楊瑞雄，鄭鑫，陸濤，趙譽澤，楊慶華，盧英華，2，3，何寧，2，凌雪萍，2，3

（1 廈門大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，福建廈門361005； 2 福建省海洋生物資源開發(fā)利用協(xié)同創(chuàng)新中心，福建廈門361005；3 福建省化學(xué)生物學(xué)重點實驗室（廈門大學(xué)），福建廈門361005）

引 言

ω-3型多不飽和脂肪酸對健康的重要性已在臨床和流行病學(xué)研究中得到充分證實，其中備受關(guān)注的有二十碳五烯酸（EPA,C20:5）和二十二碳六烯酸（DHA,C22:6）[1]。作為脂質(zhì)的重要組成部分[2]，EPA可以調(diào)控生物膜的結(jié)構(gòu)與功能，并通過降低血纖維蛋白水平和低密度脂蛋白水平來預(yù)防心血管疾病[3]，例如腦血栓、動脈粥樣硬化[4]。深海魚油是目前多不飽和脂肪酸（polyunsaturated fatty acids，PUFAs）工業(yè)化生產(chǎn)的主要來源，但自然資源的匱乏以及較高的分離成本導(dǎo)致其供不應(yīng)求[5]。因為魚油中豐富的PUFAs 通過食物鏈積累而來，所以藻類、低級真菌以及海洋細(xì)菌等微生物才是PUFAs 的初始來源[6]。El Razak 等[7]從地中海、紅海等地篩選了250 株海洋細(xì)菌，通過響應(yīng)面等方法進(jìn)行培養(yǎng)基優(yōu)化后EPA 的最大產(chǎn)量達(dá)到45 mg/L。Zhang 等[8]通過優(yōu)化希瓦氏菌的培養(yǎng)條件以及培養(yǎng)基成分等使得EPA 的 產(chǎn) 量 達(dá) 到30 mg/g。Chen 等[9]對 菱 形 藻（Nitzschia laevis）進(jìn)行高密度培養(yǎng)，在最大細(xì)胞干重達(dá) 到22.1 g/L 的 基 礎(chǔ) 上，EPA 產(chǎn) 量 達(dá)695 mg/L。Wang 等[10]研究的破囊壺菌基因工程菌株通過發(fā)酵罐補料分批發(fā)酵后EPA 產(chǎn)量達(dá)到2.7 g/L。由此可見，利用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)EPA 將成為未來的主要發(fā)展趨勢。

近年來，研究者們不斷探索PUFAs 的合成機理，PKS 途徑被認(rèn)為是主要用來合成PUFAs 的途徑[11]，進(jìn)而研究通過替換不同微生物中PKS 基因簇上的基因來增加PUFAs 的含量。Hayas hi 等[12]將Photobacterium profundum的PKS 基因簇上部分基因與Aureispira marina的PKS 基因簇上對應(yīng)基因相互置換，發(fā)現(xiàn)ORFC和ORFB上的脫氫酶（dehydratase，DH）基因在花生四烯酸（arachidonic acid，ARA）的合成中起關(guān)鍵作用。Ren 等[13]通過在Schizochytriumsp. HX-308 中敲入Shewanella的?；D(zhuǎn)移酶（Acyltransferase，AT）基因，EPA 占比提高3.7 倍。Matsuda 等[14]敲除破囊壺菌中的Δ12 脫飽和酶基因后，傳統(tǒng)脂肪酸合成途徑（fatty acid synthase，F(xiàn)AS）受阻，而PKS 途徑合成的PUFAs 含量增加。以上研究表明基因工程調(diào)控脂肪酸合成相關(guān)途徑對改善油脂的組成是可行的，可以進(jìn)一步提高PUFAs 的產(chǎn)量。

裂殖壺菌具有生長繁殖快、耐受機械攪拌和可異養(yǎng)培養(yǎng)等特點，非常適宜發(fā)酵罐大規(guī)模培養(yǎng)。裂殖壺菌的油脂含量可達(dá)細(xì)胞干重的40%～70%，PUFAs占比達(dá)30%～50%，其中DHA占比30%～40%，但EPA 含量較低[15]。研究表明，裂殖壺菌的脂肪酸合成主要通過兩個途徑，分別是需氧的FAS 途徑和厭氧的PKS 途徑[16]。Wallis 等[17]從裂殖壺菌PKS 基因簇中分離了三個閱讀表達(dá)框（ORF A-C），其中包含8個功能不同的基因（圖1）。其中ER基因所表達(dá)的烯酰還原酶主要催化不飽和C====C 鍵還原成飽和的C—C 鍵，使底物烯酰-ACP 還原成?；?ACP，是從頭合成脂肪酸的最后一步[18]。Heath 等[19]首次提出ER主要作用于大腸桿菌中的反式-烯酰-ACP，將其還原為酰基-ACP。ER基因在PKS 基因簇中包含兩個部分，分別位于ORFB上（ORFB-ER）和ORFC上（ORFC-ER）（圖1）[19]。Ling 等[20]利用基因工程手段對兩個ER基因的功能進(jìn)行了驗證，結(jié)果表明ORFB-ER基 因 在Schizochytrium limacinumSR21 的PUFAs 合成中起著關(guān)鍵作用，而ORFC-ER基因則更多地和飽和脂肪酸（SFAs）的合成及細(xì)胞生長相關(guān)；此外，研究還發(fā)現(xiàn)ORFC-ER基因轉(zhuǎn)錄水平的降低有利于Schizochytrium limacinumSR21 細(xì)胞內(nèi)油脂的積累。Lee 等[21]將希瓦氏菌屬的Shewanellasp.SCRC2738 菌株中完整的PKS 基因簇重組表達(dá)在大腸桿菌中，在提取的總脂肪酸中成功檢測到了EPA。Metz 等[22]提出希瓦氏菌PKS 基因簇中的ER基因與肺炎鏈球菌FAS 合成途徑的FabI基因具有高度同源性。因此，ER基因可能是PKS 途徑和FAS途徑的重要中樞基因，在PUFAs 的合成中發(fā)揮重要作用。

圖1 希瓦氏菌、裂殖壺菌SR21、B-sh-ER菌株和C-sh-ER菌株中的PKS基因簇Fig.1 PKS gene clusters of Shewanella sp.SCRC2738,Schizochytrium limacinum SR21,B-sh-ER strain and C-sh-ER strain

希瓦氏菌Shewanella在低溫、高壓條件下生長時，EPA 作為細(xì)胞內(nèi)唯一的PUFA，含量可達(dá)20%左右。因此，希瓦氏菌中的PKS 基因簇（圖1）被認(rèn)為主要催化合成EPA[6]。ER基因存在于希瓦氏菌PKS基因簇的ORFD結(jié)構(gòu)域上，表達(dá)的烯酰還原酶對反式-2-烯基-ACP 中間體的雙鍵進(jìn)行NADPH 依賴的還原，該反應(yīng)是合成EPA 的關(guān)鍵步驟[1]。目前已有研究學(xué)者將希瓦氏菌屬的Shewanellasp. SCRC 2738、MR-1、MAC1 等菌株中完整的EPA 基因簇導(dǎo)入至大腸桿菌中表達(dá)，成功地通過PKS 途徑合成了EPA[23]。其中，Lee 等[24]在大腸桿菌中異源表達(dá)希瓦氏菌（Shewanella oneidensisMR-1）EPA 合成基因簇，EPA 產(chǎn)量能達(dá)到總油脂的0.689%。美國杜邦公司在解脂酵母（Yarrowia lipolytica）中完整構(gòu)建了FAS途徑的十八碳二烯酸至二十碳五烯酸合成通路，使PUFAs占總油脂的70%以上[25]。通過在EPA生物合成途徑中過表達(dá)不同的去飽和酶和延長酶，Yarrowia lipolytica的EPA 在總油脂中占比超過25%[26]。 在 聚 球 藻Synechococcus中 異 源 表 達(dá)Shewanella的PUFAs 合成基因簇，EPA 的產(chǎn)量也明顯提高[27]。對于PUFAs的合成來說，大腸桿菌、酵母以及微藻等微生物菌種相比于裂殖壺菌不具備天然的優(yōu)勢，而且單一菌株插入多個外源基因在穩(wěn)定性上也不盡人意。因此，本研究將SchizochytriumlimacinumSR21 的高油脂含量與Shewanellasp.SCRC2738 較強的PKS 基因簇相結(jié)合，利用同源重組技術(shù)將Shewanellasp. SCRC2738 的ER基因分別敲入Schizochytrium limacinumSR21 的ORFB-ER基因和ORFC-ER基因中，使Shewanellasp.SCRC2738的ER基因代替原宿主的ER基因發(fā)揮作用，對重組菌株脂肪酸成分以及相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行分析，探究sh-ER基因在裂殖壺菌PUFAs 合成中的功能。

1 實驗材料和方法

1.1 工具酶與試劑

大腸桿菌Trans110感受態(tài)細(xì)胞、EasyScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix 試劑盒和TransStart Top Green QPCR 試劑盒購買于北京全式金生物有限公司。質(zhì)粒小提試劑盒、普通DNA 產(chǎn)物純化試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA 回收試劑盒、SuperMix MiniBEST 通用RNA 提取試劑盒和限制性內(nèi)切酶購自寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司。十七烷酸甲酯、博來霉素和脂肪酸混合標(biāo)準(zhǔn)品購自Sigma 公司。正己烷和三氟化硼乙醚購自阿拉丁試劑有限公司。

1.2 菌種和培養(yǎng)基

本研究從美國典型培養(yǎng)物保藏中心（ATCC，USA）獲 取Schizochytrium limacinumSR21 菌 株。pTEF1/Zeo 載體和pMD19T-easey 載體購自英駿公司（Invitrogen,USA）。

LB 培養(yǎng)基（氨芐）用于大腸桿菌培養(yǎng)及轉(zhuǎn)化子篩選。裂殖壺菌種子培養(yǎng)基用于SchizochytriumlimacinumSR21 常規(guī)培養(yǎng)[20]。含博來霉素種子培養(yǎng)基用于裂殖壺菌轉(zhuǎn)化子篩選[28]。發(fā)酵培養(yǎng)基用于Schizochytrium limacinumSR21發(fā)酵生產(chǎn)脂肪酸[29]。

1.3 發(fā)酵培養(yǎng)

種子液制備：取裂殖壺菌種子在固體種子培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，在28℃條件下培養(yǎng)36 h。在已培養(yǎng)好的固體種子培養(yǎng)基上挑選形態(tài)飽滿的單菌體，置于50 ml 種子培養(yǎng)基中，在28℃，250 r/min 條件下培養(yǎng)24 h。

搖瓶發(fā)酵：從二級種子培養(yǎng)基中，按照6%的接種量，轉(zhuǎn)移一定量種子培養(yǎng)液至50 ml 發(fā)酵培養(yǎng)基中，在28℃，250 r/min條件下培養(yǎng)120 h。

發(fā)酵罐擴大培養(yǎng)：本實驗采用補料分批發(fā)酵的方法，采用5 L 發(fā)酵罐（Winpact，USA）進(jìn)行擴大培養(yǎng)，初始葡萄糖濃度為60 g/L，轉(zhuǎn)速為300 r/min，通氣量為4 vvm，培養(yǎng)溫度保持為28℃，pH 維持7.5。初始溶氧設(shè)定為100%，根據(jù)發(fā)酵過程中溶氧情況逐級提高，最大至700 r/min。

1.4 菌株構(gòu)建

如圖2 所示構(gòu)建替換Schizochytrium limacinumSR21 中ORFB-ER和ORFC-ER基因的敲入載體。將合成的希瓦氏菌ER基因（sh-ER）表達(dá)框（TEF1啟動子、sh-ER基因、CYC1 終止子）克隆到pMD19T Easy Vector 中進(jìn)行擴增，并命名為pMD-sh-ER。使用BamHI 和PstI 限 制 酶 對 pMD-sh-ER和pBlueZEO-B 載體雙酶切后使用T4 連接酶在16 ℃過夜連接，產(chǎn)生重組敲入載體pBlueZEO-B-sh-ER。使用相同的方法構(gòu)建pBlueZEO-C-sh-ER載體。

根據(jù)Ling 等[20]報道的方法，通過電轉(zhuǎn)化將構(gòu)建的兩個載體線性化后轉(zhuǎn)化并重組到裂殖壺菌基因組上。制備好的裂殖壺菌感受態(tài)細(xì)胞經(jīng)過電穿孔后，在含有1 mol/L 山梨糖醇的種子培養(yǎng)基中于28℃培養(yǎng)2～3 h。將回收的細(xì)胞在含有30 mg/L博來霉素的固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)3～5 d。最后，將在含博來霉素平板上生長出的陽性敲入菌株在28℃，250 r/min 下培養(yǎng)，并進(jìn)行PCR驗證和發(fā)酵實驗。

1.5 生物量和總油脂測定

生物量通過重量法測定法[28]。將1 ml發(fā)酵液轉(zhuǎn)移至預(yù)先稱重的離心管中，然后以10000g離心2 min。沉淀用去離子水洗滌兩次，在-50℃凍干至恒重約24 h，最后稱量干細(xì)胞重量。

圖2 B-sh-ER載體構(gòu)建（a）;C-sh-ER載體構(gòu)建（b）Fig.2 Construction of B-sh-ER vector(a);Construction of C-sh-ER vector(b)

脂質(zhì)提取方法為正己烷提取法[28]。將3 ml發(fā)酵液轉(zhuǎn)移到離心管中，加入4 ml 12 mol/L 濃鹽酸混合，然后將混合溶液在65℃水浴中反應(yīng)50 min。最后將反應(yīng)后的混合物用4 ml 正己烷萃取數(shù)次直至上清無色，收集上清后氮氣吹干至恒重，65℃烘箱干燥2 h后稱量總油脂重量。

1.6 脂肪酸組分分析

根據(jù)文獻(xiàn)[30]報道的方法制備脂肪酸甲酯并進(jìn)行了一些修改。首先，5 ml 0.5 mol/L 氫氧化鉀-甲醇溶液溶解提取的總油脂，65℃的水浴中皂化10 min后加入三氟化硼乙醚甲酯化。冷卻至室溫后，以十七烷酸甲酯作為內(nèi)標(biāo)，將脂肪酸甲酯樣品于配備有100 m × 0.25 mm 毛細(xì)管柱（SP-2560，USA）的氣相色譜儀（Agilent GC 7890，USA）中進(jìn)行分析。

1.7 葡萄糖濃度測定

將1 ml 發(fā)酵液10000g離心2 min，收集上清液以測量葡萄糖濃度。葡萄糖濃度通過3,5-二硝基水楊酸（DNS）方法測定[31]。

1.8 實時定量PCR分析

使用MiniBEST 通用RNA 提取試劑盒提取菌體中總RNA 后，通過Easy-Script First-Strand cDNA Synthesis SuperMix 試劑盒以總RNA 為模板反轉(zhuǎn)錄制備cDNA。將獲得的cDNA 稀釋至100 ng/μl，使用Trans-Start Top Green QPCR SuperMix 配置RT-PCR反應(yīng)體系并通過Step-One 實時PCR 系統(tǒng)（Applied Biosystems，China）檢測基因的轉(zhuǎn)錄水平。無cDNA模板的反應(yīng)用作陰性對照，肌動蛋白（ACT）基因作為參照對mRNA 的表達(dá)水平進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，并使用2-ΔΔCT法計算相對基因表達(dá)水平[32]。表A1 列出用于RT-qPCR的引物。

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析

通過t值檢驗顯示重組敲入菌株和野生型菌株之間的統(tǒng)計學(xué)顯著性差異。P< 0.05(a)表示顯著性差異；P< 0.01(b)表示極顯著性差異。每個實驗均設(shè)有三組生物學(xué)重復(fù)，兩組技術(shù)重復(fù)以保證數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，數(shù)值均表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差的形式。

2 實驗結(jié)果與討論

2.1 S.limacinum SR21 sh-ER基因敲入菌株構(gòu)建

重組敲入質(zhì)粒如圖2 所示，包含sh-ER基因的上下游同源臂，博來霉素表達(dá)框（TEF1啟動子，博來霉素基因和CYC1終止子）和sh-ER表達(dá)框（TEF1啟動子，sh-ER基因和CYC1 終止子）。利用博來霉素基因作為篩選標(biāo)記，將敲入質(zhì)粒線性化后分別電轉(zhuǎn)進(jìn)入Schizochytrium limacinumSR21 中。如圖3 所示，在含有30 mg/L 博來霉素的平板上分別挑取Bsh-ER敲入（sh-ER基因敲入ORFB-ER）和C-sh-ER敲入（sh-ER基因敲入ORFC-ER）的陽性重組菌株。在兩種陽性重組菌株的基因組中均成功檢測到與部分博來霉素抗性表達(dá)框相對應(yīng)的649 bp 片段，而在野生型菌株中未檢測到（圖4）。這表明sh-ER基因已成功敲入Schizochytrium limacinumSR21 的ORFB-ER和ORFC-ER基因中。

2.2 重組菌株的生物量和總油脂含量分析

如圖5(a)所示，對于B-sh-ER敲入菌株，細(xì)胞前期生長緩慢，72 h后生長加快。在發(fā)酵144 h前生物量均低于野生型菌株，而發(fā)酵后期（144 h之后）細(xì)胞生物量與野生型菌株接近。分析認(rèn)為sh-ER基因片段與ORFB-ER基因片段大小接近，但由于異源基因在細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)需要一定的適應(yīng)期[33]，所以Bsh-ER敲入菌株的細(xì)胞生長周期較野生型菌株明顯延長。如圖5(b)、(c)所示，B-sh-ER敲入菌株總油脂含量在發(fā)酵中前期低于野生型菌株，而在發(fā)酵168 h時，總油脂基本與野生型菌株持平，而重組菌株的油脂含量高于野生型菌株9.38%（P< 0.05）。上述結(jié)果表明，sh-ER基因的敲入雖然降低了菌體生長速率，但最終補償了ORFB-ER基因的功能，使得Bsh-ER敲入菌株的生物量與總油脂恢復(fù)至野生型菌株的水平，同時提高了菌體合成油脂的能力。

圖3 含博來霉素抗性平板上生長的野生型菌株（a），B-sh-ER 菌株（b）和C-sh-ER菌株（c）Fig.3 Wild strains(a),B-sh-ER strains(b)and C-sh-ER strains(c)grown on media containing zeocin

圖4 B-sh-ER菌株中博來霉素表達(dá)框的基因組PCR(a);C-sh-ER菌株中博來霉素表達(dá)框的基因組PCR(b)Fig.4 Genomic PCR of zeocin expression cassette in the B-sh-ER strains(a);Genomic PCR of zeocin expression cassette in the C-sh-ER strains(b)

如圖5(d)所示，C-sh-ER敲入菌株生物量相對于野生型菌株降低18.82%（P<0.05），與Ling等[20]構(gòu)建的ORFC-ER敲除菌株的細(xì)胞生長相似，表明敲入sh-ER基因替換原有的ORFC-ER并沒有補償ORFC-ER基因?qū)w生長的影響，導(dǎo)致敲入菌株生物量沒有恢復(fù)到正常水平。如圖5(e)所示，C-sh-ER敲入菌株總油脂產(chǎn)量較野生型菌株降低34.51%，但由于C-sh-ER敲入菌株生物量的降低，導(dǎo)致單位細(xì)胞油脂產(chǎn)量[圖5（f）]與野生型菌株一致。而Ling等[20]報道的ORFC-ER敲除菌株總油脂產(chǎn)量在發(fā)酵后期與野生型菌株基本持平，并且單位細(xì)胞油脂含量較野生型菌株高19.70%。這說明sh-ER基因在該位置敲入不能發(fā)揮ORFC-ER基因?qū)w生長的作用，同時對油脂合成產(chǎn)生了一定的抑制。Ren等[34]發(fā)現(xiàn)在Schizochytriumsp.中異源表達(dá)ω-3 去飽和酶和過表達(dá)乙酰輔酶A 合成酶后，生物量都明顯降低，這可能與引入外源基因后細(xì)胞負(fù)擔(dān)增加有關(guān)。本研究結(jié)果與上述結(jié)果類似，sh-ER基因片段較ORFC-ER基因片段長一些，可能增大了菌株的蛋白表達(dá)負(fù)荷[35]。除此之外，ORFC-ER基因更多地與細(xì)胞生長和飽和脂肪酸（saturated fatty acids，SFAs）合成相關(guān)，而sh-ER基因則更多地與PUFAs尤其是EPA 的合成相關(guān)[20]，因此導(dǎo)致sh-ER基因的敲入不能補償ORFC-ER基因的功能。

2.3 重組菌株脂肪酸成分分析

如表1 所示，B-sh-ER敲入菌株的單不飽和脂肪酸（monounsaturated fatty acid, MUFAs）如C14∶1含量相比于野生型菌株增加了95.02%（P< 0.05），文獻(xiàn)報道MUFAs 的碳碳雙鍵能夠提高細(xì)胞膜的流動性[36]，因此MUFAs 的增加是細(xì)胞在敲入基因的壓力下為了維持細(xì)胞膜的流動性造成的。對于PUFAs 來說，B-sh-ER敲入菌株的DHA 含量雖然由29.76%下降到27.63%，但是EPA 含量提高了85.71%（P<0.01），達(dá)到0.78%；EPA/DHA 的百分含量增加了77.02%（P<0.01）。這些結(jié)果表明，B-sh-ER敲入菌促進(jìn)了EPA 的合成通路，提高了EPA 的合成能力。分析認(rèn)為sh-ER主要傾向于合成EPA[37]，而裂殖壺菌的ORFB-ER在細(xì)胞內(nèi)主要用于合成PUFAs[38]。因此，接下來主要研究B-sh-ER敲入菌的相關(guān)代謝變化。

而對于C-sh-ER敲入菌株，SFAs 的占比增加，而包括DHA、DPA 和EPA 在內(nèi)的PUFAs 的含量降低，EPA/DHA 的百分含量基本保持不變，甚至略有降低。文獻(xiàn)報道，PUFAs 主要是通過PKS 途徑合成的，而SFAs 主要是通過FAS 途徑合成的[38]，兩者都需要以乙酰輔酶A 為底物，以ATP 為能量，以NADPH 為 還 原 力[39]，這 表 明sh-ER敲 入 替 換ORFC-ER使 更 多 的ATP 和NADPH 流 向SFAs 合成，與Ling 等[20]對ORFC-ER基因結(jié)構(gòu)域功能鑒定結(jié)果一致。

2.4 B-sh-ER敲入菌株相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平分析

如 圖6（a）、（b）所 示，B-sh-ER敲 入 菌 株 中ORFB-ER基因在發(fā)酵過程中相比于野生型菌株均下調(diào)表達(dá)，60 h 時表達(dá)水平降低78.73%（P<0.05），同時敲入的sh-ER基因均呈現(xiàn)上調(diào)表達(dá)趨勢，60 h時上調(diào)表達(dá)接近30 倍（P< 0.01），這進(jìn)一步驗證了B-sh-ER重組敲入菌株構(gòu)建的準(zhǔn)確性，為后續(xù)實驗奠定了基礎(chǔ)。如圖6(c)所示，重組菌中ORFC-ER基因的轉(zhuǎn)錄水平整體呈現(xiàn)上調(diào)趨勢，Ling 等[20]通過敲除Schizochytrium limacinumSR21 基因組中ORFCER基因的方式來驗證其功能發(fā)現(xiàn)該基因與SFAs 的合成以及菌體生長密切相關(guān)，因此B-sh-ER生物量的增加以及C16:0 和C18:0 等飽和脂肪酸含量提高與ORFC-ER基因上調(diào)表達(dá)相關(guān)。如圖6(d)所示，重組菌中AT 基因轉(zhuǎn)錄水平在84 h 提高接近20 倍（P<0.01）。AT 是一類酰基轉(zhuǎn)移酶，能夠為PKS 途徑合成PUFAs 提供底物[29]，Ren 等[13]針對AT 基因的替換研究發(fā)現(xiàn)酰基轉(zhuǎn)移酶對其他脂肪酸組分影響不顯著，但EPA的含量卻明顯增加，這說明了sh-ER敲入對ORFB-ER的替換促進(jìn)了AT 基因的上調(diào)表達(dá)，進(jìn)一步促進(jìn)了EPA的合成。

圖5 野生型菌株和B-sh-ER菌株中生物量（a），總油脂量（b）和油脂含量（c）；野生型菌株和C-sh-ER菌株生物量（d）、總油脂量（e）和油脂含量（f）Fig.5 Biomass(a),total lipids yield(b)and lipids content(c)in the wild strain and B-sh-ER strains;Biomass(d),total lipids yield(e)and lipids content(f)in the wild strain and C-sh-ER strains

2.5 B-sh-ER敲入菌株的補料分批發(fā)酵

通過以上生物量、總脂質(zhì)和脂肪酸組成的分析，可以發(fā)現(xiàn)B-sh-ER敲入菌株在維持正常生物量的同時，使得總油脂和EPA 含量均增加。因此，將B-sh-ER敲入菌株在5 L 發(fā)酵罐中進(jìn)行補料分批發(fā)酵。

如圖7 所示，B-sh-ER敲入菌株顯示在保持與野生型菌株生長速率一致的前提下細(xì)胞生長周期明顯延長，最終生物量達(dá)到159.70 g/L，高于野生型菌株42.46%[圖8(a)]。同時，在B-sh-ER敲入菌株中，葡萄糖顯示出更快的消耗速率，總油脂和EPA產(chǎn)量分別增加了28.70%和71.6%，達(dá)到73.24 g/L 和732.40 mg/L[圖8(b)、(c)]。B-sh-ER敲入菌株的EPA/DHA 的百分含量在整個補料分批發(fā)酵過程中均高于野生型菌株，并且在發(fā)酵終點提高了76.1%[圖8(e)]，而B-sh-ER敲入菌株的最終DHA 產(chǎn)量與野生型菌株相比變化不明顯[圖8(d)]。脂肪酸組成的進(jìn)一步分析如表2 所示，B-sh-ER敲入菌株與野生型菌株相比C16:0 含量從49.54%增加到57.40%，同時，PUFAs、DHA 和DPA 含量分別降低了24.4%、24.4% 和29.3%。但是，B-sh-ER敲入菌株中的EPA 比例（占總脂質(zhì)的1.0%）比野生型菌株高出33.3%。

表1 野生型菌株、B-sh-ER菌株和C-sh-ER菌株脂肪酸組成Table 1 Fatty acid composition of wild strains，C-sh-ER strains and B-sh-ER strains

表2 補料分批發(fā)酵野生型菌株和B-sh-ER菌株的脂肪酸組成Table 2 Fatty acid composition of the wild strain and B-sh-ER strain in fed-batch fermentation

圖6 B-sh-ER菌株相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平分析(a)裂殖壺菌烯酰還原酶基因ORFB-ER;(b)希瓦氏菌烯酰還原酶基因sh-ER;(c)裂殖壺菌烯酰還原酶基因ORFC-ER;(d)?；D(zhuǎn)移酶(AT)基因Fig.6 The transcription level of related gene in B-sh-ER strain(a)Schizochytrium limacinum SR21 enoyl-reductase gene ORFB-ER;(b)Shewanella sp.SCRC2738 enoyl-reductase gene sh-ER;(c)Schizochytrium limacinum SR21 enoyl-reductase gene ORFC-ER;(d)acyl transferase(AT)gene

圖7 野生型菌株(a)和B-sh-ER菌株(b)在5 L發(fā)酵罐中分批補料發(fā)酵生長曲線Fig.7 Growth curves of fed-batch fermentation in 5 L fermentator by wild strain(a)and B-sh-ER strain(b)

表3 相關(guān)菌株EPA產(chǎn)量及占比Table 3 EPA yield and proportion of related strains

表3中列出了目前用于EPA 生產(chǎn)菌株的產(chǎn)量以及總脂肪酸中EPA 的占比，主要有破囊壺菌屬、微藻以及高山被孢霉。破囊壺菌屬由于具有高生物量以及高油脂含量的特點，因此在PUFAs 合成方面潛力巨大。目前針對破囊壺菌屬調(diào)控PUFAs 合成的主要方式以基因工程和代謝工程為主，但是在獲得較高EPA 占比的條件下細(xì)胞的生長會受抑制。Cui 等[43]指出過表達(dá)六磷酸葡萄糖脫氫酶（G6PDH）導(dǎo)致破囊壺菌PUFAs占比增加10.60%，但是細(xì)胞生長和油脂合成受到嚴(yán)重影響。微藻的油脂中也含有豐富的PUFAs，光合作用菌株紫球藻（Porphyridium cruentum）中EPA 占總脂肪酸的41%[44]；而根據(jù)栽培條件不同，三角褐指藻（Phaeodactylum tricornutum） 和 微 綠 球 藻（Nannochloropsissp.）中EPA 的積累占總脂肪酸的比例可分別高達(dá)57%[45]和68%[46]。產(chǎn)油微藻的培養(yǎng)方式以異養(yǎng)為主，因此影響微藻PUFAs 積累的主要因素是培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基成分。高山被孢霉油脂中PUFAs 的占比較大，但由于生物量的限制，無法進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)。Shi 等[41]指出Δ6 去飽和酶的過表達(dá)使得Mortierella alpinaATCC 32222 在培養(yǎng)基中添加前體的情況下EPA 產(chǎn)量增加26.2 倍，達(dá)到588.5 mg/L。相比于以上所述的基因工程菌株，本研究構(gòu)建的B-sh-ER敲入菌株在提高生物量同時，EPA 的占比也大幅度提升，對于EPA 的工業(yè)化生產(chǎn)有一定的借鑒意義。在后續(xù)的研究中，將結(jié)合菌株培養(yǎng)條件以及培養(yǎng)基成分的優(yōu)化進(jìn)一步提高EPA 的產(chǎn)量。

3 結(jié) 論

本研究根據(jù)前期對ER 基因功能的鑒定，選擇了將Shewanellasp.SCRC2738PKS基因簇上的ER基因和具有高產(chǎn)PUFAs 潛力的Schizochytrium limacinumSR21 的ER基因相結(jié)合進(jìn)行研究：在Schizochytrium limacinumSR21 的ORFC-ER基 因 和ORFB-ER基因的位置分別敲入sh-ER基因進(jìn)行替換，進(jìn)一步研究ER基因功能的同時，提高EPA 的產(chǎn)量。B-sh-ER敲入菌株相比于野生型菌株油脂產(chǎn)量提高9.38%（P< 0.05），其中EPA 占比增加最為顯著，提高了85.71%（P<0.01），達(dá)到0.78%；而C-sh-ER敲入菌株單位細(xì)胞油脂含量可以恢復(fù)到野生型菌株的水平，但由于細(xì)胞生長受到嚴(yán)重抑制，因此菌株總油脂產(chǎn)量明顯降低。B-sh-ER敲入菌株的發(fā)酵罐補料分批發(fā)酵結(jié)果表明B-sh-ER敲入菌株最大生物量高于野生型菌株42.46%，總油脂和EPA產(chǎn)量分別增加了28.70%和71.6%，達(dá)到73.24 g/L 和732.40 mg/L。根據(jù)相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平的測定發(fā)現(xiàn)，在裂殖壺菌的ORFB-ER基因上敲入sh-ER基因有利于協(xié)同PKS 途徑基因的表達(dá)，促進(jìn)PUFAs 尤其是EPA的合成。B-sh-ER敲入菌株的構(gòu)建為PUFAs合成的調(diào)控提供了新的思路，為EPA 的工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。

圖8 野生菌株和B-sh-ER菌株的補料分批發(fā)酵參數(shù)
(a)生物量;(b)總油脂量;(c)EPA產(chǎn)量;(d)DHA產(chǎn)量;(e)EPA×100/DHA
Fig.8 Fed-batch fermentation parameters of wild strain and B-sh-ERstrain

[3] Oppedisano F, Macrì R, Gliozzi M, et al. The anti-inflammatory and antioxidant properties of n-3 PUFAs: their role in cardiovascular protection[J].Biomedicines,2020,8(9):306.

[4] Amigó N, Akinkuolie A O, Chiuve S E, et al. Habitual fish consumption, n-3 fatty acids, and nuclear magnetic resonance lipoprotein subfractions in women[J]. Journal of the American Heart Association,2020,9(5):e014963.

[5] 夏堯干,王宇,鄒雯燕,等.魚油脂肪酸EPA 和DHA 的分離影響研究[J].淮陰工學(xué)院學(xué)報,2020,29(5):49-52.Xia Y G, Wang Y, Zou W Y, et al. Study on the separation effect of EPA and DHA from fish oil fatty acids[J]. Journal of Huaiyin Institute of Technology,2020,29(5):49-52.

[6] Yazawa K. Production of eicosapentaenoic acid from marine bacteria[J].Lipids,1996,31(1):S297-S300.

[7] El Razak A A,Ward A C,Glassey J.Screening of marine bacterial producers of polyunsaturated fatty acids and optimisation of production[J].Microbial Ecology,2014,67(2):454-464.

[8] Zhang J W, Burgess J G. Enhanced eicosapentaenoic acid production by a new deep-sea marine bacteriumShewanella electrodiphilaMAR441T[J].PLoS One,2017,12(11):e0188081.

[9] Wen Z Y, Chen F. Heterotrophic production of eicosapentaenoic acid by microalgae[J]. Biotechnology Advances, 2003, 21(4):273-294.

[10] Wang S, Lan C Z, Wang Z J, et al. Optimizing eicosapentaenoic acid production by grafting a heterologous polyketide synthase pathway in theThraustochytrid aurantiochytrium[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry,2020,68(40):11253-11260.

[11] Sayanova O, Napier J A. Metabolic engineering of microalgae for sustainable production of omega-3 long chain polyunsaturated fatty acids[J].Current Biotechnology,2016,5(3):198-212.

[12] Hayashi S,Satoh Y,Ogasawara Y,et al.Control mechanism forcisdouble-bond formation by polyunsaturated fatty-acid synthases[J].Angewandte Chemie International Edition,2019,58(8):2326-2330.

[13] Ren L J, Chen S L, Geng L J, et al. Exploring the function of acyltransferase and domain replacement in order to change the polyunsaturated fatty acid profile ofSchizochytriumsp[J]. Algal Research,2018,29:193-201.

[14] Matsuda T, Sakaguchi K, Hamaguchi R, et al. Analysis of Δ12-fatty acid desaturase function revealed that two distinct pathways are active for the synthesis of PUFAs inT. aureumATCC 34304[J].Journal of Lipid Research,2012,53(6):1210-1222.

[15] Aasen I M,Ertesv?g H,Heggeset T M B,et al.Thraustochytrids as production organisms for docosahexaenoic acid (DHA), squalene,and carotenoids[J]. Applied Microbiology and Biotechnology,2016,100(10):4309-4321.

[16] Yaguchi T, Tanaka S, Yokochi T, et al. Production of high yields of docosahexaenoic acid bySchizochytriumsp. strain SR21[J].Journal of the American Oil Chemists ' Society, 1997, 74(11):1431-1434.

[17] Wallis J G, Watts J L, Browse J. Polyunsaturated fatty acid synthesis: what will they think of next?[J]. Trends in Biochemical Sciences,2002,27(9):467-473.

[18] Marrakchi H, Dewolf W E, Quinn C, et al. Characterization ofStreptococcus pneumoniaeenoyl-(acyl-carrier protein) reductase(FabK)[J].The Biochemical Journal,2003,370(Pt 3):1055-1062.

[19] Heath R J, Rock C O. Enoyl-acyl carrier protein reductase (fabI)plays a determinant role in completing cycles of fatty acid elongation inEscherichia coli[J]. Journal of Biological Chemistry,1995,270(44):26538-26542.

[20] Ling X P, Zhou H, Yang Q H, et al. Functions of enyolreductase(ER) domains of PKS cluster in lipid synthesis and enhancement of PUFAs accumulation inSchizochytrium limacinumSR21 using triclosan as a regulator of ER[J].Microorganisms,2020,8(2):300.

[21] Lee S J, Seo P S, Kim C H, et al. Isolation and characterization of the eicosapentaenoic acid biosynthesis gene cluster fromShewanellasp.BR-2[J]. Journal of Microbiology and Biotechnology,2009,19(9):881-887.

[22] Metz J G, Roessler P, Facciotti D, et al. Production of polyunsaturated fatty acids by polyketide synthases in both prokaryotes and eukaryotes[J]. Science, 2001, 293(5528):290-293.

[23] Peng Y F, Chen W C, Xiao K, et al. DHA production inEscherichia coliby expressing reconstituted key genes of polyketide synthase pathway from marine bacteria[J]. PLoS One,2016,11(9):e0162861.

[24] Lee S J, Kim C H, Seo P S, et al. Enhancement of heterologous production of eicosapentaenoic acid inEscherichia coliby substitution of promoter sequences within the biosynthesis gene cluster[J].Biotechnology Letters,2008,30(12):2139-2142.

[25] Gemperlein K, Dietrich D, Kohlstedt M, et al. Polyunsaturated fatty acid production byYarrowia lipolyticaemploying designed myxobacterial PUFA synthases[J]. Nature Communications, 2019,10(1):4055.

[26] Xue Z X, Sharpe P L, Hong S P, et al. Production of omega-3 eicosapentaenoic acid by metabolic engineering ofYarrowia lipolytica[J].Nature Biotechnology,2013,31(8):734-740.

[27] Takeyama H, Takeda D, Yazawa K, et al. Expression of the eicosapentaenoic acid synthesis gene cluster fromShewanellasp.in a transgenic marine cyanobacterium,Synechococcussp[J].Microbiology,1997,143(Pt 8):2725-2731.

[28] Ling X P, Guo J, Liu X T, et al. Impact of carbon and nitrogen feeding strategy on high production of biomass and docosahexaenoic acid (DHA) bySchizochytriumsp.LU310[J].Bioresource Technology,2015,184:139-147.

[29] Li Z P, Meng T, Ling X P, et al. Overexpression of malonyl-CoA:ACP transacylase inSchizochytriumsp. to improve polyunsaturated fatty acid production[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry,2018,66(21):5382-5391.

[30] Li Z, Ling X, Zhou H, et al. Screening chemical modulators of benzoic acid derivatives to improve lipid accumulation inSchizochytrium limacinumSR21 with metabolomics analysis[J].Biotechnology for Biofuels,2019,12:209.

[31] Pan X S, Wang B B, Duan R, et al. Enhancing astaxanthin accumulation inXanthophyllomyces dendrorhousby a phytohormone: metabolomic and gene expression profiles[J].Microbial Biotechnology,2020,13(5):1446-1460.

[32] Li J P, Wei Y X, Li J C, et al. A novel duplex SYBR Green realtime PCR with melting curve analysis method for beef adulteration detection[J].Food Chemistry,2021,338:127932.

[33] Ren L J, Zhuang X Y, Chen S L, et al. Introduction of ω-3 desaturase obviously changed the fatty acid profile and sterol content ofSchizochytriumsp[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry,2015,63(44):9770-9776.

[34] Ren L J, Huang H, Xiao A H, et al. Enhanced docosahexaenoic acid production by reinforcing acetyl-CoA and NADPH supply inSchizochytriumsp. HX-308[J]. Bioprocess and Biosystems Engineering,2009,32(6):837-843.

[35] Snoep J L, Yomano L P, Westerhoff H V, et al. Protein burden inZymomonas mobilis: negative flux and growth control due to overproduction of glycolytic enzymes[J]. Microbiology, 1995, 141(9):2329-2337.

[36] Nishida I, Murata N. CHILLING SENSITIVITY IN PLANTS AND CYANOBACTERIA: the crucial contribution of membrane lipids[J]. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology,1996,47:541-568.

[37] Venkateswaran K, Moser D P, Dollhopf M E, et al. Polyphasic taxonomy of the genusShewanellaand description ofShewanella oneidensissp. nov[J]. International Journal of Systematic Bacteriology,1999,49 Pt 2:705-724.

[38] Lippmeier J C, Crawford K S, Owen C B, et al. Characterization of both polyunsaturated fatty acid biosynthetic pathways inSchizochytriumsp.[J].Lipids,2009,44(7):621-630.

[39] Hauvermale A, Kuner J, Rosenzweig B, et al. Fatty acid production inSchizochytriumsp.: involvement of a polyunsaturated fatty acid synthase and a type I fatty acid synthase[J].Lipids,2006,41(8):739-747.

[40] Cerón Garcí M C,Fernández Sevilla J M,Acién Fernández F G,et al. Mixotrophic growth ofPhaeodactylum tricornutumon glycerol:growth rate and fatty acid profile[J]. Journal of Applied Phycology,2000,12(3/4/5):239-248.

[41] Shi H S, Chen H Q, Gu Z N, et al. Application of a delta-6 desaturase with α-linolenic acid preference on eicosapentaenoic acid production inMortierella alpina[J]. Microbial Cell Factories,2016,15(1):117.

[42] Okuda T, Ando A, Negoro H, et al. Eicosapentaenoic acid (EPA)production by an oleaginous fungusMortierella alpinaexpressing heterologous the Δ17-desaturase gene under ordinary temperature[J]. European Journal of Lipid Science and Technology, 2015, 117(12):1919-1927.

[43] Cui G Z, Ma Z X, Liu Y J, et al. Overexpression of glucose-6-phosphate dehydrogenase enhanced the polyunsaturated fatty acid composition ofAurantiochytriumsp. SD116[J]. Algal Research,2016,19:138-145.

[44] Khozin-Goldberg I, Yu H Z, Adlerstein D, et al. Triacylglycerols of the red microalgaPorphyridium cruentumcan contribute to the biosynthesis of eukaryotic galactolipids[J]. Lipids, 2000, 35(8):881-889.

[45] Fernández F G A, Pérez J A S, Sevilla J M F, et al. Modeling of eicosapentaenoic acid (EPA) production fromPhaeodactylum tricornutumcultures in tubular photobioreactors. Effects of dilution rate, tube diameter, and solar irradiance[J]. Biotechnology and Bioengineering,2000,68(2):173-183.

[46] Huerlimann R, de Nys R, Heimann K. Growth, lipid content,productivity, and fatty acid composition of tropical microalgae for scale-up production[J]. Biotechnology and Bioengineering, 2010,107(2):245-257.