陳婷婷，韓愷忻，陳翠雪，凌雪萍，沈亮，盧英華

（廈門大學化學化工學院，福建廈門361005）

引 言

希瓦氏菌（Shewanellasp.）是一種革蘭陰性、兼性厭氧菌，形態(tài)多為長約2μm 的棒狀，廣泛分布于海洋等水生環(huán)境，部分種屬可在嚴苛的環(huán)境下生存[1-2]。希瓦氏菌具有多樣化的代謝能力，由于其細胞內(nèi)廣泛存在細胞色素c，因此可利用溶液中的不溶性固體特別是Fe（Ⅲ）等胞外不溶性礦物氧化物[3-6]作為電子終端受體，所以希瓦氏菌也以鐵還原菌著稱。

近年來希瓦氏菌被廣泛應用于環(huán)境修復方面的研究，包括染料褪色[7-9]、重金屬還原[10-11]、硝基苯去除[12]等，相比傳統(tǒng)的手段，利用微生物治理環(huán)境可以有效減少有害物質(zhì)的產(chǎn)生，且過程更加溫和、操作更加簡便。此外，隨著微生物燃料電池（MFCs）的興起，作為典型的胞外電子傳遞微生物，希瓦氏菌在MFCs中表現(xiàn)出不凡的產(chǎn)電能力[13-15]。

希瓦氏菌在去除染料、重金屬及其他污染物時，難免會接觸到各類有機溶劑，低濃度的有機溶劑便可對細胞產(chǎn)生不利影響，會破壞細菌細胞結(jié)構及功能的完整性[16]。一般有機溶劑對細胞的毒性具體表現(xiàn)在兩個方面[17]：一是改變細胞膜結(jié)構及功能，影響細胞膜生理過程中的能量產(chǎn)生和物質(zhì)轉(zhuǎn)運，產(chǎn)生生長抑制，有時甚至導致細胞死亡；二是將細胞的新陳代謝途徑破壞，直接導致細胞死亡，因此考察微生物對于有機溶劑的耐受性可以為其在實際應用中發(fā)揮更優(yōu)越的性能提供理論依據(jù)。

與其他環(huán)境應激抑制類似，在有機溶劑的脅迫下，許多微生物通過改變細胞膜結(jié)構、增加飽和脂肪酸比例、改變外膜生理形態(tài)、降解胞內(nèi)溶劑等行為來適應外界的有機溶劑的刺激。已報道的耐有機溶劑微生物多為革蘭陰性菌，其中很大一部分屬于假單胞菌屬[18-19]，近年來也有不少耐有機溶劑革蘭 陽 性 菌 的 報 道，如Bacillus[20]、Staphylococcus[21]、Rhodococcus[22]和Arthrobacter[23]等菌屬。

目前關于希瓦氏菌和有機溶劑的相互作用研究多著重于乳酸、二甲基亞砜（DMSO）等可作為希瓦氏菌電子受體的溶劑，對于其他溶劑的應激研究較少。因此，本研究主要探討了廈門希瓦氏菌Shewanella xiamenensisBC01（SXM）在不同有機溶劑應激下的形態(tài)、生長速率、形態(tài)及蛋白表達變化，并通過酶活測定探究應激下SXM 的形態(tài)變化，以及通過定量PCR方法探討了基因水平上的變化。

1 實驗材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 實驗所用菌種為新型海洋產(chǎn)電菌株Shewanella xiamenensisBC01，篩選自廈門大學白城海域，簡稱SXM，為棒狀形態(tài)的革蘭陰性菌，菌落呈紅棕色，兼性厭氧。

1.1.2 主要試劑 胰蛋白胨、酵母粉（BR，OXOID LTD.）；瓊脂粉、甘氨酸（BR，鷺隆生物有限公司（分裝））；無水乙醇、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、氯化鈉、叔丁醇、甲醇、丙醇、異丙醇、丁醇、丙酮、考馬斯亮藍R-250、EDTA、過硫酸銨（AR，國藥集團化學試劑有限公司）；瓊脂糖（BR，法國BIOWEST 公司）；Tris Base（BR，NOVON）；SDS（BR，Sigma-Aldrich 公司）；TEMED（BR，生工生物工程有限公司）；30%丙烯酰胺溶液（BR，美國BIO-RAD 公司）；25% 戊二醛（AR，Acros Organics 公司）；蛋白質(zhì)上樣緩沖液（索來寶公司）；蛋白質(zhì)電泳Marker（Thermo Fisher Scientific公司）。

1.1.3 主要儀器 SpectraMax MS190 酶標儀（Molecular Devices 公司）；FD-1000 型冷凍干燥機（上海愛朗儀器有限公司）；MJ Mini PCR 儀、電泳儀（Bio-Rad 公司）；GEL LOGIC 200 凝膠成像系統(tǒng)（柯達公司）；Zeiss Sigma 掃描電鏡（德國Zeiss 公司）；Step one Plus 定量PCR 儀（ABI）；NanoZS90 Zetasizer（馬爾文儀器有限公司）；TU88 掃描儀（GE 公司）；85-AC/EXP厭氧工作站（PLAS LABS公司）。

1.1.4 培養(yǎng)基 Luria-Bertani（LB）液體培養(yǎng)基（g/L）: NaCl 10，胰蛋白胨10，酵母粉5，使用1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH至7.0；LB 瓊脂固體培養(yǎng)基（g/L）: NaCl 10，胰蛋白胨10，酵母粉5，瓊脂粉15，使用1 mol/L NaOH 調(diào)節(jié)pH至7.0。

1.2 方法

1.2.1 掃描電鏡測試 將一小滴洗滌過的SXM 菌液置于硅片上，添加濃度為2.5%的戊二醛將樣品固定2 h，然后使用乙醇和叔丁醇脫水，最后在15 kV工作電壓下進行掃描。

1.2.2 菌體平均粒徑大小的測定 取1～2 ml 培養(yǎng)好的菌液，調(diào)節(jié)OD600=0.5，用純凈水洗滌2～3次，洗去剩余培養(yǎng)基。將菌體沉淀重懸于1 ml 純凈水中，加入樣品池后，進行平均粒徑的測定。

1.2.3 SDS-PAGE 蛋白電泳 用蛋白質(zhì)染料在100℃下處理OD600值約為2 的全細胞樣品（時長5 min），然后通過SDS-PAGE 電泳，分別用10%和4%的聚丙烯酰胺對凝膠進行分離和濃縮，利用pH 8.3的Tris-甘氨酸緩沖液作為電極緩沖液。Bio-Rad微型凝膠電泳裝置中，在室溫下每片20 mA 的恒流條件下，從陰極到陽極進行電泳，并用考馬斯藍R-250染色顯示蛋白。使用Labscan 6.0 圖像掃描儀掃描染色的凝膠,隨后利用Quantity One 軟件（Bio-Rad）分析，最后用牛血清白蛋白標準曲線計算標記物的蛋白含量。

1.2.4 鐵還原酶測定 收集不同應激條件下培養(yǎng)24 h 的菌液，調(diào)節(jié)OD600值約為2，將按9∶4 比例混合的磷酸鹽緩沖液（pH 7.0）與FeCl3溶液或檸檬酸鐵溶液用高純氮進行除氧處理。酶活測定體系設置：PBS 與FeCl3或檸檬酸鐵混合液195 μl，40 mmol/L Ferrozine（鐵酸鹽）15μl，40 mmol/L 甲酸鈉60μl，酶液30 μl，加入小試管中混勻后，于厭氧、室溫下靜置。從靜置起計時，于一定時間間隔取樣（樣品需先在14000 r/min，5 min條件下離心后取上清液），測其562 nm 波長下的吸光值，根據(jù)各時間點吸光值的變化，取線性變化范圍（線性增加）計算酶活。Fe(Ⅱ)-Ferrozine 絡合物的摩爾消光系數(shù)ε= 29000 L/(mol·cm)。

酶活計算公式為：

1.2.5 定量PCR 測定 以SXM 基因組為模板，對需要進行定量PCR 驗證的基因進行全長PCR，之后進行PCR 產(chǎn)物回收，采用凝膠純化試劑盒（Omega DNA）對PCR 產(chǎn)物進行直接回收。由于目的基因需用于定量PCR 實驗，根據(jù)下式計算拷貝數(shù)后，逐級稀釋至所需濃度并保存，拷貝數(shù)計算公式為：

將待測樣品進行RNA 提?。˙io-Rad 試劑盒）后，采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（ABI）進行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，將cDNA 及目的基因標準品同時進行定量PCR 實驗（Bio-Rad 試劑盒），并依據(jù)CT值及標準曲線計算樣品中目的基因的拷貝數(shù)。

2 實驗結(jié)果與討論

2.1 有機溶劑對SXM生長的影響

有機溶劑對細菌的主要作用部位為細胞膜。細菌的細胞質(zhì)膜是磷脂雙分子層，其中嵌入了多種維持細胞能量狀態(tài)、調(diào)節(jié)細胞內(nèi)環(huán)境、負責信號轉(zhuǎn)導和能量轉(zhuǎn)導的酶和轉(zhuǎn)運蛋白，而溶劑會進入并破壞雙分子層，從而損害細胞活力[24]。有機溶劑本身的性質(zhì)（與水的親和程度及結(jié)構等）則會對微生物細胞產(chǎn)生不同的影響。

為探究不同濃度有機溶劑對SXM 生長的影響，選取了八種有機溶劑及三種濃度進行生長曲線測試，具體結(jié)果如圖1 所示。實驗中選取的七種有機溶劑的性質(zhì)和不同應激條件下測得的比生長速率列于表1中，其中l(wèi)gP值指溶劑在等摩爾辛醇和水中的分配系數(shù)的對數(shù)值，即表示溶劑的疏水性，lgP值越小極性越大；反之，lgP值越大則極性越小。有研究表明，有機溶劑對細胞的危害與lgP值息息相關,且lgP值范圍在1～4 時對細菌毒性較大，這是因為lgP低于1 的溶劑通常親水性太強而無法進入細胞膜，而lgP高于4的溶劑疏水性太強而無法具有高水溶性，加之其不可生物利用性，故不會引起毒性作用[16,25-26]。

根據(jù)生長曲線結(jié)果，實驗所選取的有機溶劑對于SXM 的毒害作用順序為：正丁醇>叔丁醇>正丙醇>異丙醇>丙酮>DMSO>乙醇>甲醇，這一順序與溶劑lgP值順序一致，即在一定范圍內(nèi)溶劑的lgP值越大，對希瓦氏菌的毒害作用越大。本研究對lgP小于1 的幾種溶劑進行了測試，證實了在lgP值小于1的條件下，溶劑的疏水性也與其生物毒害性存在關聯(lián)。

本實驗中，當外加溶劑為親水性較差的丁醇時，其對SXM 的生長抑制作用明顯，而丁醇的同分異構體叔丁醇，由于其相較正丁醇親水性更好，所以對SXM 的生長影響也更小，SXM 的耐受程度仍可達2%。當外加溶劑為親水性較好的低級醇類、丙酮及DMSO 時，SXM 的耐受程度普遍較好。尤其對甲醇、乙醇、丙醇和異丙醇這四類親水性醇類有機溶劑，在外加溶劑濃度為2%時仍可正常生長，對甲醇的耐受程度甚至可以達到5%。在相同濃度下，SXM 對四種溶劑的耐受程度為甲醇>乙醇>異丙醇>丙醇，故在結(jié)構穩(wěn)定的低級醇類中，溶劑對SXM 生長造成的影響也可根據(jù)其親水性（即lgP值）作為初步判斷，親水性越高，對SXM的生長影響越小。

圖1 SXM在不同溶劑應激下的生長情況Fig.1 Growth curves of SXM in culture with different solvents at 30℃and 150 r/min in LB medium

作為實驗室常見的有機溶劑，丙酮在大氣化學中有一定的影響作用，故考察了丙酮對SXM 的生長影響情況。在低濃度（1%和2%）情況下，SXM 對丙酮的耐受程度較好，當濃度為5%時，雖然SXM 能在此條件下存活，但生長速率相較原始條件明顯降低，生長初期延滯效應顯著，直到培養(yǎng)時長超過12 h后才有較快生長。部分關于丙酮的文獻研究[27]表明，少數(shù)希瓦氏菌具有利用丙酮作為碳源或是生產(chǎn)丙酮的能力，但產(chǎn)量很低，僅為150 μmol/OD600，而5%的丙酮濃度遠大于其生產(chǎn)能力，因此只有在丙酮濃度較低時，SXM才能恢復生長。

DMSO 是希瓦氏菌的電子受體之一，也可作為細胞低溫保存時的保護劑。DMSO 在低濃度（1%和2%）情況下對SXM 的生長影響較小，SXM 的生長與原始狀態(tài)差異不大，當濃度為5%時，其OD600值仍可達到原始條件的60%以上，說明SXM 對DMSO 的耐受性較好。此外，在測定生長曲線的過程中，發(fā)現(xiàn)DMSO 被還原，并生成具有刺激性氣味的DMS，說明DMSO 被SXM 所利用。根據(jù)文獻[28]，希瓦氏菌MR-1對DMSO 的利用機制與對金屬異化還原的機制類似，二者均為細胞外進行的還原行為，因此推測細胞將DMSO 定義為不可溶的固體受體，選擇在胞外進行代謝。

2.2 有機溶劑對SXM細胞形態(tài)的影響

研究表明，有機溶劑對細胞的影響主要有滲透入細胞內(nèi)作用和在細胞膜表面發(fā)生作用兩個方面，為了探究對SXM 生長毒害作用較小的溶劑是否對其生物細胞膜有影響，采用SEM 分析SXM 細胞表面，結(jié)果如圖2 所示。同時測量了不同溶劑應激后SXM 的粒徑變化，結(jié)果列于表2，表中的PDI 數(shù)值表示溶液的分散性，值越大表明分散性越差。

根據(jù)SEM 圖像，原始的SXM 呈橢圓桿狀，在細胞之間有明顯的納米尺度的類菌毛絲狀。外加溶劑中，乙醇、丙酮和DMSO 對SXM 的形態(tài)沒有較大影響，丙醇和丁醇對SXM 的形態(tài)改變最為明顯。在丙醇應激情況下，SXM 細胞發(fā)生明顯形變，呈細長的條狀，最長可達10μm 以上。但丙醇對SXM 的生長速率影響較小，故認為丙醇與細胞膜發(fā)生作用并破壞了細胞膜的正常功能與形態(tài)，從而影響了細胞的分裂過程，導致其被拉長。在丁醇應激情況下，細胞不僅形態(tài)上由桿狀變?yōu)轭愃魄驙?，且大小也? μm 縮減至1 μm 左右，鑒于丁醇親水性較差，對SXM 的毒害作用也更為明顯，因此推測SXM 通過改變大小來應對丁醇的刺激。

由表2中數(shù)據(jù)可知，SXM 在丙醇應激下，粒徑明顯增大，且PDI 值顯著增加，說明溶液分散性變差；在丁醇應激下，粒徑明顯變小；其余外加溶劑的介入沒有對粒徑大小產(chǎn)生較大影響，均與SEM 圖像呈現(xiàn)結(jié)果一致。

表1 有機溶劑的性質(zhì)與SXM在不同溶劑培養(yǎng)下的比生長速率Table 1 Physical properties of different organic solvents and specific growth rate for SXM cultured in different solvents

表2 有機溶劑應激下SXM的粒徑變化Table 2 Particle size distribution of SXM under cultured in different organic solvents

值得注意的是，將丙醇和丁醇應激條件下的SXM 培養(yǎng)12 h 后，重新接入新鮮的LB 培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h后，SXM可恢復到原貌，可認為在本研究的實驗條件下，丙醇和丁醇對SXM 造成的影響是可逆的，也可說明SXM 具有在不同環(huán)境下通過調(diào)控蛋白分泌等行為以適應環(huán)境的能力。

2.3 有機溶劑對SXM蛋白形態(tài)與分布的影響

為探究有機溶劑對SXM 影響的具體機制，對其在各有機溶劑應激下的全細胞和亞細胞的蛋白電泳進行分析，電泳結(jié)果如圖3所示，其中紅色箭頭指示的條帶為醇類應激后表達量明顯下調(diào)的蛋白，藍色箭頭指示的條帶為丙酮和丁醇應激后表達量明顯上調(diào)的蛋白，黃色箭頭指示的條帶為丙醇和丁醇應激后該區(qū)域逐漸變得不完整的蛋白，可以看到丙醇和丁醇應激下的蛋白形態(tài)與表達都有了明顯的變化。根據(jù)SDS-PAGE 結(jié)果，選取差異蛋白進行MALDI-TOF/TOF 質(zhì)譜鑒定，表3 為差異蛋白的質(zhì)譜鑒定結(jié)果，經(jīng)過質(zhì)譜鑒定、MASCOT數(shù)據(jù)庫匹配后得到的蛋白均具有較高的分數(shù)，這一分數(shù)代表鑒定結(jié)果的可靠性，分數(shù)越高則結(jié)果越可信。本次鑒定結(jié)果的分數(shù)均在300 以上，部分結(jié)果更能達到1000 以上，說明質(zhì)譜鑒定得到的結(jié)果可信度極高。

根據(jù)圖3 和表3，TonB 受體、IucA/IucC 家族蛋白、磷酸葡糖酶亞基及含鐵乙醇脫氫酶四種蛋白在丙醇與丁醇應激下，表達量都表現(xiàn)出下調(diào)，而熱激蛋白90（Hsp90）與芳香烴降解膜蛋白表達量則上調(diào)；此外，丙醇與丁醇應激使得外膜蛋白OmpA 以及孔蛋白porin 的蛋白電泳形態(tài)被破壞，變得較不完整。Hsp90 作為普通應激機制中常出現(xiàn)的蛋白，在丙醇與丁醇應激之下表達量上調(diào)，證明SXM 對于這兩種醇類的脅迫作出了應激響應，結(jié)合前文所述的應激機制與SEM 觀測到的結(jié)果，說明丙醇應激下細胞被拉長以及丁醇應激下細胞縮小都是SXM 的一種應激機制。

TonB 受體、IucA/IucC 家族蛋白及含鐵乙醇脫氫酶三個蛋白都直接或間接參與了希瓦氏菌的鐵相關代謝途徑，而醇類應激之后這些蛋白的表達量有所下降，因此推測醇類應激之后，SXM 對于鐵的吸收、還原能力會受到一定抑制，為印證這一點，對不同溶劑下的SXM 鐵還原酶活力進行了測試，鐵還原酶是一類能還原非蛋白鐵復合體的酶，可利用NAD(P)H 作為電子供體將Fe3+復合體還原為Fe2+復合體，還原態(tài)的Fe2+隨后被含鐵蛋白所利用。如表4所示，SXM 的鐵還原酶活性在丙醇及丁醇應激下均大幅下降，這一結(jié)果與SDS-PAGE結(jié)果相符。

2.4 有機溶劑對SXM基因表達的影響

圖2 不同有機溶劑應激下SXM的掃描電鏡表征Fig.2 The SEM result of SXM bearing different solvents

圖3 不同應激條件下SXM的蛋白電泳分析（Ori：原始條件,P1、P2分別表示1%丙醇與2%丙醇,B1表示1%丁醇；箭頭所示蛋白均經(jīng)MALDI-TOF-TOF進行后續(xù)分析）Fig.3 SDS-PAGE profiles of SXM cultured at normal condition(Ori),1%n-propanol(P1),2%n-propanol(P2)and 1%n-butanol(B1)for whole cell and periplasm,respectively(The proteins indicated by the arrows were followed by MALDI-TOF-TOF)

一般微生物在有機溶劑的應激下，會改變基因表達以適應新的環(huán)境，例如大腸桿菌通過應力響應基因marA、robA和soxS的過表達以提高有機溶劑的耐受水平[22,29]。周質(zhì)（MtrA）、外膜（MtrB 和MtrC）和內(nèi)膜（CymA）c 型細胞色素的存在使希瓦氏菌能夠進行胞外電子傳遞，因此MTR 代謝路徑在希瓦氏菌進行金屬異化還原過程中起著關鍵作用[30]。蛋白電泳結(jié)果表明，在各類溶劑的應激下，SXM 的蛋白形態(tài)和表達均受到一定程度的影響，在丙醇應激的情況下，SXM 不僅在形態(tài)上出現(xiàn)可逆的大幅度的變化，且其熱激蛋白90等的表達也與正常SXM差別較大，含鐵乙醇脫氫酶的表達也受到一定抑制，同時鐵還原酶的活性也受到抑制。鑒于鐵的異化還原是希瓦氏菌的特征之一，因此猜測丙醇對MTR 途徑有一定影響。為進一步探究應激條件下基因水平的變化，對MTR 通道的三個基因mtrA、mtrB及mtrC進行了絕對定量PCR，基因的標準曲線及不同溶劑應激下的基因表達量如圖4 所示。在丙醇應激下，mtrA、mtrB與mtrC基因的表達量較原始狀態(tài)均有提高，提高量分別為13.3%、34.4%和147.6%。

為進一步解釋丙醇應激產(chǎn)生的影響，依據(jù)定量PCR 結(jié)果推測了蛋白的變化，推測示意圖如圖5 所示。MtrB與MtrC均是與細胞外膜相結(jié)合的蛋白，而丙醇應激之后細胞的形態(tài)被拉長，因此需要更多的外膜蛋白以維持細胞外膜的完整性，mtrB及mtrC基因的表達量提高，可能帶來了MtrB 及MtrC 蛋白的豐度提高，有利于維持細胞外膜的完整性以及維持SXM 在這一應激之下電子傳遞的穩(wěn)定性。而mtrC基因的提高量遠遠大于其他基因，可能原因為MtrC蛋白是直接與外界電子受體相作用的蛋白，因此mtrC基因的大幅提高可能代表MtrC 蛋白的表達大幅增加，從而增強菌體與外界的電子傳遞，彌補由于鐵還原酶活性降低造成的電子傳遞效率不足。此外，由于丙醇應激下，mtrA雖有提高，但提高量遠遠小于mtrB及mtrC，因此推測MtrA 蛋白的提高量有限，導致電子由細胞周質(zhì)傳遞至細胞外膜這一過程受到了限制，因此與外界的電子傳遞并未增強，與鐵還原酶的酶活受到抑制這一結(jié)果亦是相符合的。

表3 醇類應激下SXM產(chǎn)生的差異蛋白Table 3 Mascot protein identification of differential proteins produced by SXM under cultured in different alcohols

表4 不同溶劑應激時SXM的鐵還原酶酶活Table 4 Fe reductase activities of SXM bearing different solvents

3 結(jié) 論

本研究考察了SXM 在八種不同有機溶劑下的耐受性，主要結(jié)論如下。

圖4 MTR通道基因的標準曲線與不同溶劑應激下基因的表達量Fig.4 The quantification real time PCR(qRT-PCR)standard curves of genes of MTR pathway(mtrA,mtrB and mrtC)and gene expression level under solvent stress

圖5 不同培養(yǎng)條件下MTR通道變化的推測示意圖Fig.5 Proposed mechanism of electrons transfer through the outer membrane associated proteins (MtrA,MtrB and MtrC)under LB medium and 2%n-propanol in LB respectively

（1）可根據(jù)溶劑的親水性（lgP值）初步判斷SXM 對各溶劑的耐受性，SXM 對甲醇、乙醇、丙酮及DMSO 可耐受5%的濃度，對丙醇、異丙醇及叔丁醇可耐受2%的濃度，對于丁醇僅能耐受1%的濃度。不同有機溶劑對SXM 的形態(tài)與大小影響不同，丙醇應激下菌體被明顯拉長，至少達到4～5μm，而丁醇應激下菌體則明顯縮小，平均僅為1μm 左右，且變化是可逆的。

（2）在醇類應激下，SXM 通過調(diào)整蛋白的表達量來維持細胞的正常功能，TonB 受體、IucA/IucC 家族蛋白、磷酸葡糖酶亞基及含鐵乙醇脫氫酶四個蛋白在醇類應激下表達量明顯下調(diào)，熱激蛋白90在丙醇與丁醇應激下表達量上調(diào)；丙醇及丁醇脅迫下，鐵還原酶的活性收到抑制。

（3）丙醇對于MTR 通道相關基因的表達量有明顯影響，丙醇應激下mtrB與mtrC基因的表達量顯著提升，分別提高了34.4%和147.6%。根據(jù)蛋白電泳與定量PCR 的結(jié)果，對丙醇應激下的MTR 通道變化進行了推測，根據(jù)mtrB及mtrC基因表達量上調(diào)與丙醇應激造成的影響，推測在SXM 中MtrB 及MtrC蛋白與細胞形態(tài)等具有一定關聯(lián)。