCCLM3細胞中轉染miR-424-5p mimic后，與相應陰性對照組相比，mi-miR-424-5p組細胞增殖顯著被抑制（P=0.02），在Huh-7細胞中轉染miR-424-5p inhibitor后，與相應陰性對照組相比，mi-miR-424-5p組細胞增殖均明顯增強（P=0.02，圖4）。

圖4 MTT法檢測不同miR-424-5p表達水平的HCCLM3細胞和Huh-7細胞的的增殖情況Fig.4 MTT assay for assessing proliferation of MCF-7 and MDA-MB-231 cells with miR-4443 overexpression or knockdown.A:Proliferation of HCCLM3 cells.B:Proliferation of Huh-7 cells.*P＜0.05.

2.2.3 流式細胞術檢測 采用流式細胞術檢測細胞凋亡發(fā)現mi-miR-424-5p組中HCCLM3細胞凋亡水平顯著高于mi-NC組（P=0.02），in-miR-424-5p組中Huh-7細胞凋亡水平顯著低于in-NC組（P=0.008，圖5）。

圖5 流式細胞術檢測不同miR-424-5p表達水平的HCCLM3和Huh-7細胞的凋亡率Fig.5 Flow cytometric analysis of apoptosis of HCCLM3 (A) and Huh-7 (B) cells after miR-424-5p overexpression or knockdown.*P＜0.05,**P＜0.01.

2.2.4 Western blot 檢測 HCCLM3 細胞：與mi-NC 組比較：mi-miR-424-5p組自噬體標志蛋白LC3-II/LC3-I、Beclin1的表達水平顯著降低（P=0.14，P=0.008），自噬受體蛋白P62的含量顯著升高（P=0.004）。Huh-7細胞：與in-NC比較，in-miR-424-5p組自噬體標志蛋白LC3-II/LC3-I、Beclin1的表達水平顯著升高（P=0.006，P=0.007），自噬受體蛋白P62的含量顯著降低（P=0.004，圖6）。

圖6 Western blot檢測不同miR-424-5p表達水平的HCCLM3和Huh-7細胞中自噬相關蛋白LC3II/LC3I、Beclin1和P62的表達水平Fig.6 Western blot analysis of the expressions of autophagy-related proteins LC3II/LC3I,Beclin1 and P62 in HCCLM3(A)and Huh-7(B)cells after miR-424-5p overexpression or knockdown.*P＜0.05,**P＜0.01.

2.3 ATG14是miR-424-5p在HCC中的下游靶點

2.3.1 ATG14在肝癌組織中高表達 通過生物信息學Starbase（http://starbase.sysu.edu.cn）預測到ATG14 可以與miR-424-5p結合，結合位點及突變序列(圖7A)。評估36個肝癌組織和相匹配的癌旁樣本中ATG14的水平，ATG14在肝癌中表達顯著上調（圖7B，P=0.005），進一步分析發(fā)現，ATG14與miR-424-5p水平呈負相關（圖7C）。

圖7 ATG14在肝癌組織中高表達Fig.7 TG14 is overexpressed in hepatocellular tissues.A:StarBase was used to predict the binding of miR-424-5p with ATG14.B:qRTPCR analysis of the expression of ATG14 in hepatocellular carcinoma tissues and matched adjacent tissues.C:Spearman correlation analysis showing a negative correlation between miR-424-5p andATG14.**P＜0.01.

2.3.2 qRT-PCR 及Western blot 檢 測 qRT-PCR 及Western blot法檢測過表達和沉默miR-424-5p細胞中的ATG14表達，過表達miR-424-5p的HCCLM3細胞中ATG14 表達明顯下降（P=0.001，P=0.008），而in-miR-424-5p 組中Huh-7 細胞中ATG14 表達明顯升高（P=0.001，P=0.006，圖8）。

圖8 轉染miR-424-5p inhibitor/mimic肝癌細胞中ATG14的表達水平Fig.8 Expression of ATG14 in Huh-7 and HCCLM3 cell lines after transfection with miR-424-5p inhibitor or mimic.qRTPCR(A,C)and Western blotting(B,D)were used to detect the expression ofATG14 in the cells.**P＜0.01.

2.3.3 雙熒光素酶報告實驗 雙熒光素酶報告基因實驗結果顯示，mut-ATG14組與miR-424-5p共轉染后熒光素酶活性沒有變化，而wt-ATG14 組與miR-424-5p mimic共轉染后熒光素酶活性顯著降低，wt-ATG14組與miR-424-5p inhibitor共轉染后熒光素酶活性顯著升高（P=0.03，P=0.02，圖9）。

圖9 雙熒光素酶報告基因活性檢測Fig.9 Dual luciferase reporter assay for determine the targeting relationship between miR-424-5p and ATG14.*P＜0.05.

2.4 miR-424-5p通過ATG14抑制自噬和肝癌生長

2.4.1 qRT-PCR及Western blot檢測 與mi-NC+NC組相比，mi-NC+ATG14組細胞中ATG14的表達水平明顯增加（P=0.003，P=0.006），而mi-miR-424-5p+NC組細胞中ATG14的表達水平明顯降低（P=0.001，P=0.009），而mi-miR-424-5p+ATG14組較mi-miR-424-5p+NC組細胞中ATG14 的表達水平明顯增加（P=0.003，P=0.007，圖10）。

圖10 各組HCCLM3細胞中ATG14的表達水平Fig.10 Expression ofATG14 in HCCLM3 cells in each group detected by qRT-PCR(A)and Western blotting(B).**P＜0.01.

2.4.2 MTT 法檢測 與mi-NC+NC 組比較：mi-NC+ATG14 組細胞增殖明顯增強（P=0.02），mi-miR-424-5p+NC組細胞增殖明顯被抑制（P=0.03）；mi-miR-424-5p+ATG14組較mi-miR-424-5p+NC組增殖明顯增強（P=0.03，圖11）。

圖11 MTT法檢測各組肝癌細胞的增殖情況Fig.11 Cancer cell proliferation detected by MTT assay.*P＜0.05.

2.4.3 流式細胞術檢測 與mi-NC+NC組相比，mi-NC+ATG14組細胞凋亡明顯減少（P=0.02），而mi-miR-424-5p+NC 組細胞凋亡明顯增加（P=0.008），而mi-miR-424-5p+ATG14組較mi-miR-424-5p+NC組凋亡明顯減少（P=0.02，圖12）。

圖12 流式細胞術檢測各組肝癌細胞凋亡情況Fig.12 Flow cytometric analysis of HCC cell apoptosis in each group.*P＜0.05,＊＊P＜0.01.

2.4.4 Western blot 檢測 與mi-NC+NC 組相比，mi-NC+ATG14組自噬體標志蛋白LC3-II/LC3-I，Beclin1的表達水平顯著升高（P=0.008，P=0.006），而自噬受體蛋白P62的含量顯著降低（P=0.009），而mi-miR-424-5p+NC組自噬體標志蛋白LC3-II/LC3-I，Beclin1的表達水平顯著降低（P＜0.001，P=0.003），而自噬受體蛋白P62 的含量顯著升高（P=0.008），而mi-miR-424-5p+ATG14 組較mi-miR-424-5p+NC 組自噬體標志蛋白LC3-II/LC3-I，Beclin1的表達水平顯著升高(P＜0.001，P=0.002)，而自噬受體蛋白P62 的含量顯著降低（P=0.006，圖13）。

圖13 Western blot檢測自噬相關蛋白LC3II/LC3I、Beclin1和P62的表達水平Fig.13 Expression of LC3II/LC3I,Beclin1 and P62 in HCC cells detected by Western blotting.*P＜0.05,**P＜0.01,***P＜0.001.

3 討論

miRNAs是一類具有調控功能的非編碼RNA，長度在20～25個核苷酸，通過與信使RNA（mRNA）的3'非翻譯區(qū)（3'UTR）結合，在轉錄和轉錄后水平上調控基因表達，在腫瘤中可以作為一個癌基因后抑癌基因發(fā)揮作用。許多miRNAs已被證明可以調節(jié)腫瘤的增殖能力，例如miR-7［12］、miR-19b-1-5p［13］、miR-206［14］。盡管有研究已經證明了miR-424-5p在HCC中的表達異常［15,16］，且miR-424-5p與各種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關，比如口腔癌［17］、非小細胞肺癌［18］、直腸癌［19］等。且目前有報道表明miR-424-5p可以影響細胞周期，從而抑制肝癌細胞的增殖［20］，且miR-424-5p會影響肝癌細胞的活力，遷移侵襲與血管形成［21-23,11］。但miR-424-5p如何影響自噬及其影響HCC發(fā)生發(fā)展中的機制尚不清楚。

在本研究中，肝癌患者癌組織中miR-424-5p表達顯著下調，且miR-424-5p的表達與其預后密切相關。這意味著miR-424-5p 顯著參與HCC 的進展。同時miR-424-5p在五個肝癌細胞系（HepG2、SMMC-7721、Huh-7、MHCC97H和HCCLM3）中的表達均顯著低于LO2細胞。在HCCLM3和Huh-7肝癌細胞分別轉染miR-424-5p mimic 或miR-424-5p inhibitor，qRT-PCR法驗證轉染成功可供后續(xù)使用。另外本研究發(fā)現，miR-424-5p過表達顯著抑制肝癌細胞增殖，促進細胞凋亡，而miR-424-5p低表達發(fā)揮了相反的作用。提示miR-424-5p可對肝癌發(fā)揮抑癌作用。

細胞自噬是一種“自我進食”現象，其通過將細胞內受損的細胞器和錯誤折疊的蛋白質靶向溶酶體降解從而維持細胞穩(wěn)態(tài)。它可以通過維持氧化代謝或促進糖酵解來增強實體瘤缺氧區(qū)域的腫瘤細胞存活率，進而對肝癌的進展起促進作用?？紤]到自噬在癌癥中的作用［24］，我們推測miR-424-5p 也可能影響肝癌細胞自噬。Beclin-1是編碼調節(jié)自噬的蛋白質，充當PI3K復合物的核心亞基，在自噬中起核心作用，其表達水平可反映自噬［25］的發(fā)生。微管相關蛋白1，輕鏈3（LC3）是自噬小體膜上的標記蛋白，以LC3-I和LC3-II兩種形式產生，介導微管和細胞骨架成分之間的物理相互作用。在自噬過程中，LC3-I轉化為LC3-II并被招募為自噬小體，這是自噬小體形成的關鍵步驟。此時，P62 作為LC3-II的底物，與LC3-II形成復合物，最終被自噬溶酶體降解［26］。因此，Beclin-1、LC3、p62是自噬最關鍵的蛋白，是常用的自噬標記物。在我們的研究中，在HCC細胞中，LC3-II/LC3-I和Beclin1水平與miR-424-5p表達呈負相關，而p62的表達隨著miR-424-5p表達的增加而增加。由此可見，miR-424-5p抑制了肝癌細胞自噬。

哺乳動物自噬相關基因14（ATG14）又稱為Barkor/Atg14（L），人源性ATG14 由492 氨基酸構成，其N 端為半胱氨酸殘基富集區(qū)域，哺乳動物中高度保守的半胱氨酸殘基形成卷曲螺旋結構，該結構對磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）復合物靶向內質網必不可少。ATG14是PI3K 復合物中的一個特定亞基，它將PI3K 復合物靶向自噬體形成的可能位點，從而對復合物進行分選，使PI3K 復合物在自噬中發(fā)揮特定作用。ATG14在各種腫瘤細胞如胃癌、卵巢癌中通常會激活自噬［8,27-29］，此外據報道，ATG14的下調顯著抑制了肝癌細胞的增殖和遷移能力［30］?；谝陨涎芯拷Y果，我們進一步研究ATG14的上游調控因子。我們通過生物學在線預測軟件預測到ATG14與miR-424-5p存在結合位點，據此可猜測miR-424-5p可能通過調控ATG14的表達影響自噬在肝癌細胞增殖過程中發(fā)揮調控作用。在本研究中，ATG14在HCC組織及細胞中被上調，此外，ATG14在HCC細胞中的表達與miR-424-5p的表達呈負相關。且通過qRT-PCR及Western blot證實miR-424-5p可以抑制肝癌細胞內源性ATG14的表達，這可能與肝癌細胞自噬和增殖密切相關。

本結果表明，與相應對照組相比，ATG14過表達促進肝癌細胞增殖，抑制細胞凋亡。ATG14過表達部分抑制了過表達miR-424-5p抑制的肝癌細胞增殖。miR-424-5p對肝癌細胞的凋亡有促進作用，而這種作用被過表達ATG14所抵消。更重要的是，過表達ATG14可促進miR-424-5p過表達抑制的肝癌細胞自噬。

綜上所述，本研究證實了miR-424-5p靶向ATG14表達在HCC組織和細胞系中抑制自噬，從而抑制肝癌細胞增殖的可能作用機制，這可能是影響肝癌發(fā)生發(fā)展的一條重要通路，提示肝癌的發(fā)生、發(fā)展與miR-424-5p表達水平密切相關，miR-424-5p的表達水平的檢測可以作為肝癌診斷的參考指標，對于臨床上肝癌早期診斷和早期治療提供了新的思考和方向。