■馬政發(fā) 許 可 吳文旋，2* 吳佳海

（1.貴州大學動物科學學院，動物營養(yǎng)與飼料科學研究所，貴州貴陽 550025；2.貴州大學新農(nóng)村發(fā)展研究院，貴州省山地畜禽養(yǎng)殖污染控制與資源化技術工程實驗室，貴州貴陽 550025；3.貴州省畜牧獸醫(yī)研究所，貴州貴陽 550005）

低血鈣是圍產(chǎn)乳畜眾多營養(yǎng)代謝性疾病中的核心疾病，其典型特征是血鈣水平降低及代謝活動紊亂失調(diào)[1-2]，引起肌肉收縮功能下降，誘發(fā)子宮內(nèi)膜炎、胎衣不下、難產(chǎn)、真胃移位等疾病，嚴重時可導致動物死亡。研究表明，降低飼糧陰陽離子差（dietary cationanion difference, DCAD），可誘發(fā)機體輕度代償性代謝酸中毒，降低體液（尿液、血液）pH，增強機體對鈣的吸收，提高血鈣水平，是防治低血鈣的有效營養(yǎng)措施[3-5]。

動物發(fā)生低血鈣時，機體通過甲狀旁腺素（para?thyroid hormone, PTH），1,25-二羥基維生素D3[1,25-(OH)VD3]、降鈣素（calcitonin, CT）三大代謝途徑調(diào)控骨吸收、胃腸道吸收和腎臟重吸收的方式維持血鈣穩(wěn)恒[6]。鎂作為體內(nèi)重要的陽離子，與胞內(nèi)許多酶活、體液鈣、磷等存在一定的互作關系，會通過影響PTH分泌來改變動物的血鈣水平。在血鈣調(diào)節(jié)系統(tǒng)中PTH 受體三級結構的改變會導致G-α蛋白復合物依附在細胞中，并使鳥苷二磷酸（guanosine diphosphate,GDP）分子轉變成鎂-三磷酸鳥苷（Mg-guanosine tri?phosphate, Mg-GTP）分子；與此同時，G-α蛋白復合物會轉移PTH 受體，形成腺苷酸環(huán)化酶（adenylate cy?clase, AC），使鎂-腺苷三磷酸（Mg-adenosine triphos?phate, Mg-ATP）轉換為環(huán)腺苷酸（cyclic adenosine monophosaphate, cAMP）；cAMP 則采用激活激酶和啟動其他酶的方式來共同調(diào)控血鈣含量使其恢復至正常范圍。可見，如果攝入的Mg2+不足，動物體內(nèi)Mg-GTP和Mg-ATP水平就會下降而誘發(fā)低鎂血癥，機體調(diào)節(jié)鈣的能力減弱，最終引起動物血鈣濃度降低。

筆者假設，在低DCAD 條件下提高Mg 水平能促進PTH 分泌，增強機體組織對PTH 的敏感性，協(xié)同促進cAMP 生成，降低低血鈣的發(fā)生率。據(jù)此，在已完成低DCAD 對血鈣穩(wěn)恒調(diào)控[7]、血鈣調(diào)控因子濃度[8]、瘤胃發(fā)酵參數(shù)[9-10]的影響研究后，本試驗圍繞低DCAD與鎂的協(xié)同作用，研究兩者對血鈣及其相關調(diào)節(jié)因子含量的影響，為防治低血鈣提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗設計與飼養(yǎng)管理

試驗采用交叉試驗設計，按年齡、體重相一致的原則，將6只黔北麻羊雌羊分為2組：對照組、處理組，每組3 個重復，每個重復1 只羊。對照組飼喂基礎飼糧，DCAD值設定為100 mmol/kg（干物質(zhì)基礎）。試驗組在基礎飼糧中添加陰離子鹽（MgCl2·6H2O, 45 g/d）和鎂（MgO, 10 g/d），DCAD值設定為-100 mmol/kg（干物質(zhì)基礎）。兩組飼糧DCAD 的預設值與實測值稍有偏差，實測值分別為：75、-111 mmol/kg（干物質(zhì)基礎）。試驗分2個階段，共持續(xù)30 d。其中一階段15 d，包括12 d預試期和3 d采樣期。前一階段結束后，對照組和試驗組山羊交換飼糧投喂。試驗羊進行統(tǒng)一單籠飼養(yǎng)管理，羊舍自然通風，每天9:00和18:00人工定時投喂，自由采食和飲水。山羊試驗飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。

表1 山羊飼糧組成及營養(yǎng)水平（干物質(zhì)基礎）

1.2 檢測指標

1.2.1 飼糧營養(yǎng)成分

每天采集試羊飼糧樣品，待試驗期結束后粉碎混勻樣品，制備成分析試樣檢測其常規(guī)養(yǎng)分含量。采用內(nèi)源性指示劑法測定消化率，在采樣期連續(xù)收集每只羊3 d的糞便樣品，取20%的樣品加入10% HCl固氮，65 ℃烘干至恒重，測定養(yǎng)分消化率。其中飼糧和糞樣的粗蛋白質(zhì)（CP）含量采用凱氏定氮法（GB/T 6432—1994）測定；中性洗滌纖維（NDF）、酸性洗滌纖維（ADF）含量采用Van Soest 纖維素分析法[11]檢測；粗灰分（Ash）含量通過高溫灼燒法（GB/T 6438—2007）測定；通過內(nèi)源指示劑法（GB/T 23742—2009）測定酸不溶灰分（AIA）含量來計算養(yǎng)分消化率。Na、K、Mg的測定選用原子吸收法（熱電-3500，美國），Cl、S分別采用AgNO3滴定法（GB/T6439—1992）、Mg(NO3)2法（GB/T 17776—1999）測定。采用Riond[12]提出的公式計算DCAD，計算公式如下：

DCAD=Na（%）/0.002 3+K（%）/0.003 9-Cl（%）/0.003 55-S（%）/0.001 6

1.2.2 尿液pH

大量研究表明，降低DCAD必然會顯著降低尿液pH。因此，為減輕工作量，試驗只在第一階段試驗期內(nèi)（1～15 d）每天測定2組試羊尿液pH，記錄其變化情況，作為尿液pH 隨低DCAD 的變化而變化的情況。檢測方法如下：當試羊排尿時，用pH精密試紙（pH范圍為5.0～9.0，上海試劑三廠）立即蘸取尿液，與標準比色板比對測定。

1.2.3 血液生化指標

用真空抗凝采血管對試羊頸靜脈采血10 mL，4 000 r/min離心15 min（80-2 型離心沉淀機，江蘇中大儀器科技有限公司），分離并取上清血漿，用于測定血鈣生化指標。血鈣生化指標包括Ca2+、Mg2+、甲狀旁腺素（PTH）、1,25二羥維生素D3[1,25-(OH)2VD3]，檢測試劑盒購自南京建成生物公司。維生素D 受體（vita?min D receptor, VDR）、鈣結合蛋白（calcium-binding protein-D9k, CaBP-D9k）、細胞膜鈣泵（plasma mem?brane Ca-ATPase 1b, PMCA1b）試劑盒購自上海藍基生物有限公司。

1.2.4 瘤胃發(fā)酵參數(shù)

在試驗期每階段第15 d 晨飼前，經(jīng)試羊口腔用胃管式瘤胃液采集器抽取50 mL 瘤胃液，立即測定pH，然后經(jīng)4 層紗布過濾，3 000 r/min 離心15 min（80-2型離心沉淀機，江蘇中大儀器科技有限公司），分裝上清液，測定瘤胃緩沖力和瘤胃發(fā)酵參數(shù)：氨態(tài)氮濃度（NH3-N）、纖維素酶活性、揮發(fā)性脂肪酸（VFA）。pH 用便攜式pH 計（梅特勒-托利多儀器FG2-ELK，上海）測定；NH3-N濃度參照馮宗慈等[13]的方法進行測定；纖維素酶活性測定方法按照霍鮮鮮等[14-15]的方法測定；VFA指標參考相關文獻[16-18]用氣相色譜儀（日本島津GC-9A）測定。瘤胃緩沖能力（BC）的測定參照Tucker 等[19]提出的緩沖力指數(shù)法：取10 mL 瘤胃液用0.1 mol/L HCl 滴定，待pH 降至5，根據(jù)耗酸量計算緩沖容量。計算公式為：BC(mL)=0.1 mol/L的HCl(mL)×103/20 (mL)

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

原始數(shù)據(jù)采用Excel 2010 進行初整理，再使用SAS 9.4 統(tǒng)計處理軟件對數(shù)據(jù)進行分析，試驗數(shù)據(jù)用“平均值±標準差（Mean±SD）”表示，P<0.05 表明各組間存在差異性顯著。

2 結果與分析

2.1 尿液pH（見圖1）

如圖1A 所示，兩組山羊尿液pH 在試驗開始前3 d 基本一致，隨著飼喂時間的延長，試驗組山羊尿液pH 顯著降低（P<0.05）。在第一階段試驗期內(nèi)（1～15 d），試驗組山羊尿液pH 平均值顯著低于對照組（P<0.05），見圖1B。

圖1 尿液pH

2.2 養(yǎng)分消化率（見表2）

表2 低DCAD補Mg對山羊養(yǎng)分消化率的影響（%）

由表2可知，與對照組相比，試驗組DM消化率顯著下降（P<0.05），CP、NDF、ADF、Ash消化率差異不顯著（P>0.05）。

2.3 血鈣生化指標（見表3）

如表3 所示，低DCAD 補Mg 可提高山羊血鈣、血鎂及其代謝因子活力，試驗組血漿Ca2+、Mg2+、1,25-(OH)2VD3、PMCA1b 水平均顯著高于對照組（P<0.05）。其余指標差異不顯著（P>0.05）。

表3 低DCAD補Mg對山羊血Ca及其代謝因子的影響

2.4 瘤胃發(fā)酵參數(shù)（見表4）

由表4 可知，兩組山羊瘤胃液pH、NH3-N 濃度無顯著差異（P>0.05）。對于瘤胃緩沖能力，試驗組顯著高于對照組36.78%（P<0.05）。試驗組纖維二糖酶的活性顯著升高（P<0.05）；微晶纖維素酶、羧甲基纖維素酶、木聚糖酶活性差異并不顯著（P>0.05）。兩組山羊瘤胃乙酸、丙酸、丁酸、A/P、TVFA的測定結果接近，無顯著差異（P>0.05）。

表4 低DCAD補Mg對山羊瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響

3 討論

3.1 低飼糧陰陽離子差補鎂對山羊尿液pH的影響

尿液pH 是用來評價動物體液酸堿平衡的指標，通過監(jiān)控尿液pH的動態(tài)變化可反映出體內(nèi)酸堿平衡狀態(tài)的維持情況。依據(jù)強離子差理論[20]，Mg2+在機體酸堿平衡調(diào)節(jié)的過程中發(fā)揮著重要作用，影響著體內(nèi)的礦物質(zhì)代謝。研究表明，飼糧中添加MgO 可增加Mg2+水平，使動物的尿液pH升高，但增幅不明顯[21-22]，Mg 并不是影響機體酸堿平衡的最主要因素[23]。這可能是由于反芻動物消化道吸收并釋放陽離子至血液的過程中，相比較而言，Na+、K+的吸收效率大于Mg2+，對尿液pH的影響也較大?？梢姡驹囼炛械哪蛞簆H主要由DCAD 水平?jīng)Q定。研究指出，DCAD 和尿液的pH之間存在很強的關聯(lián)性，DCAD值的降低會引起尿液pH 下降[24-25]。本試驗結果顯示，與對照組相比，試驗組山羊尿液pH顯著降低（P<0.05）。這得到前人研究結果的支持[26]?？傮w而言，隨著DCAD水平的降低，尿液pH隨之降低。

3.2 低飼糧陰陽離子差補鎂對山羊血鈣生化指標的影響

動物體內(nèi)血鈣穩(wěn)恒主要依靠骨鈣動員、腎重吸收鈣和胃腸道鈣吸收來調(diào)節(jié)。骨鈣動員通過持續(xù)分泌PTH 來刺激成骨細胞釋放破骨細胞激活因子和前列腺素來活躍破骨細胞促進礦化的骨質(zhì)溶解入血；PTH可上調(diào)主細胞上TRPV5、NCX1、CaBP-D28k 表達水平，1,25-(OH)2VD3協(xié)同上調(diào)CaBP-D28k表達量，來共同加強腎臟重吸收鈣的能力[27]；胃腸道對鈣的吸收主要受1,25-(OH)2VD3與VDR 表達水平來共同影響，而PTH可通過激活1-α羥化酶的方式來促進25-羥基維生素D二次羥化變成1,25-(OH)VD3，最終使食物混合物中的鈣進入血液中被吸收。

Zhang 等[28]指出，血漿鎂不足時會引發(fā)一系列的生理問題，包括使骨鹽的沉積結晶作用加重，生長板中骨鹽的含量升高，還會降低磷酸肌醇系統(tǒng)、cAMP的活性，迫使PTH 對骨和腎臟的影響減弱。Matsuzaki等[29]試驗發(fā)現(xiàn)，減少小鼠飼糧中鎂的水平會使維生素D相關代謝酶（1α-羥化酶）含量降低，腎臟中24-羥化酶的表達量會增加，最終引發(fā)1,25-(OH)2VD3的合成停滯。本試驗采用交叉試驗設計，消除了血鈣生化指標受山羊間個體差異所造成的影響，結果與對照組相比，試驗組血漿Mg2+水平顯著升高，提示Mg的吸收效率明顯提高。

在胃腸道對鈣的吸收過程中，進入小腸后的鈣需要TRPV6的作用來進入細胞，之后鈣與CaBP-D9k 結合轉運至細胞基底膜，最終受PMCA1b 和NCX1 的協(xié)同作用進入血液。與對照組相比，本試驗的試驗組血漿Ca2+、1,25-(OH)2VD3、PMCA1b水平均顯著提高。其原因可能是：①低DCAD和MgO都能夠促進PTH的分泌，有利于機體生成1,25-(OH)2VD3，最終來提高血鈣的水平；②Mg2+作為胃腸道鈣吸收因子能夠激活細胞膜上的酶，提升血漿PMCA1b水平，將Ca2+外排出胞入血，提高血Ca水平。依據(jù)本試驗研究結果，當血液中的鎂含量過低而引起動物低血鈣時，應該在飼糧中有穩(wěn)定的鎂源供應，若不適合可再通過降低飼糧DCAD水平的方式來防治低血鈣。

3.3 低飼糧陰陽離子差補鎂對山羊瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響

反芻動物瘤胃pH是反映瘤胃發(fā)酵活動正常與否的主要指標之一。飼糧結構和比例的改變、唾液中緩沖鹽的分泌量、NH3-N和VFA等發(fā)酵產(chǎn)物的含量等均會引起瘤胃液pH 的變化，如果變化幅度太大則有可能會降低微生物活性和數(shù)量，尤其是纖維素分解菌。

有關DCAD 水平對瘤胃pH 影響的結論存在差異，但pH都處于正常范圍。Apper-Bossard等[30]發(fā)現(xiàn)，DCAD 的增加不會對奶牛瘤胃pH 造成顯著影響。然而隨著DCAD 水平的降低，瘤胃pH 越小，水牛飼喂MC（中陽離子）和HC（高陽離子）飼糧比飼喂A（陰離子）和LC（低陽離子）飼糧的瘤胃pH 要高[31]。Martins等[32]發(fā)現(xiàn)，提高泌乳奶牛DCAD會使瘤胃液的pH線性增加，Iwaniuk 等[33]也得出類似結論。本試驗中，添加陰離子鹽和MgO 不影響山羊瘤胃液的pH，可能是緩沖劑MgO 改善了瘤胃的內(nèi)環(huán)境狀態(tài)，穩(wěn)定了瘤胃液pH，具體原因還需要進行更深入的研究。

瘤胃緩沖體系是反芻動物特有的穩(wěn)定調(diào)控系統(tǒng)，在維持酸堿平衡及穩(wěn)定瘤胃微生態(tài)環(huán)境方面發(fā)揮著重要的作用，常用瘤胃液緩沖力指標來衡量。瘤胃液緩沖力可以維持瘤胃pH 的穩(wěn)定，可以防止反芻動物酸中毒和保障瘤胃健康與微生物的活性，NH3-N濃度和DCAD 水平的改變均會對瘤胃液緩沖力造成影響。MgO可以改善瘤胃溶液的酸堿緩沖能力，以此來調(diào)控瘤胃pH提高飼料的消化和細菌蛋白質(zhì)的合成能力。本試驗結果顯示，試驗組的瘤胃緩沖能力顯著提高，猜測是由于添加MgO增加瘤胃內(nèi)緩沖體系的緩沖容量效果比添加陰離子鹽的作用效果要更強。

NH3-N是飼糧蛋白質(zhì)被瘤胃微生物降解的產(chǎn)物，同時也是瘤胃微生物合成菌體蛋白的底物[34]。NH3-N濃度受飼糧中氨氮的含量、瘤胃緩沖能力等多種因素的影響。Vagnoni 等[35]研究表明，添加陰離子鹽可以提高瘤胃內(nèi)NH3-N 濃度，原因可能是飼糧中的NPN含量較高。Sharif等[36]研究發(fā)現(xiàn)，高DCAD飼糧可以提高瘤胃NH3-N 濃度。飼糧添加陰離子鹽降低DCAD的酸化效果對蛋白質(zhì)在瘤胃內(nèi)的降解作用沒有顯著影響，不會影響NH3-N濃度的變化[37-38]。本試驗中，兩組NH3-N 濃度無顯著差異，說明在瘤胃pH 變化不顯著時，MgO的添加有助于改善瘤胃液的緩沖能力。

反芻動物消化吸收飼糧中纖維物質(zhì)主要與瘤胃微生物分泌的纖維素酶（羧甲基纖維素酶、微晶纖維素酶、纖維二糖酶及木聚糖酶）有關[39]。纖維分解菌分泌的多酶復合體是降解纖維素的主要物質(zhì)，因此纖維素酶的活性常用來衡量瘤胃微生物降解飼糧纖維素的能力。Wang 等[40]研究發(fā)現(xiàn)，隨著DCAD 的提高，瘤胃內(nèi)纖維素分解菌的數(shù)量顯著增加。曹維維[41]指出，瘤胃pH 與飼糧DCAD 水平呈正相關，DCAD 水平的升高會使瘤胃pH提高而影響著瘤胃的內(nèi)環(huán)境，瘤胃液中纖維分解菌則會生長得更好。相反，飼糧中添加陰離子鹽過多會抑制纖維分解菌的生長。本試驗中與對照組相比，試驗組的羧甲基纖維素酶活性、纖維二糖酶活性、木聚糖酶活性均有所升高，但微晶纖維素酶活性沒有明顯變化。這可能是因為：①反芻動物瘤胃液本身具備一定的緩沖能力，可以降低陰離子鹽對瘤胃pH所帶來的消極影響；②少量的MgO也能影響瘤胃內(nèi)環(huán)境狀態(tài)，促進瘤胃內(nèi)纖維分解菌的增長，提高纖維素酶活性，瘤胃對纖維物質(zhì)的降解能力增強。

反芻動物瘤胃黏膜內(nèi)的豐富血管和上皮細胞間的許多裂隙能夠供給瘤胃來吸收養(yǎng)分，瘤胃微生物可將碳水化合物分解成乙酸、丙酸及丁酸等VFA。VFA則為反芻動物提供自身所需要的能量，它的濃度及產(chǎn)量影響著養(yǎng)分的消化吸收、利用以及反芻動物生產(chǎn)性能的發(fā)揮。Catterton 等[42]研究表明，飼糧添加陽離子（Na+和K+）來提高DCAD不會影響瘤胃pH或TVFA濃度。添加陰離子鹽也不會對VFA（乙酸、丙酸、丁酸、A/P、TVFA）產(chǎn)生顯著影響[38,43]。以上研究結果表明，DCAD 的改變一般不會對VFA 相關指標造成顯著性影響，而MgO 主要是調(diào)整瘤胃液pH 來影響瘤胃溶液的酸堿緩沖能力，本試驗兩組之間瘤胃pH 無顯著差異，據(jù)此說明陰離子鹽和MgO的共同使用不會對VFA相關指標產(chǎn)生顯著性影響。

4 結論

在本試驗條件下，低DCAD 補Mg 可降低尿液pH，提高血鈣、鎂及其代謝因子濃度，對瘤胃發(fā)酵參數(shù)沒有負面影響，可提高瘤胃緩沖力和消化酶活性。