徐悅，米博瀚，趙雪飛，黃晶，梁利群

（1.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306；2.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所，黑龍江 哈爾濱 150070；3.東北林業(yè)大學(xué)野生動(dòng)物與自然保護(hù)地學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040）

瓦氏雅羅魚是我國(guó)北方知名的土著魚，隸屬鯉形目、鯉科、雅羅魚亞科的雅羅魚屬，亦稱東北雅羅魚，俗稱華子魚、滑魚、白魚，主要分布在黑龍江流域的各個(gè)水系，此外，黃河的下游、灤河、岱海以及內(nèi)蒙古的達(dá)里湖等地亦有分布。內(nèi)蒙古達(dá)里諾爾湖的瓦氏雅羅魚可以耐受堿度53.57 mmol/L、pH 高達(dá)9.69 的惡劣水質(zhì)條件[1]。竇新杰等[2]對(duì)瓦氏雅羅魚的COI 序列分析可知，達(dá)里諾爾湖瓦氏雅羅魚與黑龍江流域的松花江瓦氏雅羅魚雖然親緣較近，但已出現(xiàn)明顯分化。生存于不同鹽堿環(huán)境下的雅羅魚，也使培育耐鹽堿養(yǎng)殖新品種成為可能。

鹽堿水是分布于陸地區(qū)域、礦化度大于1 g/L小于50 g/L 的非海洋性咸水資源，在自然界廣泛存在，具有高pH、高碳酸鹽堿度、主要離子比例失衡、水質(zhì)類型多等特點(diǎn)。由于人畜無法飲用，農(nóng)業(yè)無法直接利用，絕大多數(shù)處于閑置狀態(tài)。開發(fā)鹽堿水養(yǎng)殖，對(duì)節(jié)約利用土地資源，保證內(nèi)陸水產(chǎn)養(yǎng)殖可持續(xù)發(fā)展具有重要意義[3]。水環(huán)境對(duì)于魚類的血液循環(huán)系統(tǒng)有直接影響，魚類的血液指標(biāo)是反應(yīng)魚類生理活動(dòng)和健康狀態(tài)的重要參數(shù)。研究堿脅迫下瓦氏雅羅魚血液生理指標(biāo)的變化情況，有助于探究瓦氏雅羅魚在堿脅迫下的生理變化。

本實(shí)驗(yàn)以堿水、淡水瓦氏雅羅魚為研究對(duì)象，分別于30 mmol/L 與50 mmol/L 的NaHCO3溶液堿度水環(huán)境進(jìn)行20 d 耐受試驗(yàn)。通過研究不同濃度堿脅迫對(duì)瓦氏雅羅魚堿性磷酸酶（AKP）、酸性磷酸酶（ACP）、尿素氮（BUN）、血氨（Amon）和乳酸脫氫酶（LDH）含量變化的影響，探討不同瓦氏雅羅魚在堿脅迫下生理指標(biāo)變化情況，為探索雅羅魚耐堿機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)魚為分別采自內(nèi)蒙古達(dá)里諾爾湖的瓦氏雅羅魚（堿水組）F1親本和松花江瓦氏雅羅魚（淡水組）F1，共計(jì)120 尾。堿度耐受實(shí)驗(yàn)前實(shí)驗(yàn)魚在循環(huán)可控水族箱（42.6 cm×28.4 cm×29.3 cm）暫養(yǎng)1 周。

1.2 堿脅迫實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)用水為過濾、曝氣24 h 的自來水，水溫為（20.5±1.5）℃，pH7.25，溶解氧為（7.5±0.42）mg/L，氨氮為0.26 mg/L。實(shí)驗(yàn)魚以5 尾一組，分別置于0 mmol/L、30 mmol/L、50 mmol/L 的碳酸鹽堿水中。每組3 個(gè)平行試驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)開始后每天測(cè)兩次水質(zhì)，并視水質(zhì)情況換水，保持碳酸鹽堿度恒定，氨氮?dú)獾陀? mg/L，耐受20 d 后取血液。

1.3 血液的采集與檢測(cè)

堿脅迫實(shí)驗(yàn)20 d 后采集樣品。用1 mL 無菌注射器從實(shí)驗(yàn)魚尾靜脈采血，置于無菌離心管中，4℃靜置12 h，3 500 r/min 離心15 min，取上層血清置于-20℃低溫冰箱保存?zhèn)溆?。血清中堿性磷酸酶（AKP）、酸性磷酸酶（ACP）、尿素氮（BUN）、血氨和乳酸脫氫酶（LDH）的酶活測(cè)定均使用南京建成科技有限公司生產(chǎn)的試劑盒，利用Bio-Tek Synergy2多功能酶標(biāo)儀測(cè)定[4]。

1.4 數(shù)據(jù)的測(cè)定

數(shù)據(jù)處理以堿濃度單素方差分析（One-Way ANOVA），用LSD 多重比較法進(jìn)行組間差異顯著性檢驗(yàn)。試驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（Mean±SD）表示，采用SPSS19.0 軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，顯著性水平取α＝0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 堿脅迫對(duì)堿性磷酸酶的影響

經(jīng)20 d 堿脅迫，與對(duì)照組相比，F(xiàn)W 與AW 血清中堿性磷酸酶活性均有一定程度升高，F(xiàn)W 與AW 均在30 mmol/L 堿度下堿性磷酸酶活性高于50 mmol/L 堿度。FW 血清中AKP 活性（9.71±0.17、13.18±1.38 和12.4±0.52）與AW（10.56±0.45、8.72±0.83 和11.59±0.30）均為堿脅迫組高于對(duì)照組，AW 與FW 的血清AKP 活性在30 mmol/L 時(shí)在統(tǒng)計(jì)學(xué)上差異顯著（P＜0.05），兩個(gè)種群各實(shí)驗(yàn)組內(nèi)AKP 活 性 差 異 均 不 顯 著（P ＞0.05）；FW 的30 mmol/L 和50 mmol/L 堿度處理與對(duì)照組相比差異均顯著（P＜0.05），AW 在兩個(gè)堿度處理組間差異不顯著（P＞0.05），但均與對(duì)照組存在顯著性差異（P＜0.05）（圖1）。

圖1 各實(shí)驗(yàn)組堿性磷酸酶變化情況Fig.1 Changes of AKP in Leuciscus waleckii exposed to different alkalinities for 20 d

2.2 堿脅迫對(duì)酸性磷酸酶的影響

兩個(gè)種群魚血清中酸性磷酸酶變化情況與堿性磷酸酶有所不同。與對(duì)照組相比，F(xiàn)W 在堿脅迫后，血清中ACP 活性一定程度降低，且50 mmol/L堿處理組（91.41±3.75）要低于30 mmol/L 堿處理組（97.4±15.69），但兩處理組與對(duì)照組均不存在顯著差異（P＞0.05）；AW 則與FW 相反，兩個(gè)堿處理組血清中ACP 活性均一定程度升高，50 mmol/L 處理組（107.15±4.24）低于30 mmol/L 處理組（117.39±10.22），僅30 mmol/L 組與對(duì)照組存在顯著差異（P＜0.05）；相同實(shí)驗(yàn)組中，僅30 mmol/L 處理組中，兩個(gè)種群魚的血清ACP 含量差異顯著（P＜0.05），其余均不存在顯著差異（P＞0.05）（圖2）。

圖2 各實(shí)驗(yàn)組酸性磷酸酶變化情況Fig.2 Changes of ACP in Leuciscus waleckii exposed to different alkalinities for 20 d

2.3 堿脅迫對(duì)尿素氮的影響

20 d 堿度脅迫下，F(xiàn)W 和AW 的尿素氮變化情況相似，均為30 mmol/L 處理組尿素氮含量（5.73±0.78 和18.71±3.53）高于50 mmol/L 處理組（3.95±0.51 和13.97±0.79），但AW 波動(dòng)幅度遠(yuǎn)大于FW，兩個(gè)處理組AW 的血清BUN 含量均接近FW 的4倍；FW 的兩個(gè)處理組與對(duì)照組間不存在顯著差異（P＞0.05），AW 則均與處理組存在顯著差異（P＜0.05）；同一堿度處理下，AW 與FW 也都存在顯著差異（P＜0.05）（圖3）。

圖3 各實(shí)驗(yàn)組尿素氮變化情況Fig.3 Changes of BUN in Leuciscus waleckii exposed to different alkalinities for 20 d

2.4 堿脅迫對(duì)血氨的影響

兩個(gè)種群魚血清的血氨變化情況相似，均為處理組高于對(duì)照組，30 mmol/L 組（1919.93±63.92 和1638.58±178.72）高于50 mmol/L 組（1599.86±159.32 和1400.27±61.76），且FW 均高于AW；各實(shí)驗(yàn)組內(nèi)，僅30 mmol/L 組中兩個(gè)種群魚血清的血氨含量存在顯著差異（P＜0.05），F(xiàn)W 和AW 的兩個(gè)處理組均與對(duì)照組存在顯著差異（P＜0.05），F(xiàn)W 的兩個(gè)處理組間也存在顯著差異（P＜0.05），AW 的兩個(gè)處理組間則不存在顯著差異（P＞0.05）（圖4）。

圖4 各實(shí)驗(yàn)組血氨變化情況Fig.4 Changes of blood ammonia in Leuciscus waleckii exposed to different alkalinities for 20 d

2.5 堿脅迫對(duì)乳酸脫氫酶的影響

堿度脅迫下，F(xiàn)W 與AW 血清中的乳酸脫氫酶變化幅度均不明顯。3 個(gè)實(shí)驗(yàn)組間的LDH 含量均不存在顯著性差異（P＞0.05）（圖5）。

圖5 各實(shí)驗(yàn)組乳酸脫氫酶變化情況Fig.5 Changes of LDH in Leuciscus waleckii exposed to different alkalinities for 20 d

3 討論

3.1 碳酸鹽脅迫對(duì)瓦氏雅羅魚血液中磷酸酶的影響

水體中的碳酸鹽堿度對(duì)水生生物的多個(gè)生理進(jìn)程都有影響，主要表現(xiàn)在組織功能、消化酶和免疫相關(guān)酶活性等方面。通常環(huán)境中的脅迫因素會(huì)導(dǎo)致魚類出現(xiàn)應(yīng)激反應(yīng)，應(yīng)激反應(yīng)開始于組織和器官功能的變化，是生物應(yīng)對(duì)或補(bǔ)償脅迫源，從而導(dǎo)致遠(yuǎn)離穩(wěn)態(tài)的生理反應(yīng)，這種反應(yīng)的速率或幅度在不同的個(gè)體之間可能存在差異，但其機(jī)制具有相似的特征[4]。ACP 是溶酶體的標(biāo)志性酶，磷酸基團(tuán)代謝產(chǎn)物通過磷酸酶進(jìn)行轉(zhuǎn)化和代謝，AKP 為ADP 轉(zhuǎn)化為ATP 提供無機(jī)磷酸，是反映生物體免疫機(jī)能與健康狀況的指標(biāo)[5]。

本實(shí)驗(yàn)中，在高堿度條件下，淡水種與堿水種瓦氏雅羅魚血清中的堿性磷酸酶活性均顯著升高，說明兩種瓦氏雅羅魚均通過提高機(jī)體ACP 酶活性以適應(yīng)高堿度環(huán)境。這與趙麗慧[6]、王卓等[7]的研究結(jié)果類似。研究發(fā)現(xiàn)，在50 mmol/L 組的磷酸酶活性要低于30 mmol/L，這可能是由于高堿脅破下瓦氏雅羅魚為調(diào)節(jié)代謝所消耗的能量更多，機(jī)體所需的ATP 升高消耗了磷酸酶，從而導(dǎo)致了50 mmol/L 組瓦氏雅羅魚的AKP 與ACP 低于30 mmol/L 處理組。舒超華等[8]在研究紅耳龜鹽脅迫下的生理指標(biāo)中也有相似的效果。血清中的ACP 酶活力在30 mmol/L耐受升高后在50 mmol/L 處略微下降，說明在更高的50 mmol/L 堿脅迫下，ACP 酶活性被抑制。淡水種瓦氏雅羅魚的ACP 在高堿度下要顯著高于堿水種瓦氏雅羅魚，說明堿水種相對(duì)于淡水種瓦氏雅羅魚對(duì)碳酸鹽堿度的適應(yīng)性較強(qiáng)，高堿度脅迫下磷酸酶活性也具有很好的恢復(fù)功能。

3.2 碳酸鹽脅迫對(duì)瓦氏雅羅魚血液中尿素氮、血氨和乳酸脫氫酶的影響

尿素氮是動(dòng)物體內(nèi)蛋白質(zhì)代謝的主要代謝產(chǎn)物，可以反映腎臟的健康狀況。血清中尿素氮是衡量動(dòng)物體內(nèi)蛋白質(zhì)代謝和氨基酸平衡的一個(gè)重要指標(biāo)。通常，較低的BUN 含量表明氨基酸平衡較好，機(jī)體蛋白質(zhì)合成率較高[9]，血清尿素氮過高，則會(huì)使氮通過尿液排出體外[10]。

有研究表明在碳酸鹽水體中，魚體內(nèi)外離子濃度的變化會(huì)導(dǎo)致體內(nèi)NH4+的堆積[11,12]。本研究中，與0 mmol/L 堿度環(huán)境下相比，兩種瓦氏雅羅魚在30 mmol/L 和50 mmol/L 堿度下尿素氮均顯著增長(zhǎng)，且堿水種瓦氏雅羅魚的尿素氮數(shù)值顯著高于淡水種雅羅魚。與張曉瑩等[13]發(fā)現(xiàn)異育銀鯽在高氨氮環(huán)境下異尿素氮數(shù)值顯著升高的研究類似。魚體內(nèi)的氨經(jīng)氨基甲酰磷酸合成酶（CPS）催化產(chǎn)生氨甲酰磷酸等一系列生化反應(yīng)，最終產(chǎn)生尿素[14,15]。常玉梅等[16]測(cè)定了不同堿度下瓦氏雅羅魚血漿游離氨基酸的變化，發(fā)現(xiàn)達(dá)里湖雅羅魚在高堿脅迫下血漿中非必需氨基酸的含量隨著堿度的升高,呈明顯上升趨勢(shì)，說明其蛋白代謝受到了高堿度的影響。賴氨酸的含量與水體堿度呈現(xiàn)“U”形關(guān)系，即30 mmol/L堿度組含量低于對(duì)照組和高堿度組50 mmol/L，而血清尿素氮?jiǎng)t呈現(xiàn)“倒U”形。說明血清尿素氮含量可能與某幾種氨基酸的合成或代謝有一定的聯(lián)系。

魚類鹽堿代謝的基礎(chǔ)是排氨[17]，相比較于淡水種雅羅魚，堿水種雅羅魚血液中的氨明顯低于淡水種，且尿素氮高于淡水種雅羅魚。說明堿水種通過尿液向體外排除氮的能力要明顯強(qiáng)于淡水種，堿水種能通過這一方式減少體內(nèi)部分有害氮的堆積，使自身對(duì)外界惡劣環(huán)境具有更強(qiáng)的適應(yīng)能力。此外，兩種雅羅魚在50 mmol/L 堿度下尿素氮和血氨也出現(xiàn)了的低于30 mmol/L 的情況。何強(qiáng)等[18,19]研究的測(cè)定類似，堿水雅羅魚的血氨含量在兩個(gè)處理組中雖然有一定的波動(dòng)，但并不存在顯著差異（P＞0.05），而淡水雅羅魚兩個(gè)處理組相互之間存在顯著差異（P＜0.05），血氨含量波動(dòng)較大，說明堿水種能夠通過保持體內(nèi)一定范圍的氨氮含量適應(yīng)高鹽堿環(huán)境，而淡水種則欠缺這種適應(yīng)能力。

乳酸脫氫酶是生物體糖代謝無氧酵解過程中重要的調(diào)節(jié)酶，可催化無氧酵解產(chǎn)生的乳酸與丙酮酸之間的相互轉(zhuǎn)化。在相關(guān)的研究中，陶易凡等[20]研究表明，短期的高pH 脅迫會(huì)使克氏原螯蝦Procambarus clarkia LDH 酶活性升高。崔東遙等[21]對(duì)中間球海膽Strongylocentrotus intermedius 面對(duì)海水酸化的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，中間球海膽通過調(diào)節(jié)SiLDH 基因的表達(dá)和LDH 活性來緩解海水酸化帶來的負(fù)面影響。本實(shí)驗(yàn)中瓦氏雅羅魚乳酸脫氫酶活性變化不顯著，有可能是瓦氏雅羅魚的耐堿機(jī)制使乳酸脫氫酶活性保持穩(wěn)定，但是不能從結(jié)果推斷兩種瓦氏雅羅魚的生理機(jī)制相同，乳酸脫氫酶在瓦氏雅羅魚耐堿方面的功能有待進(jìn)一步研究。

3.3 結(jié)論

碳酸鹽脅迫對(duì)于瓦氏雅羅魚血液中的磷酸酶活性、血氨和尿素氮含量有明顯的影響。在堿脅迫條件下，兩種雅羅魚堿性磷酸酶活性顯著高于淡水對(duì)照，堿水雅羅魚酸性磷酸酶活性顯著升高，淡水雅羅魚變化不明顯。推斷磷酸酶參與堿水雅羅魚的耐堿機(jī)制。堿脅迫下堿水雅羅魚尿素氮指標(biāo)顯著升高，淡水雅羅魚尿素氮指標(biāo)變化不顯著，另外兩者血氨指標(biāo)均有升高。推斷堿水雅羅魚應(yīng)對(duì)堿脅迫啟動(dòng)排氨代謝導(dǎo)致尿素氮升高，而淡水雅羅魚血氨升高尿素氮不升高使其體內(nèi)有害氮堆積有可能會(huì)造成損傷。

綜上所述，堿水雅羅魚和淡水雅羅魚對(duì)于碳酸鹽脅迫的應(yīng)激性和適應(yīng)能力有一定的不同，達(dá)里湖瓦氏雅羅魚可能會(huì)啟動(dòng)一些特殊的機(jī)制來應(yīng)對(duì)高堿度水環(huán)境。達(dá)里湖瓦氏雅羅魚對(duì)高堿水的適應(yīng)能力強(qiáng)于松花江瓦氏雅羅魚。