夏杰 徐小敏 張其梅

三峽大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院&宜昌市中心人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科（湖北宜昌443000）

癲癇是常見的神經(jīng)系統(tǒng)慢性發(fā)作性疾病，其發(fā)病機(jī)理尚未完全明確。已證明海馬神經(jīng)元變性和死亡是癲癇的特征性病理改變之一，海馬神經(jīng)元的損傷會(huì)進(jìn)一步促進(jìn)癲癇的發(fā)生發(fā)展［1-2］。海馬神經(jīng)元損傷的主要方式之一是細(xì)胞凋亡，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的異常激活可促進(jìn)神經(jīng)元凋亡［3］。p38是絲裂素活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinases，MAPKs）家族重要成員，激活后發(fā)生核轉(zhuǎn)位，對(duì)許多蛋白激酶和轉(zhuǎn)錄因子具有磷酸化激活的作用，在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要的作用［4］。p53 蛋白是p38 的下游轉(zhuǎn)錄因子，主要功能是使細(xì)胞程序性凋亡，對(duì)細(xì)胞分裂增殖起負(fù)性調(diào)控作用。研究發(fā)現(xiàn)，上調(diào)p53 的表達(dá)可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，抑制p38/p53 通路可保護(hù)缺血性卒中神經(jīng)元的凋亡［5-6］。本研究以氯化鋰-匹羅卡品癲癇大鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，觀察p38/p53 信號(hào)通路在海馬神經(jīng)元中的活化規(guī)律，探討抑制該信號(hào)通路對(duì)癲癇持續(xù)狀態(tài)（status epilepsy，SE）后神經(jīng)元損傷保護(hù)作用的機(jī)制，從信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的角度來研究癲癇的形成和發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康雄性SD 大鼠40 只，鼠齡1月齡，體質(zhì)量180 ～220 g，由三峽大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，符合國(guó)家醫(yī)用動(dòng)物使用標(biāo)準(zhǔn)（許可證編號(hào)：SCXK（鄂）2017-0012，級(jí)別：清潔級(jí)），所有實(shí)驗(yàn)操作嚴(yán)格按照三峽大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物倫理委員會(huì)要求進(jìn)行。

1.2 分組及模型建立40 只SD 大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組4 只，癲癇組、抑制劑組、二甲亞楓（DMSO）溶劑對(duì)照組各12 只，每組中癲癇發(fā)作后30 min、2 h和6 h各4只。癲癇組大鼠清醒狀態(tài)下腹腔注射氯化鋰（美國(guó)Sigma 公司，127 mg/kg），20 h后再腹腔注射匹羅卡品（MCE 公司，50 mg/kg）；抑制劑組在匹羅卡品注射前30 min預(yù)先腹腔注射p38特異性抑制劑SB203580（MCE 公司，15 mg/kg），SB203580 溶于生理鹽水+2%DMSO（基因科技上海有限公司）中，配制成濃度為3 g/L 的溶液。DMSO溶劑對(duì)照組腹腔注射等量生理鹽水+2%DMSO，正常對(duì)照組腹腔注射等量生理鹽水。發(fā)作程度按Racine 評(píng)分［5］標(biāo)準(zhǔn)判斷，評(píng)分達(dá)Ⅳ-Ⅴ級(jí)大鼠納入研究。觀察到Ⅳ級(jí)發(fā)作開始計(jì)時(shí)，分別于30 min、2 h 及6 h 進(jìn)行腦組織標(biāo)本取材制作。

1.3 標(biāo)本制備在設(shè)計(jì)的時(shí)間節(jié)點(diǎn)，四組大鼠用10%水合氯醛（0.33 mL/100 g）腹腔注射麻醉，經(jīng)生理鹽水及4%多聚甲醛持續(xù)灌注固定。Paxinox 立體定位圖譜取標(biāo)本組織，每塊厚約2 mm。腦組織進(jìn)行脫水、石蠟包埋等處理，做連續(xù)冠狀切片，切片厚4 μm。

1.4 免疫組化染色采用鏈霉卵白素-過氧化物酶法（SP 法）。兔抗大鼠p38MAPK 多克隆抗體（1∶200 μL，Servicebio 公司）、兔抗大鼠p-p38MAPK 多克隆抗體（1∶200 μL，Servicebio 公司）、兔抗大鼠p53 抗體（1∶200 μL，Abbkine 公司）、兔抗大鼠pp53 抗體（1∶200 μL，Abcam 公司）、HRP 標(biāo)記山羊抗兔二抗（1∶200 μL，Servicebio 公司）、DAB 顯色試劑盒（Servicebio 公司），具體步驟按說明書進(jìn)行。陰性對(duì)照以等量磷酸鹽緩沖液（PBS）代替一抗，其余同上。

1.5 組織病理學(xué)觀察標(biāo)本制成常規(guī)石蠟切片，HE 染色，光學(xué)顯微鏡下觀察四組大鼠海馬CA1 及CA3 區(qū)病理變化。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法400倍光鏡下取大鼠海馬CA1區(qū)連續(xù)6 個(gè)不重復(fù)的視野，計(jì)數(shù)p38/p-p38、p53/p-p53免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞。所有數(shù)據(jù)整理后導(dǎo)入SPSS 20.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 p38 抑制劑對(duì)大鼠達(dá)癲癇Ⅳ級(jí)發(fā)作潛伏期的影響癲癇組大鼠、DMSO 溶劑對(duì)照組、抑制劑組達(dá)癲癇Ⅳ級(jí)發(fā)作潛伏期的時(shí)間分別為（33.33 ±1.15）、（35.33 ± 1.52）、（42.67 ± 2.08）min。與癲癇組大鼠相比，抑制劑組達(dá)到癲癇Ⅳ級(jí)的發(fā)作潛伏期延長(zhǎng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，表1），DMSO組與癲癇組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，表1）。

表1 p38 抑制劑對(duì)大鼠達(dá)癲癇Ⅳ級(jí)發(fā)作潛伏期影響Tab.1 p38 inhibitor influence on the latent period of epileptic grade Ⅳseizures in rat±s

表1 p38 抑制劑對(duì)大鼠達(dá)癲癇Ⅳ級(jí)發(fā)作潛伏期影響Tab.1 p38 inhibitor influence on the latent period of epileptic grade Ⅳseizures in rat±s

注：*P ＜0.05，與癲癇組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；##P ＞0.05，與癲癇組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

別大鼠達(dá)到癲癇Ⅳ級(jí)發(fā)作潛伏期（min）##組DMSO 溶劑對(duì)照組癲癇組抑制劑組35.33±1.52 33.33±1.15 42.67±2.08*

2.2 組織病理學(xué)觀察正常對(duì)照組大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞陳列齊整、形態(tài)規(guī)則，胞質(zhì)豐富，胞核位于中央，核仁清楚。癲癇組大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞排列紊亂，胞體縮小，胞核固縮，細(xì)胞間隙增寬，嚴(yán)重時(shí)細(xì)胞脫失，胞漿空泡變性等。抑制劑組也有不同程度神經(jīng)元細(xì)胞變性壞死，但程度較癲癇組輕。見圖1。

圖1 HE 染色觀察正常組、癲癇組（2 h）及抑制劑組（2 h）大鼠CA3 區(qū)病理學(xué)變化（×200）Fig.1 HE staining to observe the normal group，the epilepsy group（2 h）and inhibitor group（2 h）organization pathology change in CA3 region of rat（×200）

2.3 p38/p-p38 免疫組化檢測(cè)正常對(duì)照組中，海馬CA1 區(qū)可見部分p38/p-p38 陽性細(xì)胞。癲癇組大鼠SE 30 min 后，p38/p-p38 陽性細(xì)胞增多，呈棕黃色顆粒狀，2 h 時(shí)達(dá)到峰值，呈簇團(tuán)樣密集分布（圖2），6 h 后陽性細(xì)胞數(shù)減少，癲癇組各時(shí)間點(diǎn)p38/p-p38 陽性細(xì)胞數(shù)較對(duì)照組增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，表2）。抑制劑組p38/p-p38 陽性細(xì)胞數(shù)同樣在SE 30 min 增多，2 h 達(dá)高峰，6 h 減少，與同階段癲癇組相比減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，表2）。

表2 大鼠海馬CA1 區(qū)p38、p-p38 陽性細(xì)胞數(shù)Tab.2 Number of p38 and p-p38 positive cells in hippocampal CA1 region of rats±s

表2 大鼠海馬CA1 區(qū)p38、p-p38 陽性細(xì)胞數(shù)Tab.2 Number of p38 and p-p38 positive cells in hippocampal CA1 region of rats±s

注：*P ＜0.05，與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；#P ＜0.05，與同階段癲癇組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

p38 細(xì)胞數(shù)（個(gè)）p-p38 細(xì)胞數(shù)（個(gè)）對(duì)照組21.71±1.9829.29±2.63組別正常癲癇組癲癇發(fā)作30 min癲癇發(fā)作2 h癲癇發(fā)作6 h抑制劑組癲癇發(fā)作30 min癲癇發(fā)作2 h癲癇發(fā)作6 h 29.86±2.12*60.29±2.43*39.43±1.62*26.14±1.95* #39.57±1.27* #32.29±2.50* #55.43±1.81*70.29±1.80*39.86±1.77*40.14±1.77* #49.43±2.30* #34.14±1.95* #

2.4 p53/p-p53 免疫組化檢測(cè)正常對(duì)照組中，海馬CA1 區(qū)偶有p53/p-p53 陽性細(xì)胞。癲癇組大鼠SE 30 min后，陽性細(xì)胞數(shù)增多，呈棕黃色小顆粒樣，2 h 后陽性細(xì)胞繼續(xù)增多，呈密集樣排列（圖2），6 h 后陽性細(xì)胞數(shù)達(dá)峰值，與正常對(duì)照組比，癲癇組各時(shí)間點(diǎn)p53/p-p53 陽性細(xì)胞數(shù)增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，表3）。抑制劑組p53/p-p53陽性細(xì)胞數(shù)在SE 30 min 開始增多，6 h 達(dá)高峰，與同階段癲癇組相比減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，表3）。

圖2 免疫組化檢測(cè)p38/p-p38/p53/p-p53 在正常組、癲癇組（2 h）及抑制劑組（2 h）大鼠CA3 區(qū)表達(dá)情況（×400）Fig.2 Immunohistochemical detection of p38/p-p38/p53/p-p53 expressionin normal group，in EP group（2 h）and inhibitor group（2 h）in CA3 region of rats（×400）

表3 大鼠海馬CA1 區(qū)p53、p-p53 陽性細(xì)胞數(shù)Tab.3 Number of p53 and p-p53 positive cells in hippocampal CA1 region of rats ±s

表3 大鼠海馬CA1 區(qū)p53、p-p53 陽性細(xì)胞數(shù)Tab.3 Number of p53 and p-p53 positive cells in hippocampal CA1 region of rats ±s

注：*P ＜0.05，與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；#P ＜0.05，與同階段癲癇組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

組別正常對(duì)照組癲癇組癲癇發(fā)作30 min癲癇發(fā)作2 h癲癇發(fā)作6 h抑制劑組癲癇發(fā)作30 min癲癇發(fā)作2 h癲癇發(fā)作6 h p53 細(xì)胞數(shù)（個(gè)）1.86±0.69 24.43±1.72*49.86±2.61*70.86±3.98*16.29±1.70* #35.29±2.22* #50.71±2.36* #p-p53 細(xì)胞數(shù)（個(gè)）0.71±0.76 22.14±2.55*35.43±1.27*43.86±2.27*13.43±2.37* #25.57±0.98* #33.86±1.35* #

3 討論

氯化鋰-匹羅卡品誘發(fā)癲癇動(dòng)物模型已成為實(shí)驗(yàn)研究SE 和顳葉癲癇的理想模型［8-9］。而Racine評(píng)分的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)也是主要的評(píng)判大鼠造模過程中癲癇發(fā)作輕重程度的工具［5］。本實(shí)驗(yàn)成功建立匹羅卡品癲癇持續(xù)狀態(tài)模型，給予p38 抑制劑，觀察各組大鼠癲癇發(fā)作達(dá)到Ⅳ級(jí)發(fā)作潛伏期，結(jié)果顯示p38 抑制劑可以有效延緩潛伏期。

癲癇發(fā)作后海馬出現(xiàn)多種病理生理變化，包括神經(jīng)元丟失、膠質(zhì)細(xì)胞增生、苔蘚纖維出芽、突觸傳遞改變、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、血管再生、離子通道的改變等［11］。海馬神經(jīng)元損傷會(huì)進(jìn)一步促進(jìn)癲癇的發(fā)生發(fā)展。反復(fù)的癲癇發(fā)作誘發(fā)海馬齒狀回區(qū)苔蘚纖維出芽（mossy fiber sprouting，MFS），形成異常興奮性突觸回路，反過來又進(jìn)一步加重海馬神經(jīng)元損傷［11］。癲癇后海馬神經(jīng)元的損傷也可以引起認(rèn)知功能的損害［12］。實(shí)驗(yàn)顯示癲癇發(fā)作后海馬CA1 區(qū)和CA3 區(qū)均出現(xiàn)不同程度神經(jīng)元細(xì)胞變性壞死，而抑制劑組大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞病變程度較癲癇組輕，提示p38 抑制劑對(duì)癲癇發(fā)作海馬損傷有一定保護(hù)作用。

MAPK 是細(xì)胞外信號(hào)引起細(xì)胞核反應(yīng)的共同轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，也是能夠引起細(xì)胞產(chǎn)生相應(yīng)生物學(xué)作用的重要信號(hào)傳導(dǎo)通路［13］。p38 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在MAPK 家族中擁有重要地位，它既能在介導(dǎo)炎癥刺激、應(yīng)激反應(yīng)中發(fā)揮特別的作用，也能在細(xì)胞存活、分化和發(fā)育等過程中發(fā)揮關(guān)鍵的作用。研究證實(shí)，使用極低劑量的SB203580 干預(yù)處理培養(yǎng)的神經(jīng)細(xì)胞30 min，可觀察到p38 通路受到抑制［14］。研究表明p38 抑制劑SB203580 能選擇性抑制p38通路的激活，減少大鼠癲癇發(fā)作并保護(hù)海馬神經(jīng)元，提示p38 通路與大腦抗癲癇機(jī)制有相關(guān)性［15］。本研究中觀察到注射抑制劑后大鼠海馬區(qū)p38/pp38 免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞數(shù)相應(yīng)減少，提示SB203580可以抑制p38 途徑正常激活轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。

p53是一種序列特殊的轉(zhuǎn)錄因子，在各種形式的細(xì)胞應(yīng)激下，p53 激活可抑制細(xì)胞生長(zhǎng)和促進(jìn)細(xì)胞死亡。在癲癇損傷神經(jīng)元中p53表達(dá)升高［16］。研究發(fā)現(xiàn)癲癇發(fā)作后許多凋亡的神經(jīng)元錐體細(xì)胞聚集在海馬CA1 區(qū)，錐體細(xì)胞內(nèi)可見p53 蛋白表達(dá)升高［16］。研究發(fā)現(xiàn)，癲癇發(fā)作后miR-128 蛋白的促神經(jīng)元凋亡機(jī)制與激活p53 級(jí)聯(lián)信號(hào)通路有關(guān)，給予p53 抑制劑治療后，miR-128 蛋白的促神經(jīng)元損傷作用明顯減輕［17］。本實(shí)驗(yàn)中觀察到癲癇發(fā)作時(shí)間越長(zhǎng)，海馬區(qū)p53/p-p53 陽性細(xì)胞數(shù)增多越明顯，注射p38 抑制劑后p53/p-p53 表達(dá)下調(diào)，同階段神經(jīng)元損傷也減輕，提示抑制p38 信號(hào)通路可能通過抑制p53 基因的轉(zhuǎn)錄活化，從而減輕了癲癇發(fā)作后神經(jīng)元的細(xì)胞凋亡。

綜上所述，p38/p53 信號(hào)通路可能在癲癇發(fā)作后海馬神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡中扮演著重要的角色，抑制p38/p53 信號(hào)通路可以減輕氯化鋰-匹羅卡品致癇大鼠海馬神經(jīng)元的損傷，對(duì)致癇后神經(jīng)元的損傷具有一定保護(hù)作用，推測(cè)p38/p53 信號(hào)通路可能參與了癲癇的發(fā)生發(fā)展過程，但具體調(diào)控機(jī)制目前尚未明確，有待進(jìn)一步研究。