譚舜，楊逸文，蔣小美，姜波，徐建榮，韓曉磊

（1.常熟理工學(xué)院，江蘇 常熟 215500；2.南京仙夏生物科技有限公司，江蘇 南京 210000）

仙女蝦（fairy shrimp）是節(jié)肢動物門Arthropoda鰓足綱Branchiopoda 無甲目Anostraca 一類物種的統(tǒng)稱，品種繁多，在世界各地均有分布，是平時不易見到的季節(jié)性水生浮游動物。目前，仙女蝦的研究和利用較為成熟的是重要的海水魚蝦蟹幼體開口餌料海水鹵蟲[1]。紅尾仙女蝦Branchinella thailandensis 隸屬于釵額蟲科Thamnocephalidae 枝額蟲屬Branchinella，為淡水仙女蝦，生活史較為簡單。紅尾仙女蝦蝦卵進行干燥處理后可長時間保存，適合長距離運輸，其初孵的無節(jié)幼體體長0.3～0.5 mm，適合魚蝦蟹類初孵幼體開口攝食，故可作為新型淡水生物開口餌料[2]。因紅尾仙女蝦生命周期較短，僅2～3 個月，對生境要求較高，多生活在水質(zhì)良好的暫時性水體；季節(jié)性較強，只在初夏秋末有小規(guī)模爆發(fā)，在自然界活體較少，處于較為稀有的狀態(tài)。因此，紅尾仙女蝦僅在印度和泰國有少量研究，主要涉及其地理群體分布、暴發(fā)地自然生境條件和鳥、魚攜帶休眠卵情況及黑斑病和桿菌病兩種病害等研究[3-7]。從2008 年至今，在新疆、云南、河北和江蘇等省先后報道了淡水仙女蝦的自然存在，但其相關(guān)研究乃至人工養(yǎng)殖還處于空白狀態(tài)[8,9]。現(xiàn)階段，我國淡水養(yǎng)殖業(yè)急需一種類似于海水鹵蟲的淡水開口活餌料，紅尾仙女蝦可以適時加以開發(fā)利用，具有廣闊的市場前景。

簡單重復(fù)序列間擴增（inter simple sequence repeat，ISSR）分子標(biāo)記技術(shù)操作簡單、穩(wěn)定快速，無需預(yù)先了解基因組序列特點，降低了實驗難度和實驗成本，已被廣泛應(yīng)用于水生動物遺傳多樣性分析、遺傳作圖、系統(tǒng)進化關(guān)系等領(lǐng)域[10-13]。本研究對紅尾仙女蝦養(yǎng)殖群體的ISSR 分子標(biāo)記反應(yīng)體系進行探索和優(yōu)化，由此研究分析了其遺傳多樣性，為了解紅尾仙女蝦的遺傳背景，乃至種質(zhì)資源評定、保護及利用等工作提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 材料

本實驗用的24 個紅尾仙女蝦樣本為蘇州市長江特色水產(chǎn)培育繁殖養(yǎng)殖研究中心提供的人工養(yǎng)殖F4代成體，活體保存于-80℃冰箱待用。所用引物參照UBC 公司2006 年公布的ISSR 引物序列，由蘇州金唯智生物科技有限公司合成，用于ISSR 反應(yīng)的PCR buffer、Mg2+、dNTP、Taq DNA 聚合酶等均購于TaKaRa 公司。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA 提取

選取紅尾仙女蝦剝離腸道的全部組織，基因組DNA 的提取參照韓曉磊等[14]的方法并略加改進。用分光光度計（Thermo Scientific NanoDrop 2000）測定基因組DNA 的濃度，并通過凝膠成相系統(tǒng)（UVP Biospectrum 410）檢測DNA 的完整性，檢測合格的DNA 樣本置-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 退火溫度的優(yōu)化及引物篩選

以檢測后得到的24 個紅尾仙女蝦DNA 的混合樣為DNA 模板，按通用PCR 條件對90 個ISSR引物進行初篩，選擇擴增條帶較多、信號強和背景清晰的引物。退火溫度范圍設(shè)置為48～59℃，PCR 儀自動生成12 個梯度，分別為48℃、49℃、50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃。

1.2.3 ISSR-PCR 正交試驗

針對25 μL 的PCR 體系，選擇Mg2+、引物、Taq DNA 聚合酶因素3 水平3 進行L9（34）正交實驗（表1）。正交試驗中，PCR 反應(yīng)體系總體積為25 μL，除表1 中變化因素外，每管中2.5 μL 的10×PCR Buffer、2 μL 的dNTP 和1 μL 的模板DNA 固定不變，ddH2O 根據(jù)其他試劑的用量定容至25 μL，所用引物為上文中提取篩選出的引物。

表1 紅尾仙女蝦ISSR-PCR 正交試驗Tab.1 The orthogonal experiment of ISSR-PCR in fairy shrimp Branchinella thailandensis

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

對紅尾仙女蝦養(yǎng)殖群體ISSR 的電泳圖譜進行人工讀帶，相同引物得到的電泳遷移率一致的條帶被認(rèn)為具有同源性，是相同位點的產(chǎn)物，無條帶或模糊條帶的記為0，有條帶的記為1，得到0，1 數(shù)據(jù)矩陣。利用POPGEN32 計算多態(tài)位點比率、遺傳相似度和遺傳多樣性，并進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物篩選和正交試驗

通過引物初篩實驗，對90 個ISSR 引物進行篩選；通過PCR 擴增后的電泳檢測，確定擴增條帶較多、信號強和背景清晰的引物并記錄，以便于后續(xù)實驗。

PCR 過程中需要多種試劑聯(lián)合反應(yīng)，各因素都會影響其結(jié)果，Mg2+、引物和Taq 酶等條件不同，其結(jié)果差異很大。由圖1 可知，在9 個不同條件處理中，3 種因素的不同組合濃度不同，擴增結(jié)果也明顯不同。泳道4、6、7 的多態(tài)性較低，泳道5、6、7 條帶強度較高，其原因受多種因素所致。泳道2、3 條帶清晰，多態(tài)性高，背景對比度好。經(jīng)過比較，以特異譜帶多態(tài)性高、背景對比度好、主帶清楚、副帶明顯為標(biāo)準(zhǔn)，考慮到實驗的成本以及效果等因素，確定該引物ISSR-PCR 的最佳反應(yīng)體系為：25 L 反應(yīng)體系中包含Taq 酶0.5 U，引物1.25 μL，Mg2+3.0 μL，模板DNA 1 μL，dNTP 2 μL，10×PCR Buffer 2.5 μL，其他引物以同樣方法確定最佳反應(yīng)體系（表2）。

圖1 引物866 的ISSR-PCR 擴增正交試驗結(jié)果Fig.1 Results of ISSR-PCR orthogonal test for primer 866

表2 ISSR-PCR 正交試驗設(shè)計結(jié)果Tab.2 The orthogonal design ISSR-PCR

2.2 退火溫度梯度PCR

根據(jù)已篩選的8 個引物及其建立的紅尾仙女蝦ISSR 反應(yīng)體系，優(yōu)化這8 個引物的退火溫度。結(jié)、,果發(fā)現(xiàn)引物不同，其最佳退火溫度不同。由溫度梯度PCR 結(jié)果（圖2）可知，當(dāng)溫度較低時（48～52℃），譜帶背景較低，且上半部分?jǐn)U增條帶不清楚。溫度梯度逐漸提高時（53～59℃），上半部分背景提高，條帶逐漸增多，更加清晰。

圖2 不同退火溫度對引物874 的ISSR-PCR 擴增結(jié)果的影響Fig.2 Effect of different annealing temperature on ISSRPCR results of primer 874

2.3 ISSR-PCR 反應(yīng)最佳條件確定

根據(jù)引物篩選、正交試驗和退火溫度梯度試驗結(jié)果，最終確定紅尾仙女蝦的8 個ISSR 引物的最佳反應(yīng)體系（表3）。

表3 不同引物的ISSR-PCR 反應(yīng)最佳條件Tab.3 The optimal conditions of different primers for ISSR-PCR

2.4 ISSR 擴增

本實驗選定效果最好的6 個ISSR 引物，對紅尾仙女蝦人工養(yǎng)殖群體的24 個DNA 樣品進行PCR 擴增，6 個ISSR 引物擴增出來的條帶數(shù)在5～8之間，共擴增出37 個可統(tǒng)計的位點。圖3 為引物809 在紅尾仙女蝦養(yǎng)殖群體24 個個體間的ISSR 擴增譜圖。

圖3 引物809 在紅尾仙女蝦養(yǎng)殖群體中的ISSR 擴增結(jié)果Fig.3 The ISSR amplification of primer 809 in cultured populations of fair shrimp B.thailandensis

2.5 養(yǎng)殖群體遺傳多樣性

在紅尾仙女蝦養(yǎng)殖群體擴增出的37 個擴增位點中，多態(tài)位點為32 個，多態(tài)位點比率為86.49%；由POPGEN32 計算得出，Nei's 指數(shù)為0.2570，Shannon's 指數(shù)為0.3962（表4）。

表4 6 個ISSR 引物在24 個紅尾仙女蝦個體間的擴增情況Tab.4 The amplification of 6 ISSR primers in 24 individuals of fair shrimp B.thailandensis

3 討論

3.1 ISSR 反應(yīng)體系建立

簡單重復(fù)序列（SSR）廣泛分布于真核生物基因組DNA 中，蘊含著大量的遺傳信息，ISSR（Inter-simple sequence repeat）引物可選擇性地對簡單重復(fù)序列區(qū)進行擴增，檢測遺傳信息[10,11]。本研究顯示，ISSR 反應(yīng)體系不僅展現(xiàn)了紅尾仙女蝦基因組DNA 微衛(wèi)星的分布特征，也提供了其部分遺傳背景信息。ISSR 技術(shù)多態(tài)性高、成本低、重復(fù)性好，特別是無需預(yù)先了解研究對象基因組序列特點即可做出分析，這對鮮有分子生物學(xué)研究的紅尾仙女蝦，乃至仙女蝦類生物都是一個很好的選擇。然而，ISSR 是基于PCR 的分子標(biāo)記技術(shù)，易受反應(yīng)體系和條件的影響;不同物種的最適PCR 條件參數(shù)也有一定程度的差異，其擴增結(jié)果勢必受到反應(yīng)體系的DNA 模板、Taq 酶、引物、Mg2+以及退火溫度等因素的影響[15,16]，因此，有必要建立并優(yōu)化ISSR-PCR 的反應(yīng)體系，以保證其分析結(jié)果的特異性、穩(wěn)定性和可靠性。本研究在保證紅尾仙女蝦DNA 模板質(zhì)量的前提下，選取Taq 酶、引物和Mg2+3 個主要因素進行正交實驗，并通過優(yōu)化退火溫度，建立了紅尾仙女蝦ISSR 反應(yīng)體系，為進一步開展紅尾仙女蝦分子遺傳學(xué)研究奠定了基礎(chǔ)。

3.2 遺傳多樣性水平

遺傳多樣性是生物多樣性研究的重要內(nèi)容，是物種適應(yīng)多變的環(huán)境條件、維持長期生存和進化的遺傳基礎(chǔ)[17]。平均多態(tài)位點比率是衡量生物群體遺傳多樣性的參數(shù)[18]。本研究中紅尾仙女蝦養(yǎng)殖群體平均多態(tài)位點比率為86.49%，與具有較高遺傳多樣性水平的兩性鹵蟲Artemia sinica、平滑真刺水蚤Euchaeta plana、精致真刺水蚤Euchaeta concinna 和萼花臂尾輪蟲Brachionus calyciflorus 的野生群體ISSR 數(shù)據(jù)[19-23]比較發(fā)現(xiàn)，紅尾仙女蝦養(yǎng)殖群體與兩性鹵蟲野生群體處于同一水平，且高于平滑真刺水蚤、精致真刺水蚤和萼花臂尾輪蟲的野生群體，揭示紅尾仙女蝦養(yǎng)殖群體遺傳多樣性處于較高水平；Nei's 指數(shù)和Shannon’s 指數(shù)分析比較同樣得出以上結(jié)論。

人工養(yǎng)殖群體受奠基者效應(yīng)、人工選擇以及遺傳漂變等作用，主要是親本近交效應(yīng)、人為選擇壓力和稀有等位基因缺失等因素的影響，致使養(yǎng)殖群體遺傳多樣性比野生群體有不同程度的降低[24,25]。本研究中，雖然紅尾仙女蝦是人工養(yǎng)殖F4代群體，但依然保持著較高的遺傳多樣性水平，究其原因：紅尾仙女蝦是浮游動物且初始個體較小（0.3～0.5 mm），在養(yǎng)殖過程中其親本基礎(chǔ)群體的數(shù)量均在萬級以上，這在很大程度上降低了瓶頸效應(yīng)和近交衰退的發(fā)生概率；紅尾仙女蝦屬于低等浮游生物，具有較強的生境適應(yīng)和種群恢復(fù)能力，加之所提供的養(yǎng)殖環(huán)境為人工營造的較適宜的生境條件，故養(yǎng)殖環(huán)境所產(chǎn)生的人為選擇壓力較?。辉谌斯ゐB(yǎng)殖環(huán)境下，稀有等位基因勢必出現(xiàn)一定程度的缺失，但所占比例有限，這也是養(yǎng)殖群體種質(zhì)相對純化的必然趨勢，但其具體的缺失程度和影響還有待更深入的研究。綜上，紅尾仙女蝦養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性處于較高水平，人工養(yǎng)殖環(huán)境對其遺傳多樣性的影響較小，能保證其優(yōu)良的經(jīng)濟性狀和豐富的遺傳變異。