■李 祥 李 浩 潘春梅 何金環(huán) 索江華

（河南牧業(yè)經(jīng)濟學(xué)院食品與生物工程學(xué)院，河南鄭州 450046）

豆粕中含有胰蛋白酶抑制劑、植物凝集素、α-淀粉酶抑制因子和大豆抗原等抗?fàn)I養(yǎng)因子[1]，限制了豆粕在肉雞、斷奶仔豬等幼齡動物飼料中的大量使用，若用量較大，會導(dǎo)致消化不良或腹瀉等疾病的發(fā)生[2-4]。豆粕經(jīng)微生物固態(tài)發(fā)酵可有效消除抗?fàn)I養(yǎng)因子[5]，降解大豆抗原，釋放游離氨基酸及多肽等[6]。經(jīng)發(fā)酵產(chǎn)生的多肽不僅可提高豆粕的消化利用率，而且多肽具有吸收耗能低、吸收速率快、不易飽和等特點，使發(fā)酵豆粕的營養(yǎng)價值進一步提高[7]，常以多肽含量作為發(fā)酵豆粕評價的指標(biāo)[8-9]。目前乳酸菌類發(fā)酵豆粕應(yīng)用較多，如植物乳桿菌、嗜酸乳桿菌、德氏乳桿菌、鼠李糖乳桿菌和唾液乳桿菌等發(fā)酵豆粕[10-14]。丁酸梭菌作為動物腸道中的厭氧型有益菌，可與其他有益菌群協(xié)同共生[12，15-16]，可產(chǎn)生丁酸、維生素、氨基酸、酶等多種代謝產(chǎn)物及益生因子，抑制腸道有害菌，提高動物抗病力、免疫力，減少發(fā)病率，還可減少飼料中抗生素的使用，并已成為重要的抗生素替代品[17]。研究表明，丁酸梭菌在不同基質(zhì)中進行固態(tài)培養(yǎng)，豆粕是其最佳的培養(yǎng)基質(zhì)[18-19]，利用丁酸梭菌與植物乳桿菌固態(tài)混菌發(fā)酵豆粕已有報道[20-21]，但丁酸梭菌與嗜酸乳桿菌混合固態(tài)發(fā)酵豆粕研究較少。因此本研究采用響應(yīng)面分析法，以發(fā)酵豆粕多肽含量為指標(biāo)，對丁酸梭菌與嗜酸乳桿菌固態(tài)發(fā)酵豆粕的最佳工藝進行優(yōu)化，并為提高豆粕消化利用率、改善動物生產(chǎn)性能提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菌種丁酸梭菌、嗜酸乳桿菌，為本實驗室篩選保藏。豆粕購于鄭州某飼料企業(yè)，粉碎并過80 目篩備用，其他試劑均為分析純。

1.2 主要儀器與設(shè)備

722S型可見光分光光度計，上海菁華科技儀器有限公司；K9840 型半自動凱氏定氮儀，濟南海能儀器股份有限公司；H650型高速離心機，湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；SH220N型石墨消解儀，濟南海能儀器股份有限公司；DNP-9272型恒溫培養(yǎng)箱，上海鴻都電子科技有限公司；SW-CJ-50KBS 型雙人超凈工作臺，蘇州凈化設(shè)備有限公司；PHS-3C型pH計，海佑科儀器儀表有限公司。

1.3 培養(yǎng)基配制

1.3.1 RCM培養(yǎng)基

可溶性淀粉1.0 g/L、蛋白胨10.0 g/L、氯化鈉5.0 g/L、牛肉粉10.0 g/L、酵母粉3.0 g/L、L-半胱氨酸鹽酸0.5 g/L、葡萄糖5.0 g/L、乙酸鈉3.0 g/L、瓊脂0.5 g/L，pH 6.7～6.9，1×105Pa滅菌30 min。

1.3.2 MRS培養(yǎng)基

牛肉膏5.0 g/L、蛋白胨10.0 g/L、葡萄糖20.0 g/L、酵母浸出粉4.0 g/L、吐溫80 1 mL、磷酸氫二鉀2.0 g/L、檸檬酸三銨2.0 g/L、硫酸錳0.05 g/L、乙酸鈉5.0 g/L、硫酸鎂0.2 g/L、瓊脂15.0 g/L，pH 6.3～6.5，1×105Pa滅菌30 min。

1.3.3 發(fā)酵種子液

分別從MRS和RCM固體培養(yǎng)基中挑取一環(huán)接種至其相應(yīng)的液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)48 h。然后按1%的比例將其接種至液體培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)24 h，獲得種子液。

1.3.4 固體發(fā)酵培養(yǎng)基

豆粕45.0 g、麩皮5.0 g，滅菌水適量，自然pH。

1.3.5 發(fā)酵培養(yǎng)基將50 g豆粕裝入250 mL錐形瓶中，加適量的水混勻，121 ℃條件下滅菌20 min。水料比根據(jù)試驗設(shè)計而定[22]。

1.3.6 固態(tài)發(fā)酵方法

將固體發(fā)酵培養(yǎng)基分裝于250 mL 三角瓶中，將培養(yǎng)好的發(fā)酵種子液按一定的接種量接種到含豆粕的固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中，攪拌均勻，靜置厭氧發(fā)酵[23]。

1.4 測定方法

凱氏定氮法測定發(fā)酵產(chǎn)物中酸溶性蛋白的含量，茚三酮顯色法測定發(fā)酵產(chǎn)物中游離氨基酸的含量，多肽（%）=酸溶性蛋白（%）-游離氨基酸（%）[24]。

1.5 試驗方法

1.5.1 單因素試驗設(shè)計

1.5.1.1 丁酸梭菌與嗜酸乳桿菌接種比例對發(fā)酵多肽含量的影響

接種量為15%，水料比為1∶1，培養(yǎng)溫度為37 ℃，發(fā)酵時長為48 h，研究丁酸梭菌和嗜酸乳桿菌不同接種比例（1∶1，1∶2，2∶1，2∶3，3∶2）對發(fā)酵多肽含量的影響，設(shè)3次平行試驗。

1.5.1.2 發(fā)酵溫度對發(fā)酵多肽含量的影響

接種量為15%，丁酸梭菌和嗜酸乳桿菌接種比例為1∶1，水料比為1∶1，發(fā)酵時長為48 h，研究發(fā)酵溫度（30、33、35、37 ℃和40 ℃）對發(fā)酵豆粕多肽含量的影響，設(shè)3次平行試驗。

1.5.1.3 發(fā)酵培養(yǎng)基水料比對發(fā)酵多肽含量的影響

接種量為15%，丁酸梭菌和嗜酸乳桿菌接種比例為1∶1，發(fā)酵溫度為37 ℃，發(fā)酵時長為48 h，研究水料比（0.4∶1.0，0.6∶1.0，0.8∶1.0 和1.2∶1.0）對豆粕多肽含量的影響，設(shè)3次平行試驗。

1.5.1.4 發(fā)酵時間對發(fā)酵多肽含量的影響

接種量為15%，丁酸梭菌和嗜酸乳桿菌接種比例為1∶1，水料比為1∶1，發(fā)酵溫度為37 ℃，研究發(fā)酵時長（24、36、48、60 h 和72 h）對發(fā)酵多肽含量的影響，設(shè)3次平行試驗。

1.5.1.5 接種量對發(fā)酵多肽含量的影響

丁酸梭菌和嗜酸乳桿菌接種比例為1∶1，水料比為1∶1，培養(yǎng)溫度為37 ℃，發(fā)酵時長為48 h，研究接種量（6%、9%、12%、15%和18%）對發(fā)酵多肽含量的影響，設(shè)3次平行試驗。

1.5.2 響應(yīng)面法優(yōu)化丁酸梭菌和嗜酸乳桿菌發(fā)酵豆粕多肽的工藝條件

1.5.2.1 Plackett-Burman（PB）設(shè)計

PB設(shè)計是一種2水平的試驗設(shè)計方法，是通過最少量試驗次數(shù)挑選出對發(fā)酵多肽含量有顯著性影響的因素的試驗方法。本試驗選取單因素優(yōu)化試驗中對發(fā)酵多肽含量影響較大的5個因素來進行PB 試驗，每個因素取高、低2 個水平，以多肽含量為響應(yīng)值R，共進行12 次試驗，其中預(yù)留6 個空項作為虛擬變量進行誤差分析。對接種量、水料比、接種比例、發(fā)酵時長和發(fā)酵溫度5 個單因素進行PB 設(shè)計，篩選出對發(fā)酵多肽含量有顯著性影響的因素，其水平編碼表見表1。

表1 PB試驗設(shè)計因素水平

1.5.2.2 響應(yīng)面試驗優(yōu)化設(shè)計

根據(jù)Box-Behnken 試驗設(shè)計原理，通過PB 試驗后，篩選出3個影響最顯著的因素，分別為接種量、接種比例、水料比，以多肽含量為試驗指標(biāo)，設(shè)計3因素3 水平包括5 個中心點的17 次試驗，以優(yōu)化丁酸梭菌和嗜酸乳桿菌固態(tài)發(fā)酵豆粕多肽的條件，確定最佳發(fā)酵工藝，響應(yīng)面編碼及水平見表2。

表2 響應(yīng)面試驗因素水平和編碼

1.6 數(shù)據(jù)處理與分析

試驗數(shù)據(jù)經(jīng)3 次平行試驗，以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，經(jīng)Origin pro 2018 軟件作圖，Design-Expert 12軟件進行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗（見圖1，圖2）

圖1 接種比例、發(fā)酵溫度、水料比和發(fā)酵時長對發(fā)酵豆粕多肽含量的影響

由圖1A、1B 可見，接種比例和發(fā)酵溫度分別在1∶2～1∶1和30～37 ℃之間時，多肽含量隨接種比例和溫度增加而增大，在接種比例為1∶1 和發(fā)酵溫度為37 ℃時達到最大，多肽含量分別為10.33%和10.43%，隨著接種比例和發(fā)酵溫度的繼續(xù)增大，多肽含量出現(xiàn)下降趨勢。因此，選取丁酸梭菌與嗜酸乳桿菌的接種比例為1∶1 和發(fā)酵溫度為37 ℃作為豆粕發(fā)酵最佳條件。由圖1C、1D 可見，水料比和發(fā)酵時長分別在0.4∶1～0.8∶1和12～48 h之間時，多肽含量隨水料比和發(fā)酵時長增加而增大，在水料比為0.8∶1和發(fā)酵時長為48 h時達到最大，多肽含量分別為10.91%和10.21%，隨著水料比和發(fā)酵時長的繼續(xù)增大，多肽含量出現(xiàn)下降趨勢。為得到更好的發(fā)酵條件，選取最佳水料比為0.8∶1，最佳發(fā)酵時長為48 h。由圖2可見，丁酸梭菌和嗜酸乳桿菌接種比例為1∶1，水料比為1∶1，發(fā)酵溫度為37 ℃，發(fā)酵時長為48 h，當(dāng)接種量為6%～12%時，多肽含量隨著接種量增加而增大，在接種量12%時達到最大，15%和18%的接種量發(fā)酵豆粕后多肽含量有所下降，均為10.43%。因此，選取12%為最佳接種量。

圖2 不同接種量對發(fā)酵豆粕多肽含量的影響

2.2 PB試驗設(shè)計與結(jié)果

使用軟件Design-Expert 12，選用n=11的PB設(shè)計表，5個變量分別為接種量（A）、接種比例（B）、水料比（C）、發(fā)酵溫度（D）和發(fā)酵時長（E），預(yù)留6個虛擬選項作為誤差分析，設(shè)計出12組試驗，響應(yīng)值R為發(fā)酵多肽含量（%），結(jié)果如表3所示。

表3 PB試驗設(shè)計與結(jié)果

在表4各因素主效應(yīng)分析結(jié)果中，當(dāng)P<0.05時，說明該因素對多肽含量的影響為顯著，并且P越小越顯著。試驗結(jié)果顯示對多肽含量影響的顯著性的排序為B>A>C>D>E，所以最終選取接種比例(B)、接種量(A)和水料比(C)三個影響顯著的因素進行響應(yīng)面優(yōu)化試驗。

表4 各因素主效應(yīng)分析

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗結(jié)果與分析

2.3.1 響應(yīng)面優(yōu)化試驗因素分析結(jié)果

根據(jù)Box-Behnken 設(shè)計試驗原理，應(yīng)用Design-Expert 12 對接種量A、接種比例B 和水料比C 三個因素進行響應(yīng)面分析試驗，設(shè)計3 因素3 水平包括5 個中心點共17個試驗，結(jié)果如表5所示。

表5 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果

2.3.2 響應(yīng)面試驗結(jié)果的方差分析

利用Design-Expert 8.0.6 軟件對表5 試驗數(shù)據(jù)進行擬合分析，建立二次回歸模型：R=9.38+0.13A+0.15B+0.29C-0.09AB+0.19AC-0.32BC-1.37A2-0.76B2-1.28C2，并作方差分析。結(jié)果如表6 所示，回歸模型F值為187.38，差異極顯著（P<0.000 1），失擬項不顯著（P=0.089 2>0.05），因此說明該模型適合本試驗?；貧w方程決定系數(shù)R2=0.995 9，R2Adj=0.990 6說明該試驗與模型擬合程度很好，自變量與響應(yīng)值(多肽含量)之間線性關(guān)系顯著，可以用于該反應(yīng)的理論推測，表明99.59%的多肽含量的變化都可以被該模型解釋，符合預(yù)期方程。因此，該模型可以用于數(shù)據(jù)分析和多肽含量的預(yù)測。由表6可知，各因素對多肽含量影響順序為：水料比(C)>接種比例（B）>接種量(A)，其中一次項B、C因素、交互項BC以及2次項A2、B2、C2對響應(yīng)值多肽含量具有極顯著影響（P<0.01），交互項AC 對響應(yīng)值多肽含量影響顯著（P<0.05）。

表6 二次多項模型及各項的方差分析

2.3.3 各因素交互作用響應(yīng)面結(jié)果與分析

通過Design-Expert 12軟件獲得二次響應(yīng)面回歸模型，并分析和創(chuàng)建相應(yīng)的響應(yīng)面。利用回歸模型繪制的每兩種因素交互作用的3D響應(yīng)面和等高線圖如圖3～圖5所示。

利用響應(yīng)面3D圖可高效直觀地找到各參數(shù)之間的交互作用和最大響應(yīng)值，曲面越陡，顯示該因素對多肽含量的影響越顯著，曲面平緩則相反。等高線圖表示在同一橢圓形的區(qū)域內(nèi)含量是相同的，其中心含量最高，由中心向邊緣含量逐漸減少。橢圓形表示兩因素交互作用顯著，而圓形則表示兩因素交互作用不顯著。

圖3 中接種比例與接種量交互作用的等高線圖為圓形，表明它們的交互作用對多肽含量的影響不顯著。由圖4 的等高線圖可見，其橢圓較扁，表明水料比與接種量的交互作用對多肽含量的影響較顯著。由圖5 的等高線圖可見，其橢圓更扁更密集，表明水料比與接種量的交互作用對多肽含量的影響更顯著。由圖3響應(yīng)面3D圖可以看出，曲面較為平緩，接種比例與接種量的交互作用不顯著。由圖4 響應(yīng)面3D 圖可以看出，其3D 曲面坡度稍陡，水料比與接種量的交互作用對多肽含量的影響較顯著。由圖5 的響應(yīng)面圖可以看出，其3D曲面坡度更陡，水料比與接種比例的交互作用對多肽含量的影響更加顯著。當(dāng)接種比例固定不變時，多肽含量隨著水料比的提高而表現(xiàn)出先增多后減少的趨勢；同樣當(dāng)水料比固定時，多肽含量隨著接種比例的提高也表現(xiàn)出先增多后減少的趨勢。綜合上述分析，對發(fā)酵豆粕多肽含量影響的3個因素排列順序為水料比(C)>接種比例（B）>接種量(A)，與方差分析的結(jié)果一致。

圖3 接種量與接種比例交互作用響應(yīng)面與等高線圖

圖4 水料比與接種量交互作用的響應(yīng)面與等高線圖

圖5 水料比與接種比例交互作用的響應(yīng)面與等高線圖

2.4 驗證試驗

根據(jù)獲得的回歸擬合方程，利用Design-Expert 12軟件的Optimization 命令進行條件尋優(yōu)，結(jié)果得到最佳發(fā)酵條件為：A=12.16%、B=1.04、C=0.82。因此，丁酸梭菌與嗜酸乳桿菌發(fā)酵豆粕的最佳條件修正為接種量12.2%，丁酸梭菌與酸菌接種比例為1∶1，水料比為0.8。在該條件下多肽含量的理論預(yù)測值為9.40%，經(jīng)過3次平行試驗，測得實際發(fā)酵豆粕多肽含量平均值為9.64%，與預(yù)測值相差不大，說明該模型具有良好的擬合性，能較好地模擬和預(yù)測丁酸梭菌和嗜酸乳桿菌固態(tài)發(fā)酵豆粕的工藝條件。

3 討論

利用不同菌株對豆粕進行發(fā)酵，不僅可以降解豆粕中的抗?fàn)I養(yǎng)因子，而且發(fā)酵后產(chǎn)生有益的代謝物如小肽對培養(yǎng)的動物細胞還具有特殊的促進作用[25]。因此，提高豆粕發(fā)酵產(chǎn)肽率將為動物的生長發(fā)育提供更高的營養(yǎng)價值，其中發(fā)酵豆粕生產(chǎn)中菌株選擇及發(fā)酵工藝優(yōu)化尤其重要。丁酸梭菌作為一種芽孢桿菌，與乳酸菌的作用類似，是極具潛力的飼用益生菌，既能如食品一樣安全，針對腹瀉、腸炎等腸道疾病又能如藥物一樣有效[26]。因此，對丁酸梭菌與嗜酸乳桿菌混合固態(tài)發(fā)酵豆粕工藝進行優(yōu)化，不僅可提高豆粕的小肽含量，而且還可獲得更多有益菌群的活菌數(shù)和代謝產(chǎn)物等。

陳潔梅等[22]以芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵豆粕和以多肽含量為指標(biāo)，采用單因素試驗和Box-Behnken響應(yīng)面分析法對豆粕固態(tài)發(fā)酵工藝條件進行優(yōu)化研究，其發(fā)酵豆粕的多肽含量為347.7 mg/g。吝常華等[23]應(yīng)用正交法對解淀粉芽孢桿菌、植物乳桿菌、釀酒酵母混菌固態(tài)發(fā)酵豆粕工藝進行優(yōu)化，豆粕經(jīng)混菌發(fā)酵后，小肽含量較未發(fā)酵組分別提高了8.68倍，為10.42%。錢森和等[8]應(yīng)用響應(yīng)面法以發(fā)酵產(chǎn)物可溶性蛋白（包括游離氨基酸和小肽）作為測定指標(biāo)，選用枯草芽孢桿菌、啤酒酵母和黑曲霉組合對豆粕進行發(fā)酵工藝優(yōu)化，結(jié)果表明，枯草芽孢桿菌和黑曲霉混合菌固態(tài)發(fā)酵豆粕，大豆肽含量最高為8.73%。王哲奇等[24]應(yīng)用Box-Behnken響應(yīng)面法對枯草芽孢桿菌和米曲霉混合發(fā)酵豆粕生產(chǎn)大豆多肽的條件進行了初步優(yōu)化，其發(fā)酵大豆多肽的理論含量為23.91%。Su等[20]報道以乳酸桿菌和丁酸梭菌為菌種固態(tài)發(fā)酵豆粕的最佳工藝參數(shù)，結(jié)果表明，在初始含水量50%條件下，發(fā)酵2 d提高了發(fā)酵豆粕中細菌的活菌數(shù)、乳酸含量和豆粕的降解率。

本試驗測得發(fā)酵豆粕多肽含量為9.64%，與吝常華等[23]、錢森和等[8]及王哲奇等[24]研究結(jié)果基本一致，但由于發(fā)酵菌株選擇不同，發(fā)酵工藝各不相同，前人研究發(fā)酵豆粕采用枯草芽孢桿菌與霉菌或酵母組合，因這些菌株的耗氧和產(chǎn)酶能力較強，因而豆粕降解為小肽效果較好。其中Su等[20]以乳酸桿菌和丁酸梭菌為菌種固態(tài)發(fā)酵豆粕，測定的指標(biāo)主要為活菌數(shù)、乳酸含量和豆粕的還原糖含量，小肽含量未見報道；陳潔梅等[22]和王哲奇等[24]研究結(jié)果也因菌株和發(fā)酵工藝不同差異較大。本試驗中丁酸梭菌是極其嚴格的厭氧菌，發(fā)酵生產(chǎn)的得菌率低，限制了它的廣泛應(yīng)用，因此本試驗應(yīng)用單因素試驗和響應(yīng)面分析法對丁酸梭菌和嗜酸乳桿菌混合發(fā)酵豆粕進行工藝優(yōu)化，不僅可提高豆粕小肽含量，提高豆粕的營養(yǎng)價值，還可調(diào)節(jié)腸道菌群平衡，抑制大腸桿菌等有害菌繁殖，保護腸道健康，減少疾病的發(fā)生，有助于減少飼料中抗生素的使用。

4 結(jié)論

本試驗首先對丁酸梭菌與嗜酸乳桿菌發(fā)酵豆粕中接種量、接種比例、水料比、發(fā)酵溫度和發(fā)酵時長5個因素進行單因素試驗，得到最佳發(fā)酵條件為丁酸梭菌和嗜酸乳桿菌接種比例為1∶1，水料比為0.8∶1，培養(yǎng)溫度為37 ℃，發(fā)酵時長為48 h，接種量為12%。以多肽含量為指標(biāo)進行PB 實驗，篩選得到對多肽含量影響最顯著的因素為接種量、接種比例和水料比。通過Box-Behnken 響應(yīng)面分析試驗，以多肽含量為響應(yīng)值，建立了二次多項回歸數(shù)學(xué)模型，通過統(tǒng)計學(xué)分析進行了顯著性檢驗，對各因素的交互作用進行分析，最終得到丁酸梭菌嗜酸乳桿菌固態(tài)發(fā)酵豆粕多肽的最佳發(fā)酵條件為：丁酸梭菌與嗜酸乳桿菌接種比例為1∶1，水料比為0.8∶1，接種量為12.2%，通過模型預(yù)測的最大發(fā)酵豆粕多肽含量為9.40%。在此發(fā)酵條件下驗證試驗的結(jié)果為9.64%，結(jié)果說明通過響應(yīng)面法能夠較好地優(yōu)化發(fā)酵工藝條件，并能預(yù)測實際發(fā)酵豆粕多肽含量，對于生產(chǎn)具有實踐指導(dǎo)意義。