姚 越，張 沖，熊言駿，韓 兵，高幸福，汪 盛

蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院泌尿外科，安徽 蚌埠233000

膀胱癌是最常見(jiàn)的泌尿系惡性腫瘤，是全球男性中第6大最常見(jiàn)癌癥之一［1］。在過(guò)去幾十年中已提出并采用了各種治療策略，根治性膀胱切除術(shù)被認(rèn)為是肌層浸潤(rùn)性膀胱癌的標(biāo)準(zhǔn)治療方法［2］，浸潤(rùn)性低的膀胱癌患者根治性膀胱切除術(shù)后5年生存率為62%［3］。目前，膀胱癌治療方法效果不佳。因此，探索新的靶點(diǎn)靶向治療膀胱癌至關(guān)重要。

let-7 miRNA家族在癌細(xì)胞生物學(xué)過(guò)程中起著重要作用，被廣泛認(rèn)為是抑癌的miRNA，參與了抑癌途徑調(diào)控，并在包括膀胱癌在內(nèi)的許多類(lèi)型的腫瘤組織中被下調(diào)［4-9］。miR-let-7c-5p屬于let-7家族，雖然已有報(bào)道表明miR-let-7c-5p在多種癌細(xì)胞中發(fā)揮抑癌作用［10-15］，但miR-let-7c-5p在膀胱癌進(jìn)展中的確切作用和機(jī)制尚不清楚。我們前期研究發(fā)現(xiàn)miR-let-7c-5p在膀胱癌組織中低表達(dá)，本實(shí)驗(yàn)旨在研究miR-let-7c-5p表達(dá)水平對(duì)膀胱癌細(xì)胞侵襲和遷移的影響，并以高遷移率族蛋白A2（HMGA2）為線索分析miR-let-7c-5p抑制膀胱癌細(xì)胞侵襲和遷移的分子機(jī)制，為膀胱癌的臨床診療提供理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料、試劑

人正常膀胱細(xì)胞SV-HUC-1，膀胱癌細(xì)胞系UMUC-3，5637購(gòu)自上海細(xì)胞庫(kù)，膀胱癌細(xì)胞系T24由蚌醫(yī)一附院郭圓圓課題組惠贈(zèng)，DMEM 培養(yǎng)基、胰蛋白酶（Hyclone）、胎牛血清（FBS）（浙江天杭生物科技），miRlet-7c-5pmimic 和inhibitor 試劑盒，HMGA2 mimic 和inhibitor 試劑盒，Lipofectamin2000（吉瑪基因），Mateigel 基質(zhì)膠和雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)試劑盒（碧云天），RNA 提取試劑盒，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，熒光定量PCR試劑盒，miR-let-7c-5p、HMGA2引物均（Thermo），HMGA2、E-cadherin、N-cadherin、vimentin、Snail、βactin及兔/鼠二抗均（上海艾博抗）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

人正常膀胱細(xì)胞SV-HUC-1和膀胱癌細(xì)胞系T24，UM-UC-3，5637細(xì)胞培養(yǎng)在含10%胎牛血清、100 mg/L鏈霉素、100 U/mL青霉素的DMEM培養(yǎng)基中，放置于37 ℃、5%CO2飽和濕度的細(xì)胞恒溫培養(yǎng)箱中日常培養(yǎng)。

1.3 標(biāo)本來(lái)源

蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院收集癌旁組織（距膀胱癌右后壁5 cm處）及膀胱癌組織例，所有患者術(shù)前均未接受過(guò)靶向、放化療或內(nèi)分泌等輔助治療，所有患者均簽署知情同意書(shū)，實(shí)驗(yàn)方案由蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。

1.4 靶基因檢測(cè)及驗(yàn)證

利用靶基因預(yù)測(cè)軟件miRTarbasemiRTarBase（http://mirtarbase.mbc.nctu.edu.tw/php/index.php），miRWalk（http://mirwalk.umm.uni-heidelberg.de），TargetScan（http://www.targetscan.org/vert_72/）預(yù) 測(cè)miR-let-7c-5p的靶基因。

1.5 細(xì)胞轉(zhuǎn)染分組

取UM-UC-3細(xì)胞株接種于六孔板，待細(xì)胞融合度為整個(gè)六孔板的60%嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)，對(duì)UM-UC-3細(xì)胞中miR-let-7c-5p上調(diào)和下調(diào)，上調(diào)實(shí)驗(yàn)設(shè)模擬物陰性對(duì)照組（mimic NC）、miR-let-7c-5p模擬物組（mimicmiRlet-7c-5p），下調(diào)實(shí)驗(yàn)設(shè)陰性對(duì)照組（inhibitor NC）及miR-let-7c-5p抑制劑組（si-miR-let-7c-5p）；同時(shí)對(duì)UMUC-3細(xì)胞中miR-let-7c-5p和HMGA2下調(diào)，實(shí)驗(yàn)按照如下分組：si-miR-let-7c-5p+NC組、si-miR-let-7c-5p+si-HMGA2組。在37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中轉(zhuǎn)染8 h，換成10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.6 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的UM-UC-3細(xì)胞接種于6孔板中，實(shí)驗(yàn)分為HMGA2-WT+miRNA 陰性對(duì)照組（NCWT）、HMGA2-WT+miR-let-7c-5p模擬物組（HMGA2-WT）、HMGA2-Mut+miRNA 陰性對(duì)照組（NC-Mut）、HMGA2-Mut+miR-let-7c-5p模擬物組（HMGA2-Mut），將構(gòu)建成功的pGL3-HMGA2-3'UTR-Wt 和pGL3-HMGA2-3'UTR-Mut質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至UM-UC-3 細(xì)胞，轉(zhuǎn)染24 h后應(yīng)用雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)試劑盒檢測(cè)HMGA2的熒光強(qiáng)度，具體操作按試劑盒說(shuō)明書(shū)要求進(jìn)行。分析檢測(cè)結(jié)果：A活性倍數(shù)=（R/F）樣品/（R/F）對(duì)照，螢火蟲(chóng)熒光素酶用F 表示，海腎熒光素酶用R 表示。最后以螢火蟲(chóng)熒光素酶與海腎熒光素酶熒光活性的相對(duì)活性比值作為報(bào)告基因活性值（海腎熒光素酶熒光值作為內(nèi)參）。

1.7 總RNA提取及實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)mRNA的相對(duì)表達(dá)量

使用TRizol試劑提取SV-HUC-1和膀胱癌細(xì)胞系T24，UM-UC-3，5637、各轉(zhuǎn)染組細(xì)胞以及膀胱癌組織和癌旁組織中總RNA，使用cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成互補(bǔ)DNA模板；進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR以檢測(cè)細(xì)胞中mRNA的表達(dá)水平。U6作為內(nèi)源對(duì)照F:5'-CGCTTCGGCAGC ACATATAC-3' R:5'-CAGGGGCCATGCTAATCTT-3'，miR-let-7c-5p F：5'-GCCAACGUUCGAUUUCUACC UCA-3'R:5'-UUGGUAUGUUGGAUGAUGGAGU-3'，HMGA2 F:5'-TCCCTCTAAAGCAGCTCAAAA-3' R:5'-ACTTGTTGTGGCCATTTCCT-3'。RT-qPCR條件：95 ℃持續(xù)3 min，94℃持續(xù)15 s，60℃持續(xù)55 s，72℃持續(xù)30 s，進(jìn)行34個(gè)循環(huán)，通過(guò)2-ΔΔCt方法計(jì)算mRNA相對(duì)表達(dá)量，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.8 Transwell 檢測(cè)上調(diào)和下調(diào)miR-let-7c-5p 后UMUC-3細(xì)胞侵襲遷移能力

侵襲實(shí)驗(yàn)：細(xì)胞分組同1.4，每孔加入60 μL Materigel膠均勻覆蓋Transwell小室底部，培養(yǎng)60 min使之呈半凝固態(tài)。分別取轉(zhuǎn)染后的各組細(xì)胞，消化離心后，用無(wú)血清培養(yǎng)基重懸計(jì)數(shù)，每孔均含1×105細(xì)胞。于24孔板即外室中加入600 μL含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基，每組均設(shè)3個(gè)復(fù)孔。于37 ℃、5%CO2、飽和濕度下培養(yǎng)48 h；取出小室，PBS清洗2次，4%多聚甲醛固定15 min，用1%結(jié)晶紫染液室溫下染色10 min；PBS漂去多余染料，使用電子顯微鏡在200倍放大倍率下對(duì)粘附在孔下部膜上的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。侵襲抑制率（%）=[1-mimic miR-let-7c-5p（或si-miR-let-7c-5p）組侵襲細(xì)胞個(gè)數(shù)/NC組細(xì)胞侵襲個(gè)數(shù)]×100%，遷移實(shí)驗(yàn)：除無(wú)需鋪基質(zhì)膠外步驟同侵襲實(shí)驗(yàn)，遷移抑制率（%）=[1-mimic miR-let-7c-5p（或si-miR-let-7c-5p）組遷移細(xì)胞個(gè)數(shù)/NC組細(xì)胞遷移個(gè)數(shù)]×100%，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.9 Western blot法檢測(cè)蛋白表達(dá)水平

提取組織和各組細(xì)胞蛋白，冰上裂解30 mim，12 000 r/min離心30 min，吸取上清液，每組樣取60 μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE 電泳；蛋白轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯（PVDF）膜；快速封閉液封閉15 min；4 ℃孵育一抗（HMGA2、E-cadherin、N-cadherin、vimentin、Snail、β-actin）過(guò)夜；PBS清洗3次，二抗室溫下孵育2 h；ECL試劑盒暗室發(fā)光顯影，凝膠成像系統(tǒng)獲取圖像。

1.10 統(tǒng)計(jì)分析方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組比較采用單因素方差分析及兩因素方差分析，組間兩兩比較采用LSDt檢驗(yàn)，P＜0.05 認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 生物信息學(xué)軟件Target Scan預(yù)測(cè)miR-let-7c-5p與HMGA2靶向關(guān)系

miR-let-7c-5p 在miRTarbase、Targetscan、miRWalk 3個(gè)在線軟件中分別存在1019、726、2170個(gè)潛在靶基因，經(jīng)過(guò)繪制Venny圖并取其交集共有4個(gè)潛在的靶基因，HMGA2為其中之一（圖1）。

2.2 膀胱癌和癌旁組織中miR-let-7c-5p和HMGA2的相對(duì)表達(dá)量

RT-qPCR結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，癌旁組織相比miR-let-7c-5pmRNA 在膀胱癌組織中表達(dá)降低（P=0.003，圖2A），Western blot 結(jié)果顯示膀胱癌組織中HMGA2蛋白水平表達(dá)增加（P=0.001，圖2B、C）。

2.3 膀胱癌細(xì)胞株中miR-let-7c-5p和HMGA2相對(duì)表達(dá)量

以人正常膀胱細(xì)胞SV-HUC-1作為對(duì)照，檢測(cè)膀胱癌細(xì)胞系T24、UM-UC-3、5637 細(xì)胞中miR-let-7c-5p mRNA相對(duì)表達(dá)量，qRT-PCR結(jié)果顯示，與SV-HUC-1相比，miR-let-7c-5p mRNA在UM-UC-3細(xì)胞中表達(dá)顯著降低（P=0.003，圖3A），HMGA2 mRNA在UM-UC-3細(xì)胞中表達(dá)顯增加（P=0.001，圖3B），同時(shí)Western blot結(jié)果表明，HMGA2在UM-UC-3細(xì)胞中顯著增加（P=0.003，圖3C、D）。

圖3 膀胱癌細(xì)胞株中miR-let-7c-5p和HMGA2相對(duì)表達(dá)量Fig.3 Expression of miR-let-7c-5p and HMGA2 in bladder cancer cell lines.A:RT-qPCR for detecting the expression of miR-let-7c-5p.B:RT-qPCR for detecting HMGA2 mRNA expression.C,D:Western blotting for detecting HMGA2 protein expression(n=3,*P＜0.05,**P＜0.01 vs SV-HUC-1 group).

2.4 miR-let-7c-5p與HMGA2的靶向關(guān)系

與對(duì)照組相比，上調(diào)UM-UC-3細(xì)胞中miR-let-7c-5p表達(dá)后HMGA2蛋白的表達(dá)顯著降低（P=0.03，圖4A～4C），而下調(diào)miR-let-7c-5p表達(dá)后HMGA2 蛋白的表達(dá)顯著增加（P=0.005，圖4A～C）。上調(diào)和下調(diào)UM-UC-3細(xì)胞中HMGA2表達(dá)后檢測(cè)miR-let-7c-5p mRNA相對(duì)表達(dá)量，當(dāng)上調(diào)和下調(diào)UM-UC-3細(xì)胞中HMGA2表達(dá)后miR-let-7c-5p mRNA表達(dá)均無(wú)明顯變化（圖4D、E）。同時(shí)雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)顯示，與對(duì)照組相比HMGA2-WT（野生型）相對(duì)熒光素酶活性較NC-WT組明顯降低，miR-let-7c-5p能夠有效抑制野生型HMGA2熒光素酶活性（P=0.01，圖4F），HMGA2-Mut（突變型）組相對(duì)熒光素酶活性與NC-Mut組相比無(wú)明顯變化（圖4F）。

圖4 miR-let-7c-5p與HMGA2的靶向關(guān)系Fig.4 Targeting relationship between miR-let-7c-5p and HMGA2 A:RT-qPCR method for detecting miRlet-7c-5p expression in UM-UC-3 cells with up-regulation and down-regulation of miR-let-7c-5p.B,C:Western blotting for HMGA2 protein expression in UM-UC-3 cells with up-regulation and downregulation of miR-let-7c-5p.D:RT-qPCR for detecting the expression of HMGA2 mRNA in UM-UC-3 cells with up-regulation and down-regulation of HMGA2.E:RT-qPCR for detecting miR-let-7c-5p expression after up-regulation and down-regulation of HMGA2 in UM-UC-3 cells.F:Quantitative analysis of the relative luciferase activity(n=3,*P＜0.05,**P＜0.01 vs mimic NC/inhibitor NC/NC group).

2.5 miR-let-7c-5p對(duì)UM-UC-3細(xì)胞侵襲遷移的影響及其機(jī)制

Transwell結(jié)果表明，當(dāng)上調(diào)miR-let-7c-5p表達(dá)，UM-UC-3細(xì)胞侵襲和遷移能力均顯著下降（P=0.02，P=0.03，圖5A、B），下調(diào)miR-let-7c-5p表達(dá)，UM-UC-3細(xì)胞侵襲和遷移能力顯著增加（P=0.02，P=0.04，圖5C、D）。Western blot結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，上調(diào)miR-let-7c-5p表達(dá)，E-cadherin表達(dá)增加，N-cadherin，vimentin，Snail 蛋白表達(dá)下降（P=0.04，P=0.04，P=0.02，P=0.01，圖5F），下調(diào)miR-let-7c-5p表達(dá)，E-cadherin表達(dá)下降，N-cadherin，vimentin，Snail 蛋白表達(dá)增加（P=0.02，P=0.03，P=0.01，P=0.04，圖5F）。

圖5 miR-let-7c-5p對(duì)UM-UC-3細(xì)胞侵襲遷移的影響Fig.5 Effect of modulation of miR-let-7c-5p expression on invasion and migration of UM-UC-3 cells.A,C:Transwell assay for assessing changes in UM-UC-3 cell invasion and migration;B,D:Data anlysis of A and C;E:RT-qPCR for detecting miR-let-7c-5p expression in UM-UC-3 cells with HMGA2 up-regulation and down-regulation.F-J:Western blotting for expressions of EMTrelated proteins in UM-UC-3 cells with up-regulation and down-regulation of miR-let-7c-5p(n=3,scale bar=100 μm,*P＜0.05,**P＜0.01 vs mimic NC/inhibitor NC group).

2.6 miR-let-7c-5p 靶向調(diào)控HMGA2 表達(dá)抑制UMUC-3細(xì)胞侵襲和遷移

Transwell侵襲和遷移結(jié)果均表明，UM-UC-3侵襲和遷移能力均較單獨(dú)下調(diào)miR-let-7c-5p 降低（P=0.003，P=0.03，圖6A、B），Western blot結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，當(dāng)同時(shí)下調(diào)miR-let-7c-5p和HMGA2表達(dá)，Ecadherin表達(dá)增加，N-cadherin，vimentin，Snail蛋白表達(dá)下降（P=0.01，P=0.03，P=0.02，P=0.02，圖6D），與對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖6 miR-let-7c-5p靶向HMGA2 抑制UM-UC-3細(xì)胞侵襲Fig.6 miR-let-7c-5p inhibits invasion and migration of UM-UC-3 cells by targeting HMGA2.A:Transwell assay for assessing invasion of UM-UC-3 cells with down-regulation of both miR-let-7c-5p and HMGA2 expression.B:Transwell migration assay for assessing migration of UM-UC-3 cells with down-regulation of both miR-let-7c-5p and HMGA2.C:Data anlysis of A and B.D-H:Western blotting for detecting the expressions of EMT-related proteins(n=3,*P＜0.05,**P＜0.01 vs si-miR-let-7c-5p+NC group).

3 討論

越來(lái)越多的證據(jù)表明，miRNA在膀胱癌中異常表達(dá)，并通過(guò)影響細(xì)胞周期，增殖，侵襲和轉(zhuǎn)移，耐藥性和凋亡抑制作用來(lái)促進(jìn)或抑制膀胱癌的發(fā)展和進(jìn)程［16-18］，其中，miR-let-7c-5p在多種癌組織中表達(dá)降低并可能作為其生物標(biāo)志物，其在多種癌細(xì)胞中發(fā)揮抑癌作用［19,20］，如通過(guò)CTHRC1/AKT/ERK途徑抑制食管鱗癌細(xì)胞增殖和遷移，促進(jìn)細(xì)胞凋亡［21］，通過(guò)PI3K/Akt/FoxO信號(hào)通路抑制肝癌細(xì)胞增殖，遷移和侵襲，并誘導(dǎo)G1期阻滯導(dǎo)致抑制肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)［22］，同時(shí)能夠抑制人類(lèi)宮頸癌細(xì)胞的增殖和遷移［23］。結(jié)合最新研究發(fā)現(xiàn)尿液中l(wèi)et-7c簇的表達(dá)可以作為評(píng)估高級(jí)別非肌層浸潤(rùn)性膀胱癌患者疾病進(jìn)展風(fēng)險(xiǎn)的無(wú)創(chuàng)工具［24］，猜測(cè)miR-let-7c-5p可能作為一個(gè)重要的腫瘤抑制因子參與膀胱癌的進(jìn)程。前期實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，與膀胱癌癌旁組織相比，miR-let-7c-5p在膀胱癌組織中低表達(dá)，當(dāng)上調(diào)miR-let-7c-5p表達(dá)，UM-UC-3細(xì)胞侵襲和遷移能力均顯著下降，下調(diào)miRlet-7c-5p表達(dá)，UM-UC-3細(xì)胞侵襲和遷移能力均顯著增加，為了研究miR-let-7c-5p抑制膀胱癌侵襲和遷移的機(jī)制，生物信息學(xué)在基礎(chǔ)研究中發(fā)揮的作用越來(lái)越大，我們通過(guò)基因 預(yù)測(cè)網(wǎng)站miRTarbase，miRWalk，Targetscan預(yù)測(cè)可能與miR-let-7c-5p結(jié)合的靶基因，三個(gè)網(wǎng)站預(yù)測(cè)的靶基因取交集得4個(gè)miR-let-7c-5p的靶基因，發(fā)現(xiàn)HMGA2可能為miR-let-7c-5p的潛在靶基因且HMGA表達(dá)與miR-let-7c-5p表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。

HMGA2（又稱(chēng)HMGI-C）基因?qū)儆诟哌w移率族（HMGA）基因家族，是一種結(jié)構(gòu)型轉(zhuǎn)錄因子，通常在許多惡性腫瘤中過(guò)表達(dá)，癌癥患者中HMGA2的過(guò)度表達(dá)與較高的轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)和不良預(yù)后相關(guān)［25-27］。我們研究發(fā)現(xiàn)，與相鄰癌旁組織相比，HMGA2在膀胱癌組織中高表達(dá)。通過(guò)RT-qPCR、Western blot和雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)均證明HMGA2是miR-let-7c-5p的靶基因，此外，在非肌肉浸潤(rùn)性膀胱癌中，HMGA2的高表達(dá)與較高的復(fù)發(fā)率和進(jìn)展率相關(guān)［28］。miR-let-7c-5p作為一個(gè)潛在的抑癌基因能否調(diào)控HMGA2影響膀胱癌細(xì)胞侵襲和遷移，當(dāng)同時(shí)下調(diào)miR-let-7c-5p和HMGA2表達(dá)后，UM-UC-3細(xì)胞侵襲和遷移均能力被顯著抑制。

沉默HMGA2能夠抑制癌細(xì)胞遷移、侵襲和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）［29-31］。EMT是抑制上皮特征并上調(diào)間充質(zhì)基因表達(dá)而促進(jìn)癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的過(guò)程，是基本的細(xì)胞生物學(xué)過(guò)程，在胚胎發(fā)生、傷口愈合和腫瘤轉(zhuǎn)移的早期階段中發(fā)揮關(guān)鍵作用。同時(shí)，EMT也與膀胱癌的惡性表型密切相關(guān)［32］。為了研究miR-let-7c-5p抑制UM-UC-3細(xì)胞侵襲和遷移是否與EMT相關(guān)，Western blot結(jié)果顯示，單獨(dú)上調(diào)miR-let-7c-5p表達(dá)，E-cadherin表達(dá)增加，N-cadherin，vimentin，Snail蛋白表達(dá)下降，下調(diào)miR-let-7c-5p表達(dá)，E-cadherin表達(dá)下降，N-cadherin，vimentin，Snail蛋白表達(dá)增加，表明上調(diào)miR-let-7c-5p表達(dá)能夠抑制UM-UC-3細(xì)胞EMT，下調(diào)miR-let-7c-5p表達(dá)促進(jìn)UM-UC-3細(xì)胞EMT，當(dāng)同時(shí)下調(diào)miR-let-7c-5p和HMGA2表達(dá)，UM-UC-3細(xì)胞EMT同樣被顯著抑制。

綜上所述，通過(guò)細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，miR-let-7c-5p通過(guò)靶向HMGA2抑制EMT進(jìn)而抑制UM-UC-3細(xì)胞侵襲和遷移，這些發(fā)現(xiàn)有可能為膀胱癌的診斷和治療提供新的思路。