■王 平 王 濤 胡驍飛 王全亮 彭 峰 楊小進(jìn) 尹清強(qiáng)*

（1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，河南鄭州 450046；2.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南鄭州 450002；3.河南廣安生物科技股份有限公司，河南鄭州 450001；4.河南省正陽種豬場，河南駐馬店 463600；5.洛陽歐科拜克生物技術(shù)股份有限公司，河南洛陽 471600）

黃曲霉毒素是由某些曲霉真菌產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物，具有極強(qiáng)的毒性、誘變性和強(qiáng)致癌性，是世界公認(rèn)的危害最大的霉菌毒素，其中黃曲霉毒素B1(AFB1)的毒性最強(qiáng)[1]。玉米赤霉烯酮(ZEA)是一種由鐮刀菌次級(jí)代謝產(chǎn)生的雌激素類霉菌毒素，對(duì)動(dòng)物和人類都會(huì)產(chǎn)生危害，能導(dǎo)致人或動(dòng)物的生殖系統(tǒng)紊亂[2]。AFB1 和ZEA 污染問題關(guān)系到飼料安全、動(dòng)物生產(chǎn)和食品安全，甚至還威脅到人類自身健康[3]。霉菌毒素對(duì)人類健康的危害主要是動(dòng)物采食了飼料中霉菌毒素后在體內(nèi)組織器官中殘留，人們長期食用含霉菌毒素超標(biāo)的畜產(chǎn)品后會(huì)引起中毒，甚至致癌。因此，不僅要解決飼料霉菌毒素污染問題同時(shí)還要減少霉菌毒素在動(dòng)物體內(nèi)和畜產(chǎn)品中的殘留問題。

飼料中霉菌毒素脫毒方式有物理法、化學(xué)法以及生物法。目前關(guān)于霉菌毒素脫毒劑的研究主要集中于脫毒劑緩解毒素對(duì)動(dòng)物生產(chǎn)性能和繁殖性能的影響，但是毒素還是會(huì)在動(dòng)物組織中沉積，尤其是肝臟[4-6]，這些沉積的毒素是否能夠完全消解和排出還有待研究。關(guān)于毒素在動(dòng)物的體內(nèi)消解及排出規(guī)律的研究較少。

本文通過測定不同時(shí)間內(nèi)AFB1 和ZEA 在肉雞不同組織器官內(nèi)含量變化，以觀察兩種毒素在體內(nèi)的代謝情況及消減規(guī)律。

1 材料與方法

1.1 材料

生物解毒劑：枯草芽孢桿菌、干酪乳桿菌、產(chǎn)朊假絲酵母在的飼糧中含量分別為：1×107、1×106、1×107CFU/g。

霉變玉米：市購，經(jīng)測定AFB1 含量為69 μg/kg，ZEA含量為60 μg/kg。

霉菌毒素的制備：取活化過的黃曲霉孢子，涂布于PDA 固體培養(yǎng)基，培養(yǎng)至孢子大量產(chǎn)生時(shí)收獲(約120 h)。在平板內(nèi)加入適量高壓滅菌的生理鹽水(含0.05%的Tween 80)，用高壓過的涂布棒將平板上的孢子緩慢刮下，形成孢子濃度約為1×108CFU/mL 的黃曲霉孢子懸液。取粉碎后的玉米80 g(過8 目篩)，裝入250 ml 錐形瓶內(nèi)，加水40 mL 攪拌均勻后，加棉塞高壓蒸汽滅菌20 min。待冷卻后接種上述配制成的黃曲霉孢子懸液2 mL，用高壓滅菌玻璃棒攪拌均勻后置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)，約7 d后收獲。放置室溫晾干，約5～6 d 后粉碎過20 目篩，避光保存。測定AFB1 的含量為2 547 μg/kg，ZEA 含量為5 μg/kg。ZEA純品：購于Sigma公司。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物及設(shè)計(jì)

選擇22 日齡健康且體重?zé)o差異的羅斯308 肉雞150只，分為3個(gè)處理組，每個(gè)處理組5個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)10只，飼養(yǎng)期20 d。在第21 d，2和3組換成基礎(chǔ)日糧飼喂7 d。試驗(yàn)設(shè)計(jì)與分組如下：

1 組：飼喂基礎(chǔ)日糧（基礎(chǔ)日糧中含AFB1 14.45 μg/kg、ZEA 58.58 μg/kg）；

2組：基礎(chǔ)日糧+50 μg/kg AFBl+500 μg/kg ZEA；

3 組：基礎(chǔ)日糧+50 μg/kg AFBl+500 μg/kg ZEA+生物解毒劑。

基礎(chǔ)日糧配方按照美國營養(yǎng)研究委員會(huì)NRC(1994)肉仔雞飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)配制。日糧配方及營養(yǎng)水平見表1。用霉變玉米、制備的霉菌毒素和ZEA 純品調(diào)整每組毒素含量。

表1 肉雞后期日糧的組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

1.3 血清、肝臟、胸肌、糞便中AFB1和ZEA含量測定及消減規(guī)律

在42 d屠宰，每組取3只肉雞的肝臟、胸肌、血清及糞便。隨后換成基礎(chǔ)日糧飼喂7 d。以42 d樣品作為兩種毒素在肉雞體內(nèi)代謝0 h的含量。在飼喂基礎(chǔ)日糧1、3、5 d及7 d 時(shí)分別從1、2、3組中屠宰3只雞，取血清、肝臟、胸肌以及糞便。按照德國拜發(fā)公司AFB1和ZEA試劑盒步驟進(jìn)行毒素含量測定。

1.4 糞便中AFB1和ZEA凈排出總量測定

每組取3只雞，采用全收糞法分別收集飼喂基礎(chǔ)日糧1、3、5 d及7 d時(shí)的排泄物。60～65 ℃烘干，自然狀態(tài)下充分回潮24 h，稱重記錄每天總糞重，粉碎后過40 目篩備用。按照德國拜發(fā)公司AFB1 和ZEA 試劑盒步驟進(jìn)行毒素含量測定。

AFB1（ZEA）凈排出總量（μg）=每克糞便中毒素含量（μg/g）×每天總糞重（g）

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)Excel初步整理后，采用Design-Expert 8.0.6軟件對(duì)響應(yīng)面數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。采用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)各組數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析和Duncan’s法多重比較，差異顯著用P<0.05 表示，所有結(jié)果均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 AFB1和ZEA在肉雞體內(nèi)的消解規(guī)律(見表2、表3)

表2 不同時(shí)間AFB1在肉雞體內(nèi)代謝的情況(μg/kg)

表3 不同時(shí)間ZEA在肉雞體內(nèi)代謝的情況(μg/kg)

由表2可知，組織中AFB1含量為：肝臟>胸肌>血清。在0 d時(shí)，2組和3組肝臟、胸肌和糞便中AFB1含量差異不顯著(P>0.05)，但顯著高于基礎(chǔ)日糧組(P<0.05)。在7 d 時(shí)，2 組胸肌、血清和糞便中AFB1 含量顯著高于3 組和基礎(chǔ)日糧組(P<0.05)。在排毒第7 d時(shí)肝臟、胸肌、血清和糞便中AFB1 含量顯著低于第0 d 時(shí)(P<0.05)。在第7 d 時(shí)，基礎(chǔ)日糧組和3 組血清中未檢出AFB1 含量。在第3 d 時(shí)，2 組和3 組糞便中AFB1 含量顯著高于其他時(shí)間(P<0.05)。在0～7 d 內(nèi)，2 組和3 組肝臟中AFB1 含量差異不顯著(P>0.05)，并顯著高于基礎(chǔ)日糧組(P<0.05)。

由表3 可知，ZEA 主要存在于糞便，其次肝臟和血清。在0～7 d時(shí)，肝臟、血清和糞便中ZEA含量為：2組>3組>1組(P<0.05)。各組胸肌中ZEA殘留量未檢出。1組血清中ZEA在0、1、7 d檢不出。2組和3組血清中ZEA 含量皆以第7 d 最低(P<0.05)。1 組糞便中ZEA含量在7 d內(nèi)無顯著變化(P>0.05)。2組和3組糞便中ZEA含量在第3 d時(shí)最高(P<0.05)。

2.2 AFB1和ZEA在肉雞體內(nèi)的排出規(guī)律(見表4、表5)

表4 不同時(shí)間AFB1的凈排出的總量(μg)

表5 不同時(shí)間ZEA的凈排出的總量(μg)

由表4可知，在消解試驗(yàn)階段的1、3、5 d以及7 d內(nèi)，2組和3組的毒素凈排出量始終顯著高于1組(P<0.05)，其中3組排出量從第5 d起顯著低于2組(P<0.05)。在第3 d時(shí)，2組和3組AFB1凈排出總量最高(P<0.05)。

由表5可知，在消解試驗(yàn)階段的1、3、5 d以及7 d內(nèi)，每組ZEA排出量為：2組>3組>1組(P<0.05)。在第3 d時(shí)3個(gè)組的ZEA凈排出總量最高(P<0.05)。

3 討論

AFB1在畜禽的肝臟、血液、肌肉及動(dòng)物產(chǎn)品中有檢測到毒素的殘留，甚至能夠通過食物對(duì)人類的健康產(chǎn)生威脅[7-8]。動(dòng)物攝入含AFB1的飼料后，十二指腸可以吸收50%，之后主要在肝臟蓄積和代謝[9]。ZEA同樣由胃腸道吸收后進(jìn)入肝腸循環(huán)，從而滯留時(shí)間延長，在家禽體內(nèi)肝臟殘留最多[10-11]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示AFB1主要存在于肝臟、肌肉和血清，通過糞便排出體外。ZEA不在肌肉中沉積，若飼糧中含有大量的ZEA，ZEA則存在于肝臟和血清，若飼糧中ZEA含量較少，ZEA則主要存在于肝臟，大量ZEA通過糞便排出體外。添加生物脫毒劑能夠減少體內(nèi)毒素的沉積，但不能消除毒素沉積。宋文靜等[12]研究發(fā)現(xiàn)動(dòng)物攝食低劑量AFB1后，肝臟和肌肉中都有殘留，其中肝臟殘留量較肌肉中多，而添加的復(fù)合益生菌均可有效降低組織中的毒素殘留，與本試驗(yàn)結(jié)果一致。崔曉旭[13]在肉雞飼喂含AFB1 5 mg/kg的飼料28 d后，飼喂正常飼糧，發(fā)現(xiàn)肝臟和肌肉中毒素殘留的消除時(shí)間至少在11～18 d達(dá)到定量限。而本試驗(yàn)在飼喂含AFB1 50 μg/kg日糧20 d后飼喂基礎(chǔ)日糧7 d后發(fā)現(xiàn)基礎(chǔ)日糧組和添加生物脫毒劑組血清中的毒素完全消除，而肝臟、肌肉和糞便中仍有毒素存在，雖然隨著時(shí)間延長，毒素含量降低，但并不能完全消除。王定發(fā)[5]發(fā)現(xiàn)在青年母豬日糧中添加2 mg/kg ZEA飼喂21 d后母豬肌肉中ZEA殘留量為0.031 μg/kg。而本試驗(yàn)在飼喂含ZEA 500 μg/kg日糧20 d后肉雞肌肉中ZEA無檢出，與前人研究結(jié)果不一致，這可能與日糧中毒素含量和畜種有關(guān)。目前還未見有關(guān)于ZEA在體內(nèi)消解的報(bào)道。本試驗(yàn)在飼喂含ZEA 500 μg/kg日糧20 d后飼喂基礎(chǔ)日糧7 d后發(fā)現(xiàn)基礎(chǔ)日糧組血清中ZEA完全消除，而肝臟和糞便中仍有毒素存在。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)大量的AFB1和ZEA通過糞便排出體外，污染環(huán)境。添加霉菌毒素生物降解劑減少了糞便中毒素含量和毒素凈排出量，這說明霉菌毒素生物降解劑是通過體內(nèi)分解毒素來降低毒素的排出，從而減少環(huán)境污染。

本試驗(yàn)通過測定血清、糞便、胸肌、肝臟中兩種霉菌毒素含量的含量發(fā)現(xiàn)，當(dāng)飼料中霉菌毒素含量較高時(shí)，在組織和器官中的殘留量也會(huì)提高，但霉菌毒素生物解毒劑的添加可以減少霉菌毒素的殘留量和排放量，歸因于益生菌對(duì)霉菌毒素的降解。另外，隨著排毒時(shí)間的延長，霉菌毒素的殘留量和排放量逐漸降低，但一周時(shí)間不足以排出長期蓄積的霉菌毒素。如何能夠消除體內(nèi)沉積的毒素還有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

不同毒素在肝臟、肌肉、血清、糞便中殘留程度及消解程度不同。日糧中AFB1和ZEA含量越高，組織、器官及排泄物中毒素含量就越高，并且7 d 內(nèi)AFB1和ZEA在組織、器官內(nèi)殘留無法消除。添加霉菌毒素生物解毒劑可有效降低組織、器官及排泄物中AFB1和ZEA含量，為消除霉菌毒素危害奠定基礎(chǔ)。