張潤澤,鄭艷,賈惠卿,2,遲菁華,項鋒鋼,2,王成勤,2
(青島大學,山東 青島 266071 1 基礎(chǔ)醫(yī)學院病理學系;2 附屬醫(yī)院病理科)
乳癌是全世界女性最常見的惡性腫瘤,也是第二大常見的癌癥致死原因[1]。據(jù)統(tǒng)計,乳癌發(fā)病率占全身各種惡性腫瘤的7%~10%。三陰性乳癌(TNBC)是指雌激素受體(ER)、孕激素受體(PR)和人表皮生長因子受體(HER2)表達均為陰性的乳癌,占所有乳癌病理類型的12%~17%[2]。TNBC好發(fā)于相對年輕的婦女,具有預后差、復發(fā)率高、轉(zhuǎn)移率高和死亡率高等特點,已成為近年來乳癌研究和關(guān)注的焦點。已有研究證實,與Luminal型和HER2過表達型的乳癌相比,TNBC 對新輔助化療更加敏感,其病理完全緩解(PCR)率更高[3]。
驅(qū)動蛋白超家族蛋白(KIFs)是一類分子馬達,在細胞內(nèi)起著運輸媒介的作用,它可以依靠微管等細胞骨架結(jié)構(gòu)將細胞內(nèi)貨物(如囊泡、細胞器、蛋白質(zhì)復合物和RNA 等)運輸?shù)郊毎麅?nèi)的指定位置[4]。KIFs有14個亞家族,由45個成員組成。KIF3B是KIF3亞家族的成員,它是一種重要的蛋白質(zhì),在有絲分裂期間,KIF3B 負責囊泡運輸和膜擴張,從而調(diào)節(jié)細胞遷移。近年來,KIF3B 與疾病的發(fā)生和發(fā)展之間的關(guān)系越來越受到關(guān)注[5]。已有研究發(fā)現(xiàn),KIF3B在胰腺癌、肝癌、口腔鱗癌、精原細胞瘤、胃癌、結(jié)腸直腸癌和前列腺癌中存在異常表達[5-11]。但目前尚未有關(guān)于KIF3B 與TNBC 關(guān)系的報道。本研究擬沉默乳癌細胞中KIF3B基因,以觀察其對細胞增殖、遷移、侵襲、細胞周期、上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)相關(guān)蛋白表達和阿霉素敏感性的影響。
人TNBC 細胞株MDA-MB-231和MDA-MB-468購自中國科學院(中國上海);KIF3B 抗體購自美國Santa Cruz公司;β-actin抗體購自武漢云克隆科技股份有限公司;E-cadherin抗體購自英國Abcam 公司;基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP-2)和MMP-9抗體均購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司;羊抗鼠和羊抗兔二抗均購自Bioworld公司;sh-KIF3B沉默質(zhì)粒及sh-NC 質(zhì)粒購自上海吉凱基因化學技術(shù)有限公司;Transwell小室購自美國Corning公司;DMEM 培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司;Matrigel基質(zhì)膠購自美國BD 生物技術(shù)公司;胎牛血清購自美國Gibco公司;增強化學發(fā)光(ECL)試劑盒購于美國Millipore公司;LipofectamineTM2000 購于美國Invitrogen公司;碘化丙啶(PI)溶液、MTT 粉末、二甲基亞砜(DMSO)、鹽酸阿霉素、結(jié)晶紫粉末均購自北京索萊寶科技有限公司;RNAse A 溶液購于天根生化科技有限公司。
1.2.1細胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 將MDA-MB-231細胞和MDA-MB-468細胞置于含有體積分數(shù)0.10胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基中,在37 ℃、含體積分數(shù)0.05 CO2的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。用Western blot法檢測MDA-MB-231 細胞和MDA-MB-468 細胞KIF3B表達,取KIF3B 高表達細胞MDA-MB-231用于后續(xù)實驗。轉(zhuǎn)染前1 d 將處于對數(shù)生長期的MDAMB-231細胞接種到6孔板中,達到70%融合度時,按照說明書方法用LipofectamineTM2000把質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞,培養(yǎng)72 h 用于后續(xù)實驗。將未經(jīng)處理的MDA-MB-231細胞作為MOCK 組,將轉(zhuǎn)染sh-NC質(zhì)粒的MDA-MB-231 細胞作為sh-NC 組,將轉(zhuǎn)染sh-KIF3B沉默質(zhì)粒的MDA-MB-231細胞作為sh-KIF3B組。
1.2.2Western blot法檢測細胞中KIF3B及EMT相關(guān)蛋白表達 提取MDA-MB-231細胞和MDAMB-468細胞蛋白,用BCA 法檢測蛋白濃度,加入蛋白上樣緩沖液煮沸。行SDS-PAGE 凝膠電泳分離蛋白,300 m A 轉(zhuǎn)膜2 h將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上,室溫下用50 g/L 脫脂奶粉封閉2 h,分別加入一抗KIF3B(1∶500)、E-cadherin(1∶1 000)、MMP-2(1∶1 000)、MMP-9(1∶1 000)和β-actin(1∶4 000)4 ℃孵育過夜,TBST 洗膜3次,加入相應(yīng)二抗(1∶4 000)室溫孵育2 h,重復TBST 洗膜步驟,最后加入ECL后曝光顯影并分析條帶灰度值。目的蛋白相對表達量以目的條帶灰度值/β-actin條帶灰度值表示。比較不同細胞KIF3B表達效率,取KIF3B 高表達細胞MDA-MB-231用于后續(xù)沉默實驗。重復上述步驟,提取對數(shù)生長期的MOCK 組、sh-KIF3B組和sh-NC組細胞蛋白,檢測KIF3B沉默效率。
1.2.3Transwell實驗檢測細胞遷移及侵襲能力取對數(shù)生長期的sh-KIF3B組和sh-NC 組細胞,用胰蛋白酶消化后重懸于無血清DMEM 培養(yǎng)基,調(diào)整細胞密度為1×108/L,在Transwell小室上室(均勻鋪稀釋過的50 mL Matrigel基質(zhì)膠,Matrigel基質(zhì)膠∶無血清培養(yǎng)基=1∶8)均勻加入200μL細胞懸液,下室加入600μL 含體積分數(shù)0.15胎牛血清的培養(yǎng)基。當觀察到下室有細胞穿過后,取出上室,吸出培養(yǎng)基并用PBS沖洗,用棉棒輕輕擦去上室未穿過的細胞,多聚甲醛固定15 min,5 g/L結(jié)晶紫染色30 min,流水沖洗干凈,晾干后200倍光鏡下隨機選取5個視野觀察并計數(shù)。
1.2.4MTT 實驗檢測細胞增殖 將處于對數(shù)生長期的sh-KIF3B組和sh-NC 組細胞以每孔3×103個接種于96孔板,每組分別接種6個復孔,將細胞置于37 ℃、含體積分數(shù)0.05 CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng),分別于培養(yǎng)1、2、3、4、5 d后,向各孔中加入20μL MTT(PBS配制,5 g/L)溶液并于培養(yǎng)箱孵育2 h,棄去上清液,每孔中加入DMSO 溶液150μL,低速震蕩10 min,使用全功能微孔板檢測儀檢測各孔490 nm 波長處的吸光度(A)值,分析數(shù)據(jù)并繪制細胞生長曲線。
1.2.5流式細胞術(shù)檢測細胞周期 取對數(shù)生長期的sh-KIF3B組和sh-NC 組細胞胰蛋白酶消化后離心,用預冷的PBS洗滌3次,加入體積分數(shù)0.70乙醇4 ℃固定過夜,再次使用PBS溶液洗滌3次后加入200μL PBS和2μL RNaseA(終濃度為20 mg/L)重懸細胞,37 ℃孵育30 min,再加入500μL PI染液(終濃度為50 mg/L),避光孵育30 min,最后使用流式細胞儀檢測細胞周期分布。
1.2.6MTT 實驗檢測細胞活性 將對數(shù)生長期的sh-KIF3B組和sh-NC組細胞,以每孔1×104個接種于96孔板,待細胞貼壁后,再分別加入阿霉素使其濃度達到0.10、0.25、0.50、1.00、2.00、5.00μmol/L,同時設(shè)置空白組,每組設(shè)置6個復孔,繼續(xù)培養(yǎng)48 h后,向各孔中加入20μL MTT(PBS配制,5 g/L)溶液并于培養(yǎng)箱孵育2 h,棄去上清液,每孔加入DMSO 溶液150μL,低速震蕩10 min,用全功能微孔板檢測儀檢測各孔490 nm 波長處吸光度(A)值。計算各給藥組的細胞存活率。細胞存活率(%)=(實驗組A 值-空白組A 值)/(對照組A 值-空白組A 值)×100%。
以上所有實驗均獨立重復3次。
應(yīng)用SPSS 25.0軟件進行統(tǒng)計學分析。正態(tài)分布計量數(shù)據(jù)以表示,兩組間比較采用t檢驗,多組間比較采用單因素方差分析及析因設(shè)計的方差分析。以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。
Western blot法檢測結(jié)果顯示,KIF3B 蛋白在MDA-MB-231中呈高表達,而在MDA-MB-468 細胞中呈低表達,兩種細胞KIF3B蛋白表達比較差異有統(tǒng)計學意義(t=19.92,P<0.01)。將MDA-MB-231細胞用于沉默KIF3B基因,分別轉(zhuǎn)染sh-NC質(zhì)粒和sh-KIF3B沉默質(zhì)粒。Western blot法檢測結(jié)果顯示,sh-KIF3B組KIF3B蛋白表達較MOCK組和sh-NC 組明顯減少,差異有統(tǒng)計學意義(F=284.56,P<0.01)。表明KIF3B基因成功沉默。見圖1。
圖1 Western blot檢測TNBC細胞系中KIF3B蛋白表達及沉默效率
Transwell遷移實驗顯示,沉默MDA-MB-231細胞KIF3B基因后,sh-KIF3B組遷移細胞數(shù)目(269.4±21.4)明顯低于sh-NC組(754.2±29.8),差異有統(tǒng)計學意義(t=29.54,P<0.01)。侵襲實驗顯示,沉默MDA-MB-231細胞KIF3B基因后,sh-NC組侵襲細胞數(shù)目為(1 120.0±53.5)個,sh-KIF3B組為(452.7±33.5)個,兩組比較差異有顯著意義(t=18.32,P<0.01)。見圖2。
圖2 沉默KIF3B 基因后細胞遷移、侵襲能力變化
MTT 實驗結(jié)果表明,沉默KIF3B對TNBC細胞增殖能力影響的組別與時間之間存在交互效應(yīng)(F組別×時間=49.601,P<0.01)。MDA-MB-231細胞轉(zhuǎn)染sh-KIF3B質(zhì)粒后,同一時間下sh-KIF3B組細胞增殖能力明顯低于sh-NC 組,差異有統(tǒng)計學意義(F=7.56~270.09,P<0.01)。見表1。
表1 KIF3B 沉默后細胞增殖能力變化(n=6,)
流式細胞術(shù)結(jié)果顯示,sh-NC 組和sh-KIF3B組G0/G1期細胞比例分別為(78.29±1.99)%和(71.55±1.39)%,G2/M 期細胞比例分別為(4.72±0.32)%和(10.13±0.38)%。與sh-NC 組相比,sh-KIF3B組細胞G0/G1期比例顯著減少,而G2/M 期比例則顯著增多,差異均有統(tǒng)計學意義(t=4.82、19.05,P<0.01)。見圖3。
圖3 流式細胞術(shù)檢測KIF3B 沉默后細胞周期變化
MTT 實驗結(jié)果顯示,沉默KIF3B后TNBC細胞對阿霉素敏感性影響的組別與濃度存在交互效應(yīng)(F組別×濃度=15.201,P<0.01)。在相同濃度阿霉素作用下,sh-KIF3B組細胞存活率較低,表明沉默KIF3B基因后MDA-MB-231 細胞對阿霉素敏感性明顯上升,差異有顯著意義(F=26.37~167.11,P<0.01)。見表2。
表2 KIF3B 沉默對細胞阿霉素敏感性影響(n=6,χ/%,)
表2 KIF3B 沉默對細胞阿霉素敏感性影響(n=6,χ/%,)
sh-NC組和sh-KIF3B組細胞EMT 相關(guān)蛋白E-cadherin、MMP-2 和MMP-9 的相對表達量見圖4。與sh-NC 組相比較,sh-KIF3B組E-cadherin表達升高,差異有統(tǒng)計學意義(t=19.71,P<0.01);MMP-2和MMP-9表達降低(t=26.57、16.11,P<0.01)。
圖4 沉默KIF3B 對EMT相關(guān)蛋白表達的影響
TNBC具有預后差、復發(fā)率高、轉(zhuǎn)移率高和死亡率高等特點,已成為近年來乳癌研究和關(guān)注的焦點。由于缺乏相應(yīng)治療靶點,TNBC 病人無法從內(nèi)分泌治療或抗HER2治療中獲益。因此,無論是早期還是晚期的TNBC病人,化療是目前最主要的治療方法,并且與其他亞型的乳癌病人相比,TNBC病人對化療有更高的反應(yīng)率。大量研究結(jié)果顯示,TNBC對蒽環(huán)類和紫杉醇藥物治療敏感,目前臨床上針對TNBC的新輔助化療方案主要以蒽環(huán)類和紫杉醇藥物為基礎(chǔ)[12-13]。但除了傳統(tǒng)化療外,TNBC 的治療手段非常有限,因此迫切需要尋找一個新的TNBC治療靶點。
KIFs的功能已廣為人知,其與神經(jīng)退行性疾病、糖尿病和腎病等疾病的發(fā)生密切相關(guān)[14-16]。作為KIF3亞家族的成員,KIF3B參與許多生理過程,包括有絲分裂、減數(shù)分裂和大分子的運輸。在有絲分裂期間,KIF3B 扮演著囊泡運輸和膜擴張的角色,KIF3B還可以調(diào)節(jié)細胞遷移、細胞周期,促進細胞增殖和存活[4]。KIF3B亞基突變使多囊腎病小鼠產(chǎn)生致命表型[17-19]。在遠端腎小管酸中毒中,KIF3B和人腎陰離子交換劑1(k AE1)在人腎組織中共表達,并且KIF3B可能參與了HEK293T 細胞中k AE1的積累[16]。KIF3B也在大鼠腎臟缺血/再灌注損傷和急性脊髓損傷中起著重要作用[20-21]。KIF3B也是皮質(zhì)神經(jīng)元可塑性的負調(diào)節(jié)劑[22]。大量研究表明,驅(qū)動蛋白廣泛參與各種腫瘤的發(fā)生,其表達水平與許多腫瘤的發(fā)生直接相關(guān)[23-25]。有研究顯示,在肝癌、精原細胞瘤、口腔鱗狀細胞癌、胰腺癌、前列腺癌及胃癌等組織中均存在KIF3B 高表達[5-9,11]。在結(jié)直腸癌中過表達KIF3B 可以逆轉(zhuǎn)LEF-AS1敲降引起的細胞增殖、遷移和侵襲抑制并促進細胞的凋亡[10]。hsa_circ_0032462可以調(diào)節(jié)骨肉瘤細胞中KIF3B 水平,而KIF3B 可逆轉(zhuǎn)hsa_circ_0032462過表達誘導的骨肉瘤細胞增殖以及轉(zhuǎn)移[26]。然而,目前尚無敲降KIF3B影響TNBC 細胞生物學特性和阿霉素化療敏感性的報道。
本文Transwell實驗結(jié)果顯示,sh-KIF3B組細胞遷移和侵襲數(shù)量明顯減少,證明沉默MDAMB-231細胞KIF3B基因可以下調(diào)細胞遷移和侵襲能力;MTT 實驗結(jié)果表明,沉默KIF3B基因后細胞增殖能力下降,且在相同濃度阿霉素處理下KIF3B沉默組細胞存活率較低,表明沉默KIF3B可以抑制細胞增殖,并提高細胞對阿霉素的敏感性;流式細胞術(shù)結(jié)果顯示,KIF3B基因沉默后,G0/G1期細胞比例顯著下降,而G2/M 期細胞比例顯著升高,表明沉默KIF3B誘導了細胞周期阻滯。EMT是腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的重要現(xiàn)象,也是腫瘤細胞發(fā)生浸潤遷移和繼發(fā)性轉(zhuǎn)移的重要機制之一[27]。EMT 在乳癌增殖和轉(zhuǎn)移中也有著重要意義[28]。本研究檢測了KIF3B基因沉默后EMT 相關(guān)蛋白表達變化,結(jié)果顯示沉默KIF3B基因后MMP-2 和MMP-9表達降低,而E-cadherin表達升高,差異有顯著性。表明沉默KIF3B可以通過EMT 途徑調(diào)節(jié)TNBC細胞的遷移和侵襲。
綜上所述,沉默TNBC 細胞中KIF3B基因可以抑制細胞遷移、侵襲和增殖能力,阻滯細胞周期,降低MMP-2 和MMP-9 表達,提高E-cadherin 表達。KIF3B基因沉默還可以與阿霉素協(xié)同作用,改善治療效果。因此,KIF3B有望成為新的TNBC 治療靶點。