黃河靈，高玉元，聶 坤，王麗娟，1

1華南理工大學(xué)醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510006；2廣東省人民醫(yī)院神經(jīng)科//廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院，廣東 廣州510080

帕金森?。≒D）是臨床上常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，好發(fā)于中老年人，病理特征主要是黑質(zhì)致密部多巴胺能神經(jīng)元丟失，α-突觸核蛋白異常聚集和神經(jīng)炎癥。臨床表現(xiàn)以靜止性震顫、肌強(qiáng)直、運(yùn)動(dòng)遲緩及步態(tài)障礙等為主要癥狀，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量和壽命。近年來，有研究表明過度激活的小膠質(zhì)細(xì)胞引起的神經(jīng)炎癥與PD進(jìn)展有關(guān)［1-4］。PD患者腦脊液和外周血中發(fā)現(xiàn)炎癥因子白介素1（IL-1β）、白介素2（IL-2）、白介素6（IL-6）明顯升高［5-7］，并在尸檢中在中腦黑質(zhì)部位觀察到大量小膠質(zhì)細(xì)胞激活［3］?；罨男∧z質(zhì)細(xì)胞分泌IL-1β等炎癥因子在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮著重要作用［8］，因此進(jìn)一步研究小膠質(zhì)細(xì)胞激活機(jī)制具有重要意義。

巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子（MIF）是一種具有廣泛免疫調(diào)節(jié)的多功能分子，參與多種細(xì)胞活動(dòng)，在調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)、能量代謝和凋亡中發(fā)揮重要作用。MIF參與各種急慢性炎癥發(fā)病機(jī)制中，通過影響腫瘤壞死因子、IL-6、IL-1β等轉(zhuǎn)錄或翻譯促進(jìn)細(xì)胞因子的釋放［9,10］。研究顯示MIF在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中發(fā)揮重要作用［11-14］，在PD患者血清中也發(fā)現(xiàn)MIF 水平增加［15］。最近的研究發(fā)現(xiàn)MIF是NOD樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)3(NLRP3)炎癥小體激活的關(guān)鍵因素，在巨噬細(xì)胞中抑制MIF可以通過抑制NLRP3炎癥小體激活而調(diào)節(jié)IL-1β和IL-18的釋放［16］。NLRP3炎癥小體在神經(jīng)炎癥反應(yīng)起關(guān)鍵作用，神經(jīng)毒素、線粒體破壞是小膠質(zhì)細(xì)胞NLRP3 炎癥小體激活和炎癥因子IL-1β、IL-18釋放的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子［17,18］。同時(shí)，在帕金森病人尸檢中也發(fā)現(xiàn)大腦中存在NLRP3蛋白［19］。由此可知，MIF介導(dǎo)NLRP3炎癥小體可能在PD神經(jīng)炎癥方面存在重要作用。

目前，在PD病理環(huán)境下MIF對(duì)NLRP3炎癥小體的作用和機(jī)制尚未明確。因此，我們提出假說：MIF介導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞NLRP3炎癥小體的表達(dá)，在調(diào)控PD神經(jīng)炎癥方面具有重要作用。本研究采用MPP+/MPTP模擬PD病理環(huán)境下的炎癥反應(yīng)，通過干預(yù)MIF表達(dá)，探討MIF介導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞NLRP3炎癥小體激活對(duì)PD神經(jīng)炎癥的作用。本研究將通過探討小膠質(zhì)細(xì)胞激活引起PD神經(jīng)炎癥的作用及機(jī)制，為PD治療提供新思路、新方向。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞、動(dòng)物和實(shí)驗(yàn)試劑

小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞Bv-2細(xì)胞株由本課題組保存，病毒由吉?jiǎng)P公司合成質(zhì)粒載體和病毒。SPF級(jí)C57BL/6小鼠共56只，6～8周齡，體質(zhì)量25～30 g，（湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司）。小鼠的飼養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)均于華南理工大學(xué)動(dòng)物中心完成，實(shí)驗(yàn)過程均遵循華南理工大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心倫理原則（2019034）。MPP+和MPTP（Sigma）；IL-1β和IL-18ELISA（武漢華美）；Anti-MIF抗體（Abcam）；NLRP3、caspase-1、NF-κB抗體（CST）；細(xì)胞核蛋白與細(xì)胞漿蛋白抽提試劑盒（碧云天）。

1.2 細(xì)胞造模及分組

細(xì)胞實(shí)驗(yàn)以Bv-2細(xì)胞為對(duì)象，設(shè)置MPP+終濃度為0.1、0.2、0.5 mmol為干擾濃度，培養(yǎng)24 h后Western blot 檢測(cè)細(xì)胞NLRP3蛋白表達(dá)水平，選擇最適濃度。將細(xì)胞分為4組，分別為對(duì)照組（無干預(yù)），MPP組（單純MPP+干預(yù)），LV-con組（感染慢病毒陰性病毒和MPP+干預(yù)）和LV-shRNA組（慢病毒陰性病毒MIF-shRNA+MPP干預(yù)）。

1.3 動(dòng)物造模及分組

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)以C57BL/6為對(duì)象，對(duì)小鼠進(jìn)行黑質(zhì)致密部立體定位注射，構(gòu)建特定部位沉默表達(dá)MIF的小鼠模型。造模28 d后，采用急性帕金森病小鼠模型，腹腔注射MPTP 25 mg/kg，2 h/次，共4次。將小鼠分為5組，分別為對(duì)照組（腹腔注射生理鹽水，Ctrl組）、MPTP組（腹腔注射MPTP）、PBS組（腹腔注射MPTP，立體定位注射PBS 2 μL）、AAV-con組（腹腔注射MPTP，立體定位注射AAV-con 2 μL）、AAV-MIF-shRNA組（腹腔注射MPTP，立體定位注射AAV-MIF-shRNA2 μL）。

1.4 小鼠行為學(xué)評(píng)估

給藥前對(duì)小鼠進(jìn)行行為學(xué)訓(xùn)練，MPTP注射后第3天進(jìn)行評(píng)估。爬桿實(shí)驗(yàn)為記錄小鼠由50 cm的桿上爬至底部所需時(shí)間。曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)為觀察小鼠在方盒中的9宮格跨入鄰格次數(shù)2 min，評(píng)分便準(zhǔn)為：跨入次數(shù)大于40次，1分；31～40次，2分；21～30次，3分；小于21次，4分。懸掛實(shí)驗(yàn)為倒置小鼠懸掛在高水平電線上，記錄其抓握情況。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)為：雙后肢均未勾住電線，記1分；有一后肢可穩(wěn)定抓住電線即可獲得1分；如出現(xiàn)間斷抓握情況，記0.5分；穩(wěn)定抓握后向兩側(cè)移動(dòng)，記1分；小鼠懸掛時(shí)間＞10 s，記1分。

1.5 免疫組織化學(xué)檢測(cè)

小鼠斷頸、處死、取腦，將全腦組織固定、脫水、浸蠟、包埋等，制備組織蠟塊，進(jìn)行黑質(zhì)冠狀位石蠟切片，每組取相同位置切片，進(jìn)行脫蠟、脫水、熱修復(fù)，過氧化氫孵育，封閉液封閉1 h，滴加TH抗體（1∶250）、Iba1抗體（1∶200）后4 ℃孵育過夜，用相應(yīng)的二抗室溫孵育1 h，滴加DAB顯色后PBS沖洗，遞增梯度酒精脫水，二甲苯固定后封片，在顯微鏡下觀察。

1.6 Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)

小鼠取腦后，盡量剪碎組織。細(xì)胞干預(yù)后，用PBS潤(rùn)洗。加入蛋白裂解液，在冰上裂解30 min，轉(zhuǎn)移至干凈的1.5 mL EP管中。在冰上超聲破碎細(xì)胞5 min，4 ℃離心12 000g15 min后，轉(zhuǎn)移上清蛋白至另一干凈的EP管中。BCA法測(cè)定蛋白濃度，加入5×Loading buffer煮沸后，使用SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白。PVDF轉(zhuǎn)膜、5%脫脂牛奶封閉后進(jìn)行一抗孵育過夜。而后二抗孵育，采用化學(xué)發(fā)光法曝光。

1.7 構(gòu)建沉默表達(dá)MIF蛋白

在Bv-2細(xì)胞中加入不含胎牛血清的培養(yǎng)基和病毒液，24 h后吸出含有病毒液的培養(yǎng)液，更換為新鮮的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)。慢病毒轉(zhuǎn)染72 h后，在熒光顯微鏡下觀察熒光表達(dá)豐度。更換為含有2 μg/mL嘌呤霉素的完全培養(yǎng)基，用于殺死未感染病毒的野生型細(xì)胞。獲得感染慢病毒MIF-shRNA穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞（Bv-2 LV-shRNA）和慢病毒陰性對(duì)照病毒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞（Bv-2 LV-con）。

1.8 RT-PCR檢測(cè)mRNA表達(dá)

在細(xì)胞中加入Trizol裂解液，經(jīng)氯仿-異丙醇體系提取細(xì)胞總mRNA，逆轉(zhuǎn)錄合成相應(yīng)的cDNA后進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)。

1.9 ELISA

吸取各組MPP+處理的Bv-2上清液，參照ELISA試劑說明書進(jìn)行檢測(cè)。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 26.0 和GraphPad Prism 5 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所有數(shù)據(jù)都以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，符合正態(tài)分布的兩組間均數(shù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；不服從正態(tài)分布的兩組間均數(shù)比較采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)；服從正態(tài)分布的多樣本均數(shù)的組間比較采用單因素方差分析，用Dunnett檢驗(yàn)用于各實(shí)驗(yàn)組均數(shù)比較；不服從非正態(tài)分布的多樣本均數(shù)的組間比較采用Kruskal-WallisH檢驗(yàn)，Bonferoni用于校正組間兩兩比較的檢驗(yàn)水準(zhǔn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 構(gòu)建MIF低表達(dá)Bv-2細(xì)胞模型

RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示感染237病毒為沉默效率最高（P＜0.001）。Western blot 結(jié)果顯示MIF-shRNA 組MIF蛋白水平顯著下降（P=0.014，圖1）。

圖1 感染病毒后細(xì)胞MIF mRNA表達(dá)統(tǒng)計(jì)圖及蛋白表達(dá)統(tǒng)計(jì)圖Fig.1 MIF mRNA(A)and protein(B,C)expressions in Bv-2 cells after infection with MIF shRNAlentivirus.**P＜0.01,***P＜0.001.

圖2 不同濃度MPP+處理激活NLRP3和MIF蛋白表達(dá)Fig.2 NLRP3(A,B)and MIF(A,C)protein expressions in Bv-2 cells treated with different concentrations of MPP+.*P＜0.05,**P＜0.01.

2.2 MPP+可以激活Bv-2細(xì)胞NLRP3及MIF表達(dá)

0.1/0.2/0.5 mmol MPP+干預(yù)細(xì)胞24 h后，MPP+激活細(xì)胞表達(dá)NLRP3（P=0.012）和MIF蛋白（P=0.019）顯著高于對(duì)照組。0.2 mmol MPP+是激活Bv-2的NLRP3炎癥小體最適濃度。MPP+干預(yù)的細(xì)胞NLRP3（P=0.014，圖3）和caspase-1（P=0.014，圖3）的表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組，同時(shí)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-1β（P＜0.001，圖4）和IL-18（P=0.008，圖4）也高于對(duì)照組。

2.3 抑制MIF后可減少M(fèi)PP+激活的Bv-2細(xì)胞NLRP3及炎癥因子表達(dá)，增加MN9D細(xì)胞TH蛋白表達(dá)

感染MIF-shRNA病毒的Bv-2細(xì)胞中NLRP3（P=0.042，圖3）、caspase-1（P=0.003，圖3）的表達(dá)水平顯著低于MPTP組，同時(shí)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-1β（P＜0.001，圖4）和IL-18（P=0.002，圖4）也低于MPTP 組。將MPP+干預(yù)后Bv-2細(xì)胞上清液轉(zhuǎn)移至MN9D細(xì)胞中培養(yǎng)24 h后，觀察MN9D細(xì)胞TH蛋白表達(dá)量。相比于單純MPTP干預(yù)的細(xì)胞上清培養(yǎng)，抑制MIF的Bv-2上清液培養(yǎng)的MN9D細(xì)胞TH（P=0.01，圖4）有增高。

圖3 抑制MIF后，MPP+激活Bv-2細(xì)胞NLRP3、caspase-1、p65蛋白表達(dá)情況Fig.3 Protein level of NRLP3(A,B),caspase-1(A,C),and p65(A,D)in Bv-2 cells in MPP+group and MIF-shRNA group.*P＜0.05,**P＜0.01.

圖4 ELISA檢測(cè)Bv-2細(xì)胞上清液IL-1β、IL-18表達(dá)和條件培養(yǎng)基處理MN9D細(xì)胞TH表達(dá)Fig.4 IL-1β and IL-18 levels in culture supernatant(A,B)and TH protein expression in MN9D cells treated with the conditioned medium(C,D).*P＜0.05,**P＜0.01,***P＜0.001.

2.4 MIF/NF-κB介導(dǎo)MPP+誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞NLRP3炎癥小體激活

各組間細(xì)胞總蛋白中p65（P=0.978，圖5）表達(dá)水平?jīng)]有差異。在MPP+誘導(dǎo)下p65激活入核，細(xì)胞核p65蛋白（P=0.016）表達(dá)水平增加，細(xì)胞漿p65 蛋白（P=0.004）相對(duì)減少。與MPP組比較，MIF-shRNA慢病毒轉(zhuǎn)染的LV-shRNA組在MPP+刺激下，細(xì)胞核內(nèi)p65蛋白表達(dá)水平減少（P=0.016），細(xì)胞漿p65蛋白顯著增加（P＜0.001）。

圖5 抑制MIF后，MPP+激活Bv-2細(xì)胞核漿p65蛋白表達(dá)情況Fig.5 Protein expression of p65 (A) in the cell nuclei (C) and cytoplasm (B) in Bv-2 cells in MPP+group and MIF-shRNA group.*P＜0.05,**P＜0.01,***P＜0.001.

2.5 抑制MIF可改善PD模型小鼠的行為障礙

腹腔注射MPTP 構(gòu)建的PD 小鼠模型，可見與對(duì)照組相比，MPTP 組曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)（P＜0.001）和爬桿實(shí)驗(yàn)（P=0.028）評(píng)分明顯增高，懸掛實(shí)驗(yàn)（P＜0.001）評(píng)分明顯降低。而注射AAV-MIF-shRNA組與MPTP組相比，曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)（P=0.026）評(píng)分和爬桿實(shí)驗(yàn)（P=0.024）評(píng)分明顯降低，懸掛實(shí)驗(yàn)（P=0.001，圖6）評(píng)分明顯升高。

圖6 各組小鼠曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)、懸掛實(shí)驗(yàn)、爬桿實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖Fig.6 Results of field test(A),traction test(B)and pole test(C)of the mice.*P＜0.05,**P＜0.01,***P＜0.001.

2.6 抑制MIF可減少PD模型小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞活化、黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元損傷

通過免疫組化TH染色和Iba-1染色，發(fā)現(xiàn)MPTP組黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元數(shù)量明顯減少（P=0.004），小膠質(zhì)細(xì)胞激活數(shù)目增多（P=0.035），而AAV-MIF-shRNA組小鼠黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元數(shù)量較MPTP 組增加（P=0.004），且小膠質(zhì)細(xì)胞激活數(shù)量減少（P=0.049，圖7、8）。

圖7 小鼠黑質(zhì)區(qū)致密部TH染色結(jié)果Fig.7 TH immunohistochemical staining of the substantia nigra (A) and quantitative analysis of TH expression(B).**P＜0.01.

2.7 各組小鼠中腦黑質(zhì)中MIF、NLRP3及TH蛋白表達(dá)

與生理鹽水對(duì)照組比較，腹腔注射MPTP的PD小鼠模型中發(fā)現(xiàn)黑質(zhì)區(qū)NLRP3蛋白表達(dá)水平明顯增加（P=0.006），TH蛋白表達(dá)減少（P＜0.001），MIF蛋白表達(dá)有增多的趨勢(shì)但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.172）。抑制MIF表達(dá)的小鼠較MPTP 組MIF 蛋白表達(dá)明顯減少（P=0.033），NLRP3蛋白表達(dá)也明顯減少（P=0.045），TH蛋白表達(dá)增多（P=0.043）。

3 討論

PD是一種遺傳和環(huán)境共同作用的疾病，主要病理特征是多巴胺能神經(jīng)元變性、α-突觸核蛋白異常聚集和神經(jīng)炎癥。發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，與神經(jīng)炎癥、氧化應(yīng)激、線粒體功能障礙等多方面有關(guān)。越來越多研究表明，神經(jīng)炎癥與帕金森病病理生理過程中起關(guān)鍵作用，MPTP、α-突觸核蛋白均可激活NLRP3 炎癥小體并誘導(dǎo)IL-1β生成［20］，NLRP3炎癥小體與多巴胺能神經(jīng)元丟失存在關(guān)聯(lián)［21,22］，提示NLRP3炎癥小體介導(dǎo)的神經(jīng)炎癥反應(yīng)可能是PD的重要發(fā)病機(jī)制。作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)主要的先天免疫細(xì)胞，小膠質(zhì)細(xì)胞在炎癥反應(yīng)過程是主要的免疫應(yīng)答細(xì)胞［23］，在病理情況下小膠質(zhì)細(xì)胞的激活和炎癥因子釋放會(huì)導(dǎo)致慢性神經(jīng)炎癥和神經(jīng)元功能障礙［24,25］。因此，在PD病理環(huán)境下的炎癥反應(yīng)以小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)為主。本研究采用MPP+刺激Bv-2小膠質(zhì)細(xì)胞模擬PD病理環(huán)境，觀察到MPP+處理后的小膠質(zhì)細(xì)胞NLRP3炎癥小體相關(guān)蛋白NLRP3、caspase-1表達(dá)增加和細(xì)胞因子IL-1β、IL-18釋放，說明MPP+可以激活Bv-2細(xì)胞NLRP3炎癥小體，這與既往研究結(jié)果一致［26,27］。并且在MPTP動(dòng)物模型中觀察到黑質(zhì)區(qū)NLRP3蛋白表達(dá)，多巴胺能神經(jīng)元丟失和小膠質(zhì)細(xì)胞激活活化，這與目前研究結(jié)果中PD患者的腦內(nèi)情況相近［3］，說明MPP+/MPTP模型可以成功模擬PD患者大腦炎癥環(huán)境。

圖8 小鼠黑質(zhì)區(qū)致密部Iba-1染色Fig.8 Iba-1 immunohistochemical staining of the substantia nigra (A) and quantitative analysis of Iba-1 expression(B).*P＜0.05.

圖9 各組小鼠黑質(zhì)區(qū)MIF、NLRP3、TH蛋白表達(dá)情況Fig.9 Expression of TH(A,D),MIF(A,B),and NLRP3(A,C)in the substantia nigra in different groups.*P＜0.05,**P＜0.01,***P＜0.001.

NLRP3炎癥小體主要存在于小膠質(zhì)細(xì)胞中的炎性復(fù)合體［28］，主要由NLRP3蛋白、銜接蛋白細(xì)胞凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白（ASC）和效應(yīng)分子pro-caspase-1組成的多蛋白復(fù)合體。NLRP3的激活需要兩個(gè)信號(hào)，通過TLR識(shí)別刺激，激活NF-κB上調(diào)NLRP3和IL-1β轉(zhuǎn)錄水平作為啟動(dòng)信號(hào)，ASC通過吡啉結(jié)構(gòu)域與NLRP3結(jié)合，組裝成復(fù)合體。誘導(dǎo)pro-caspase-1自切割，成為有活性的caspase-1，促進(jìn)炎癥因子IL-1β和IL-18成熟和分泌［29,30］。級(jí)聯(lián)效應(yīng)放大炎癥反應(yīng)，最終導(dǎo)致促炎細(xì)胞死亡［31,32］。既往研究發(fā)現(xiàn)，MPTP模型中NLRP3炎癥小體與多巴胺能神經(jīng)元丟失有關(guān)，因此，對(duì)于帕金森病的NLRP3炎癥小體的誘導(dǎo)和抑制的研究對(duì)疾病治療具有重要意義。

MIF參與炎癥和自身免疫系統(tǒng)疾病，增加促炎因子分泌的同時(shí)也抑制抗炎因子［33,34］。有研究證明，MIF可以抑制糖皮質(zhì)激素的免疫調(diào)節(jié)作用［10,35］，具有改變炎癥反應(yīng)的潛力。既往研究結(jié)果顯示，MIF是通過Toll樣受體4（TLR4）調(diào)節(jié)先天免疫反應(yīng)［36］。MIF缺失減少TLR4表達(dá)和NF-κB活性降低。在動(dòng)物模型中證明，TLR4敲除抑制MPTP 誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞活化，NF-κB 和NLRP3炎癥小體通路［37］。在細(xì)胞模型中驗(yàn)證TLR4信號(hào)通路是Bv-2細(xì)胞激活和炎癥的關(guān)鍵通路［38］，TLR信號(hào)通路也是NLRP3炎癥小體激活的啟動(dòng)信號(hào)。由此可得，MIF/TLR4/NF-κB/NLRP3通路是導(dǎo)致本研究中抑制MIF表達(dá)可以減少M(fèi)PP+/MPTP誘導(dǎo)的NLRP3炎癥小體的可能機(jī)制。本研究中發(fā)現(xiàn)，我們通過shRNA下調(diào)MIF 表達(dá)的小膠質(zhì)細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)MPP+誘導(dǎo)激活的NLRP3 炎癥小體減少。動(dòng)物注射AAV-MIF-shRNA后，明顯減輕MPTP引起的黑質(zhì)致密部TH多巴胺能神經(jīng)元損傷，緩解小膠質(zhì)細(xì)胞激活。提示降低MIF表達(dá)可抑制NLRP3 炎癥小體激活，緩解神經(jīng)炎癥。Western blot檢測(cè)到細(xì)胞核、漿蛋白中NF-κB信號(hào)分子，發(fā)現(xiàn)抑制MIF表達(dá)降低NF-κB活性。

本研究結(jié)果中，在腹腔注射MPTP的動(dòng)物模型未發(fā)現(xiàn)明顯的MIF蛋白表達(dá)增多，可能是由于黑質(zhì)區(qū)的蛋白提取含有雜細(xì)胞導(dǎo)致蛋白表達(dá)增多未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的結(jié)果，本課題組前期研究結(jié)果顯示，在急性和慢性MPTP模型中，小鼠黑質(zhì)部位免疫組化MIF表達(dá)明顯增加［39］。本研究在細(xì)胞模型對(duì)PD模型NLRP3炎癥小體激活的機(jī)制進(jìn)行闡述，但未進(jìn)行進(jìn)一步動(dòng)物模型機(jī)制驗(yàn)證，MIF介導(dǎo)的NLRP3激活調(diào)控機(jī)制還有待進(jìn)一步探索。

綜上所述，抑制MIF表達(dá)可以減少M(fèi)PP+/MPTP干預(yù)所引起的小膠質(zhì)細(xì)胞NLRP3炎癥小體表達(dá)和炎癥因子釋放，減輕小膠質(zhì)細(xì)胞激活，緩解炎癥反應(yīng)，改善MPTP引起的黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元損傷，在PD神經(jīng)炎癥方面具有保護(hù)作用。靶向抑制小膠質(zhì)細(xì)胞MIF表達(dá)可以改善神經(jīng)炎癥、減輕神經(jīng)元損傷，可能是PD治療的有效途徑。