趙亞松，呂遠，李闖，張志濤，陳浩暘*

Peutz-Jeghers 綜合征(Peutz-Jeghers syndrome，PJS)又稱為家族性黏膜皮膚色素沉著胃腸道息肉病，簡稱為黑斑息肉綜合征，是一種罕見的常染色體顯性遺傳病，其發(fā)生率在新生兒中約為1/50 000-1/200 000[1-2]。PJS主要的臨床表現(xiàn)為口唇、黏膜等皮膚特定部位散在的色素沉著斑及多發(fā)性胃腸道息肉，部分PJS患者也存在有膽囊、支氣管、膀胱等腸道外位置的息肉[3-4]。PJS患者經(jīng)常并發(fā)多種相關(guān)疾病如腸道出血、腸套疊及腸梗阻等，同時罹患多種腸道及腸外腫瘤的風(fēng)險較正常人也大大增加，有研究顯示其中最常見的腫瘤是結(jié)直腸癌，其次為乳腺癌、小腸癌、胃癌及胰腺癌等[5]。PJS主要由STK11基因突變引起，該基因定位于染色體19p13.3，由10個外顯子組成，編碼區(qū)全長為10kb，編碼絲氨酸/蘇氨酸基因家族成員，其生物學(xué)功能十分復(fù)雜。

本研究對一臨床表現(xiàn)為PJS的家系患者進行遺傳學(xué)檢測，明確其致病基因位點，并根據(jù)結(jié)果對先證者妻子進行羊水基因檢測，為其后續(xù)的診療提供依據(jù)。

1 對象與方法

1.1 研究對象

先證者就診于中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院婦產(chǎn)科，臨床診斷為PJS患者，先證者發(fā)病年齡為12歲，臨床特征為面部、嘴唇、指趾散在黑色素沉著斑點，腸鏡檢查發(fā)現(xiàn)多發(fā)大腸及小腸息肉并經(jīng)手術(shù)切除(見圖1)。詢問家族史發(fā)現(xiàn)其父親也有相似癥狀，但已經(jīng)去世。先證者妻子已妊娠，就診于本院產(chǎn)科遺傳咨詢門診并進行羊水穿刺。本研究取得先證者及其家屬知情同意，并通過本院倫理委員會論證。

圖1 先證者面部、嘴唇散在黑色素沉著斑點

1.2 方法

1.2.1 全外顯子檢測及Sanger測序驗證 抽取先證者外周血2 mL并經(jīng)EDTA抗凝作為檢測樣本，使用DNA提取試劑盒(中國天根公司)提取外周血白細胞基因組DNA。將基因組DNA打斷片段化并制備文庫，使用高通量測序技術(shù)進行全外顯子檢測篩查可疑突變位點，并結(jié)合先證者臨床表型分析，挑選出與患者臨床特征相關(guān)的基因突變位點。針對可疑致病位點進行引物設(shè)計，并對相應(yīng)基因組DNA區(qū)域進行聚合酶鏈式反應(yīng)(Polymerase Chain Reaction，PCR)擴增，擴增結(jié)束后對產(chǎn)物進行純化定量，使用ABI3130xl測序儀進行Sanger測序驗證。檢索ClinVar、HGMD、OMIM、Pubmed等數(shù)據(jù)判斷該基因突變位點是否為已知致病性變異，并通過ACMG遺傳變異分類標(biāo)準與指南[6]對該突變位點進行分類。

1.2.2 孕中期羊水檢測及Sanger測序 于先證者妻子孕中期行羊膜腔穿刺抽取羊水20 mL作為檢測樣本，提取羊水中胎兒游離DNA并進行純化。針對與先證者一致的基因突變位點設(shè)計引物，使用PCR核酸擴增儀對目的基因片段進行擴增，并將獲得目的基因片段序列與人類正?；蚪M序列進行比對，明確胎兒是否攜帶有與先證者一致的基因突變位點。

2 結(jié)果

2.1 先證者全外顯子組測序結(jié)果

結(jié)合先證者臨床表型分析，先證者攜帶 STK11 基因 c.95delC (p.Thr32fs)雜合突變(見圖2)，為移碼突變。通過比對該位點突變在 ClinVar 數(shù)據(jù)庫有收錄，在 HGMD 數(shù)據(jù)庫中記錄為致病性變異；在 ExAC 數(shù)據(jù)庫、gnomAD 數(shù)據(jù)庫等東亞正常對照人群中無記錄。根據(jù) ACMG 致病變異分級標(biāo)準[6]，判斷該位點為致病性。

圖2 先證者全外顯子測序結(jié)果

2.2 先證者 Sanger測序結(jié)果

提示與高通量測序結(jié)果一致，進一步明確先證者攜帶STK11 基因 c.95delC (p.Thr32fs)雜合突變(見圖3)。

圖3 先證者Sanger測序結(jié)果

2.3 先證者妻子羊水檢測結(jié)果

先證者妻子羊水檢測結(jié)果提示胎兒攜帶有與先證者一致的基因突變位點即STK11 基因 c.95delC (p.Thr32fs)雜合突變(見圖4)。

圖4 先證者妻子羊水檢測結(jié)果

3 討論

PJS作為罕見的遺傳性疾病，其診斷主要依賴于患者的臨床特征及遺傳學(xué)檢測。為了更好地在臨床上識別出PJS患者，臨床診斷標(biāo)準如下，當(dāng)患者符合下列任一條件時即可被臨床確診為PJS：① 經(jīng)病理診斷明確的2個或2個以上的PJ息肉；② 任意數(shù)目的PJ息肉結(jié)合PJS家族病史；③ 典型的皮膚黏膜色素沉著斑結(jié)合PJS家族病史；④ 任意數(shù)目的PJ息肉結(jié)合典型的皮膚黏膜色素沉著斑[7-8]。該家系先證者臨床特征為面部、嘴唇、指趾散在黑色素沉著斑點，腸鏡檢查發(fā)現(xiàn)多發(fā)小腸息肉，并且先證者父親亦有相似癥狀，符合PJS的臨床診斷?；谀壳暗幕驒z測水平，STK11基因突變被認為是PJS的主要致病原因，然而其基因變異類型是否與PJS的臨床異質(zhì)性相關(guān)尚無明確解釋，Amos等[9]經(jīng)研究認為STK11基因無義突變患者可能相較于其他變異類型患者臨床癥狀遲發(fā)。Mehenni等[10]發(fā)現(xiàn)基因突變發(fā)生于STK11第6個外顯子可能導(dǎo)致PJS患者具有更高的癌癥發(fā)生率。而Hearle等[11]基于419例PJS患者的臨床研究表明不同的基因變異類型并不導(dǎo)致PJS患者具有更高的癌癥發(fā)生風(fēng)險，因此針對PJS的臨床型-基因型相關(guān)性仍有待進一步研究確認。

STK11基因生物學(xué)功能十分復(fù)雜。STK11可通過G1細胞阻滯、WAF1信號及p53介導(dǎo)的細胞裂解來調(diào)控細胞增殖[12-13]。并且在調(diào)節(jié)細胞極性、細胞增殖及能量平衡等方面也起著重要作用，STK11作為AMP活化蛋白激酶上游調(diào)節(jié)因子，可進一步作用于TSC及mTOR信號通路[14-15]。因此當(dāng)STK11蛋白失去功能時將導(dǎo)致息肉甚至癌癥的發(fā)生。

本研究中先證者經(jīng)臨床診斷為PJS，遺傳學(xué)檢測結(jié)果提示其攜帶STK11基因c.95delC (p.Thr32fs)雜合突變，為移碼突變，導(dǎo)致蛋白編碼在32位蘇氨酰胺處發(fā)生改變，并在新閱讀框的3位過早產(chǎn)生終止密碼子，導(dǎo)致產(chǎn)生截短蛋白，預(yù)測蛋白質(zhì)功能喪失，從而導(dǎo)致患者臨床表型的發(fā)生。同時經(jīng)Sanger測序驗證結(jié)果提示其胎兒攜帶與先證者相同的基因突變位點，為孕期的診療提供了證據(jù)。充分知情同意后，該家庭選擇終止妊娠，引產(chǎn)后胎兒皮膚未見任何色素沉著斑。該家系選擇再次妊娠，鑒于PJS為常染色體顯性傳染病，其后代患病率為50%，因此建議其可選擇輔助生殖并經(jīng)胚胎植入前遺傳學(xué)檢測選擇正常胚胎植入子宮從而獲得健康后代。或選擇經(jīng)正常方式妊娠，但應(yīng)于孕中期常規(guī)進行有創(chuàng)產(chǎn)前檢測如羊膜腔穿刺檢查或絨毛膜活檢明確胎兒是否攜帶有STK11基因c.95delC(p.Thr32fs)致病變異。

本研究通過臨床表型分析及遺傳學(xué)檢測明確了一PJS家系致病原因，為該家系的產(chǎn)前基因檢測及遺傳咨詢提供了依據(jù)，并進一步補充了表型譜與基因變異數(shù)據(jù)庫，加強了該病的表型與基因型的聯(lián)系。