張雅萌， 張惠媛， 阮世紅， 陳曉春， 甘雪琦， 于海洋

1.口腔疾病研究國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 國(guó)家口腔疾病臨床研究中心 四川大學(xué)華西口腔醫(yī)院，四川 成都（610041）；2.深圳市慢性病防治中心，廣東 深圳（518000）

抗菌肽（antimicrobial peptides，AMPs）是一種幾乎存在于所有多細(xì)胞生物體內(nèi)的小分子活性多肽?？咕氖窍忍烀庖叻磻?yīng)的重要組成部分，具有直接的抗菌活性和免疫調(diào)節(jié)作用［1］。在人類唾液和齦溝液（gingival crevicular fluid，GCF）中發(fā)現(xiàn)的抗菌肽主要包括組織蛋白酶抑制素和防御素，抗菌肽LL-37是迄今發(fā)現(xiàn)唯一人源性的組織蛋白酶抑制素家族成員［2］。人體內(nèi)的防御素根據(jù)分子結(jié)構(gòu)不同又可分為α防御素和β防御素。牙周炎是一種發(fā)生在牙周組織的破壞性炎癥疾?。?］。有研究表明抗菌肽人β 防御素-2（human beta defensins-2，HBD-2）基因組拷貝數(shù)低會(huì)增加患嚴(yán)重慢性牙周炎的風(fēng)險(xiǎn)［4］，唾液和齦溝液抗菌肽LL-37 水平與深袋牙和臨床附著喪失呈正相關(guān)［5］。抗菌肽HBD-2 和抗菌肽LL-37與牙周炎之間存在著密切聯(lián)系。

與牙周炎相關(guān)的一些全身危險(xiǎn)因素（如吸煙、糖尿病、肥胖等）也會(huì)引起抗菌肽的表達(dá)失調(diào)［6］。糖尿病是一種以血糖水平升高，糖耐量降低為主要癥狀的代謝性疾病，其中具有胰島素抵抗的2 型糖尿?。╰ype 2 diabetes mellitus，T2DM）發(fā)病機(jī)制與慢性炎癥反應(yīng)密切相關(guān)，是牙周炎的重要危險(xiǎn)因素之一［3］。體外實(shí)驗(yàn)顯示高糖環(huán)境下角質(zhì)形成細(xì)胞分泌HBD-2 顯著減少［7］。Arampatzioglou 等［8］發(fā)現(xiàn)糖尿病患者抗菌肽LL-37 表達(dá)降低與創(chuàng)面難以愈合和繼發(fā)感染相關(guān)。但是關(guān)于2 型糖尿病人群齦溝液中抗菌肽的變化規(guī)律研究尚不充分。本試驗(yàn)研究牙周炎合并T2DM 患者齦溝液中抗菌肽LL-37、HBD-2 水平的變化及其與牙周臨床指標(biāo)的相關(guān)性，旨在探討齦溝液中抗菌肽與T2DM和牙周炎之間的關(guān)系及其互相影響機(jī)制，為闡明糖尿病患者牙周破壞的致病機(jī)理、早期診斷提供基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和儀器

弗羅里達(dá)探針（Florida Probe，美國(guó)）；濾紙條（Whatman，英國(guó)）；酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）試劑盒Human BD-2/beta Defensin-2 ELISA Kit（Arigobio，中國(guó)），Human LL-37 ELISA Kit（HycultBiotech，荷蘭）；Multiskan FC 型酶標(biāo)儀（Thermo，美國(guó)）。

1.2 研究對(duì)象

本研究選擇2019 年11 月至2020 年6 月到深圳市慢性病防治中心口腔科和內(nèi)科就診的患者77人，平均年齡為（60.35 ± 8.87）歲。該研究獲得了深圳市慢性病防治中心倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號(hào)：20181202），所有志愿者均在取樣和收集信息前簽署了書(shū)面知情同意書(shū)。

納入標(biāo)準(zhǔn)：年齡45～85 歲；受試者口內(nèi)至少有20 顆牙齒。排除標(biāo)準(zhǔn)：患有T2DM 之外的任何全身性疾??；3 個(gè)月內(nèi)使用過(guò)抗生素的患者；6 個(gè)月內(nèi)接受牙周治療的患者。

分組標(biāo)準(zhǔn)：根據(jù)1999 年世界衛(wèi)生組織提出的糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行T2DM 診斷，按照美國(guó)牙周學(xué)會(huì)和歐洲牙周聯(lián)盟提出的2018 年牙周病和植體周病國(guó)際新分類［9］進(jìn)行牙周炎診斷。根據(jù)參與者的全身和牙周健康狀況分為4 個(gè)研究組：全身健康并牙周健康對(duì)照組（健康對(duì)照組）22 人、全身健康牙周炎組19 人、T2DM 牙周健康組15 人、T2DM 合并牙周炎組21 人。

1.3 方法

1.3.1 牙周臨床指標(biāo)收集 采用弗羅里達(dá)探針對(duì)每顆牙齒的頰（唇）、舌側(cè)分別在近中、中央、遠(yuǎn)中6個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行探診檢查（除了第三磨牙和被牙齦覆蓋的殘根）。檢查內(nèi)容包括探診深度（probing depth，PD）、臨床附著力喪失（attachment level，CAL）；根據(jù)探測(cè)30 s 內(nèi)是否存在出血將探診出血（probing bleeding，BOP）分為陽(yáng)性和陰性，記錄并計(jì)算探診出血陽(yáng)性位點(diǎn)所占百分比（BOP%）。每位患者的PD、BOP%值為上述各部位的平均值，CAL 值為上述各部位的最大值。牙周檢查均由一位已進(jìn)行培訓(xùn)的口腔科醫(yī)生完成，并做標(biāo)準(zhǔn)一致性檢驗(yàn)，Kappa ＞0.75。

1.3.2 齦溝液的收集 牙科三用槍清潔牙面上的軟垢后，棉卷隔濕患者的待檢測(cè)牙位，在四顆第一磨牙的近中、遠(yuǎn)中及頰側(cè)齦溝或牙周袋內(nèi)分別插入3 條2 mm×10 mm 濾紙條，并放置30 s。若第一磨牙缺失，則檢測(cè)該區(qū)第二磨牙。將同一受試者的12 條濾紙條一并放入1.5 mL 離心管中，并加入500 μL 的PBS 液并保存在-80 ℃冰箱中備用。

1.3.3 抗菌肽的檢測(cè) 保存待測(cè)的齦溝液樣本與試劑盒常溫放置30 min，加入緩釋液離心后，保留上清液，使用ELISA 試劑盒Human BD-2/beta Defensin-2 ELISA Kit 和Human LL-37 ELISA Kit 檢測(cè)齦溝液中HBD-2 和LL-37 濃度。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 23 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。Shapiro-Wilk檢驗(yàn)顯示數(shù)據(jù)均不服從正態(tài)分布，數(shù)據(jù)用中位數(shù)（第一四分位數(shù)，第三四分位數(shù)）表示，多組間比較使用Kruskal-WallisH檢驗(yàn)，兩組間比較使用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)；Spearman 相關(guān)檢驗(yàn)分析抗菌肽與臨床牙周參數(shù)之間的相關(guān)性。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 全身健康組與T2DM 組牙周臨床指標(biāo)比較

如表1 所示：T2DM 牙周健康組與健康對(duì)照組的PD、CAL、BOP 牙周臨床指標(biāo)值差異不明顯（P＞0.05）；T2DM 合并牙周炎組的PD 值大于全身健康牙周炎組（P＜0.05）。

表1 全身健康組與T2DM 組牙周臨床指標(biāo)比較Table 1 Comparison of the periodontal clinical indexes between the healthy group and T2DM group Median（IQR）

2.2 各組齦溝液中抗菌肽水平比較

比較各組齦溝液中抗菌肽HBD-2 和LL-37 的水平，如表2 所示，全身健康牙周炎組HBD-2 和LL-37 水平均高于健康對(duì)照組（P＜0.05）；T2DM 牙周健康組HBD-2 水平低于健康對(duì)照組（P＜0.05）；T2DM 牙周健康組HBD-2 和LL-37 水平低于全身健康牙周炎組（P＜0.05）；T2DM 合并牙周炎組HBD-2水平低于全身健康牙周炎組（P＜0.05）；其余組間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表2 各組齦溝液中抗菌肽水平Table 2 Antimicrobial peptide levels in gingival crevicular fluid of each group Median（IQR）

2.3 牙周炎齦溝液中抗菌肽水平與牙周臨床指標(biāo)的相關(guān)性

對(duì)全身健康牙周炎組和T2DM 合并牙周炎組的齦溝液中抗菌肽水平與牙周臨床指標(biāo)進(jìn)行Spearman 相關(guān)性分析。如表3 所示，全身健康牙周炎組中HBD-2 與PD 呈正相關(guān)（P＜0.05），HBD-2 與CAL 呈正相關(guān)（P＜0.05），HBD-2 與BOP%的相關(guān)性無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；LL-37 與PD、CAL 呈正相關(guān)（P＜0.05），LL-37 與BOP%的相關(guān)性無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。如表4 所示，T2DM 合并牙周炎組齦溝液中抗菌肽HBD-2、LL-37 與牙周臨床指標(biāo)相關(guān)性無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表3 全身健康牙周炎組齦溝液中抗菌肽水平與牙周臨床指標(biāo)的相關(guān)性Table 3 Correlation between the antimicrobial peptide levels in the gingival crevicular fluid and the periodontal clinical indicators in systemically healthy controls in the periodontitis group

表4 中老年T2DM 合并牙周炎組齦溝液中抗菌肽水平與牙周臨床指標(biāo)的相關(guān)性Table 4 Correlation between the antimicrobial peptide levels in gingival crevicular fluid and the periodontal clinical indicators in elderly patients with T2DM periodontitis

3 討 論

3.1 全身健康人群齦溝液中抗菌肽水平

牙周組織抵御微生物侵犯的第一道防線包括了牙齦上皮的物理屏障作用和其分泌的抗菌物質(zhì)（如抗菌肽、溶酶體酶等）所形成的化學(xué)屏障［10］。齦溝液為牙齦上皮滲出液，內(nèi)含牙齦上皮分泌的抗菌物質(zhì)［11］。本研究發(fā)現(xiàn)，與健康對(duì)照組相比，全身健康牙周炎組齦溝液中的抗菌肽（包括HBD-2和LL-37）水平升高。Sidharthan 和?ztürk 等［12-13］發(fā)現(xiàn)牙周炎患者齦溝液中HBD-2 水平明顯高于牙齦炎患者和牙周健康人群，Soldati 等［14］發(fā)現(xiàn)牙周炎齦溝液中LL-37 的水平明顯上升，吸煙會(huì)導(dǎo)致齦溝液中LL-37 降低。但Yilmaz 等［15］發(fā)現(xiàn)牙周炎時(shí)唾液中僅LL-37 升高而HBD-2 與牙周健康對(duì)照組無(wú)差異，這種不一致可能因?yàn)槠洳杉臉颖緸橥僖憾驱l溝液，HBD-2 由上皮細(xì)胞分泌較多，齦溝液局部環(huán)境表達(dá)濃度較高，但唾液的稀釋作用導(dǎo)致了差異減小，或因?yàn)樵谑苎装Y影響的牙周組織中，蛋白水解酶活性顯著升高，其對(duì)HBD-2 的降解限制了組織中的HBD-2 向唾液的分泌。當(dāng)牙周致病菌入侵，脂多糖等毒素直接刺激上皮細(xì)胞分泌抗菌肽，同時(shí)活化單核巨噬細(xì)胞分泌白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β），IL-1β 升高可以刺激活化中性粒細(xì)胞，中性粒細(xì)胞也可以分泌抗菌肽。HBD-2、LL-37 均為誘導(dǎo)性表達(dá)的抗菌肽，LL-37 主要由中性粒細(xì)胞表達(dá)，HBD-2 更多由上皮細(xì)胞分泌［5］。帶正電荷的抗菌肽除了靜電吸引直接殺菌作用外，還是重要的免疫調(diào)劑。抗菌肽作為趨化因子同時(shí)誘導(dǎo)其他趨化因子的產(chǎn)生，可抑制脂多糖誘導(dǎo)的促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生，調(diào)節(jié)樹(shù)突狀細(xì)胞或T 細(xì)胞，是先天免疫與獲得性免疫的橋梁。Yang 等［16］發(fā)現(xiàn)LL- 37 促進(jìn)角質(zhì)細(xì)胞自噬作用，可減少胞內(nèi)牙周致病菌。還有研究表明，抗菌肽相關(guān)基因的改變也可能與牙周炎癥有關(guān)，如抗菌肽HBD-2 基因組低拷貝會(huì)增加嚴(yán)重慢性牙周炎的風(fēng)險(xiǎn)［4］。不同牙周狀態(tài)下抗菌肽的變化也提示了抗菌肽作為牙周炎生物標(biāo)志物的可能性。

3.2 中老年T2DM 患者齦溝液中抗菌肽水平

本研究結(jié)果顯示中老年T2DM 合并牙周炎組的HBD-2 顯著低于全身健康的牙周炎組，LL-37 雖呈降低趨勢(shì)但無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。有體外研究顯示，高葡萄糖濃度下角質(zhì)細(xì)胞功能受損，HBD-2 的表達(dá)明顯下調(diào)［17］，免疫細(xì)胞分泌LL-37 顯著減少［18］。牙周炎時(shí)T2DM 患者唾液中HBD-1，2，3 明顯低于全身健康人群［15］。目前關(guān)于T2DM 患者齦溝液內(nèi)LL-37 水平的信息有限。人源陽(yáng)離子抗菌肽-18（human cationic antimicrobial peptide-18，hCAP-18）是LL-37 的前體，可通過(guò)外界刺激脫去保守片段成為L(zhǎng)L-37 活性片段。研究發(fā)現(xiàn)糖尿病患者牙齦組織中hCAP18 的表達(dá)水平上調(diào)［19］，另有研究表明糖尿病會(huì)引起中性粒細(xì)胞功能障礙［8］，如趨化功能受損，這可能是導(dǎo)致T2DM 患者牙周組織中hCAP18 上調(diào)但齦溝液中LL-37 活性片段分泌并沒(méi)有增加的原因。抗菌肽在牙周炎患者齦溝液中會(huì)發(fā)生降解，特別是在存在牙齦卟啉單胞菌（Porphyromonas gingivalis，P.g）的位點(diǎn)，而T2DM 人群的口腔P.g檢出率明顯高于無(wú)系統(tǒng)性疾病的人群［20］。P.g對(duì)抗菌肽的降解作用也可能是T2DM 患者齦溝液中抗菌肽下調(diào)的原因之一。

3.3 齦溝液中抗菌肽水平與牙周臨床指標(biāo)相關(guān)性

牙周臨床指標(biāo)PD 值和CAL 值能直接反映牙周炎的破壞程度，本研究顯示全身健康牙周炎組HBD-2 、LL-37 與CAL 顯著正相關(guān)，這與Ramamoorthy 等［21］研究結(jié)果相似，提示炎癥刺激了抗菌肽上調(diào)進(jìn)而發(fā)揮其抗菌、免疫調(diào)節(jié)等作用。體外試驗(yàn)顯示β 防御素還可以促進(jìn)人類間充質(zhì)干細(xì)胞、成骨細(xì)胞和角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖［22］。Peng 等［23］發(fā)現(xiàn)β防御素可促進(jìn)骨再生和防止感染。有研究表明抗菌肽LL-37 可增加牙齦成纖維細(xì)胞產(chǎn)生基質(zhì)金屬蛋白酶-1 的組織抑制劑，可調(diào)節(jié)成纖維細(xì)胞在牙周組織重建的反應(yīng)［24］。Yu 等［25］發(fā)現(xiàn)LL-37 可通過(guò)P2X7 受體和MAPK 信號(hào)通路減弱脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）對(duì)成骨的抑制作用。以上體外試驗(yàn)均從機(jī)制層面解釋了HBD-2 和LL-37 的牙周保護(hù)作用。此外，人工合成抗菌肽可用于治療糖尿病足、牙周炎感染［26］。有研究發(fā)現(xiàn)激光照射誘導(dǎo)LL-37 和HBD-2 的表達(dá)，可促進(jìn)組織愈合和清除P.g［27］，這也提示了HBD-2 和LL-37 在牙周組織中，尤其是細(xì)菌入侵、炎癥反應(yīng)時(shí)產(chǎn)生的保護(hù)作用。與全身健康牙周炎組不同，T2DM 合并牙周炎組HBD-2 和LL-37 與牙周臨床指標(biāo)的相關(guān)性沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這可能是因?yàn)樘悄虿?duì)抗菌肽的抑制作用使得牙周炎癥反應(yīng)時(shí)抗菌肽無(wú)法升高至正常濃度發(fā)揮其牙周保護(hù)功能，導(dǎo)致了T2DM 患者牙周破壞的進(jìn)一步加重。

綜上，全身健康人群患牙周炎時(shí)，抗菌肽參與到免疫調(diào)節(jié)中，對(duì)牙周病原微生物有明顯的抑制和消滅作用，牙周破壞加重時(shí)，抗菌肽會(huì)進(jìn)一步升高起到牙周保護(hù)作用。中老年T2DM 患者齦溝液中抗菌肽HBD-2 的減少可能是牙周感染加重的原因之一?？咕腖L-37 與中老年T2DM 患者牙周健康的關(guān)系還需更大樣本量的臨床試驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。

【Author contributions】Zhang YM performed the experiments and wrote the article. Gan XQ and Yu HY revised the article. Zhang HY，Ruan SH and Chen XC designed the study. All authors contributed to the article and approved the submitted version.