李惠波 段躍興 賴曉純 馮燕玲 黃蓮枝 陳欽修 程宏基 鄭棟 伍金雷 程穎 黃冰生 林桂雄 吳鈺燕 張鵬 李國(guó)揚(yáng) 曾慶春 卓裕豐

廣州市番禺區(qū)何賢紀(jì)念醫(yī)院1心內(nèi)科，3呼吸內(nèi)科（廣州511400）；2廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院腎內(nèi)科（廣州510260）；4南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院心內(nèi)科（廣州510515）

肺動(dòng)脈高壓（pulmonary hypertension，PAH）是一種發(fā)病機(jī)制復(fù)雜的血管疾病，其主要特征為肺血管阻力增加和血管壓力持續(xù)增高［1-3］。目前對(duì)PAH 發(fā)病相關(guān)機(jī)制尚不清楚。而有研究顯示單核苷酸多態(tài)等基因遺傳變異與PAH 發(fā)生有著密切的關(guān)聯(lián)［4-6］。而基因組DNA 拷貝數(shù)變異（copy-number variations，CNVs）是近年來新發(fā)現(xiàn)的遺傳變異形式，且CNVs 更易引起基因的結(jié)構(gòu)異?；虮磉_(dá)變化［7］。已有研究顯示染色體9p21.3 區(qū)段是血管疾病的遺傳熱區(qū)［8］，而ANRIL（antisense non coding RNA in the INK4 locus）在此染色體位點(diǎn)功能中發(fā)揮重要作用［9］。但是關(guān)于PAH 與ANRIL 的研究國(guó)內(nèi)外鮮有報(bào)道。本研究基于文獻(xiàn)報(bào)道和生物信息學(xué)分析，擬探索位于血管疾病遺傳熱區(qū)9p21.3 的長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，LncRNA）ANRIL 的CNVs 與PAH 疾病發(fā)生的關(guān)系，以期找出適合評(píng)價(jià)PAH 發(fā)病、診斷的遺傳分子標(biāo)記。

1 資料與方法

1.1 樣本資料本研究共納入在2015年1月至2018年12月期間就診于番禺區(qū)何賢紀(jì)念醫(yī)院和南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院的PAH 患者587 例，還有736 例年齡和性別匹配的健康對(duì)照者也在同一時(shí)期的體檢項(xiàng)目中登記。通過右心導(dǎo)管測(cè)定所有患者的血液動(dòng)力學(xué)，若平均肺動(dòng)脈壓≥25 mmHg 而肺毛細(xì)血管楔壓正常，則可診斷為PAH［10］。

1.2 研究方法

1.2.1 CNV 選擇、基因型及LncRNA ANRIL 靶基因表達(dá)檢測(cè)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)LncRNA ANRIL（http：//dgv.tcag.ca/dgv/app/home），本研究中只檢測(cè)CNV-2738282 基因型，并分析其與PAH 的關(guān)聯(lián)。收集150 對(duì)PAH 病例和健康對(duì)照新鮮靜脈血樣本，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法檢測(cè)LncRNA ANRIL及其靶基因在PBMC 標(biāo)本中的表達(dá)水平、ANRIL 在細(xì)胞核和胞漿的表達(dá)。

1.2.2 LncRNA ANRIL 的生物學(xué)表型檢測(cè)將pcDNA3.1-ANRIL 和pcDNA3.1 空白質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染至EAhy926 細(xì)胞，轉(zhuǎn)染6 h 后換液培養(yǎng)，G418 藥物篩選穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系。進(jìn)行單核細(xì)胞粘附實(shí)驗(yàn)、單核細(xì)胞跨上皮細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)和血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)細(xì)胞接種于24孔板，當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)80%～90%時(shí)，將LipofectamineTM3000 與CARD8 啟動(dòng)子報(bào)告基因質(zhì)粒和pcDNA3.1-ANRIL 或pcDNA3.1 空白質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染加入各培養(yǎng)孔，14～16 h 后分別檢測(cè)螢光素酶和內(nèi)參海腎熒光素酶活性。

1.2.4 ChIRP實(shí)驗(yàn)使用Magna ChIRPTMChromatin Isolation by RNA Purification Kit 試劑盒（Millipore，馬薩諸塞州，美國(guó)）進(jìn)行ANRIL 對(duì)CARD8 基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的機(jī)制探討。實(shí)驗(yàn)依照試劑操作說明進(jìn)行，最后洗滌、分離并純化RNA 和DNA 后應(yīng)用qRT-PCR 法進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.5 RNA-pull down 實(shí)驗(yàn)委托上海生工生物工程公司體外合成ANRIL 片段以及截?cái)嗟耐蛔僐NA 序列ANRIL-Mut 作為參照，并以T7 RNA polymerase 轉(zhuǎn)錄為ANRIL RNA 片段。用親和素錨定磁珠收集RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物，對(duì)復(fù)合物進(jìn)行Western blot 驗(yàn)證。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用R 軟件（版本3.0.2）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和分析。使用χ2檢驗(yàn)、logistic 回歸模型，獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析在病例對(duì)照組間比較的差異，及其在不同基因型之間的差異。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CNV-2738282 與人群肺動(dòng)脈高壓的發(fā)病顯著相關(guān)利用TaqMan 拷貝數(shù)分型方法，檢測(cè)PAH 病例和健康對(duì)照的CNV-2738282 的拷貝數(shù)。CNV-30795 的基因型與人群PAH 發(fā)病存在顯著關(guān)聯(lián)，且相較于2-copy 常見基因型攜帶者，≤1-copy 基因型攜帶者發(fā)生PAH 的風(fēng)險(xiǎn)顯著降低（OR= 0.41，95%CI：0.32～0.52）。進(jìn)一步分層分析顯示（表2），CNV-2738282 與PAH 發(fā)病的風(fēng)險(xiǎn)在年齡、性別、吸煙、飲酒等亞組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；因樣本量小，CNV-2738282 與PAH 發(fā)病的關(guān)聯(lián)在有PAH家族史亞組中差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。此外，未觀測(cè)到CNV-2738282 與上述環(huán)境因素在PAH 發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)上存在顯著的交互效應(yīng)。見表1。

表1 CNV-2738282 與PAH 之間危險(xiǎn)因素相關(guān)性Tab.1 Correlation of risk factors between CNV-2738282 and PAH 例（%）

表2 通過PAH 和對(duì)照組中的選擇變量對(duì)CNV-2738282 基因型進(jìn)行分層分析Tab.2 Analysis of CNV-2738282 genotype by PAH and the selection variables in the control group 例（%）

2.2 CNV-2738282低拷貝導(dǎo)致ANRIL表達(dá)降低采用qPCR 法檢測(cè)PAH 外周血PBMCs ANRIL 基因的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)ANRIL 的表達(dá)水平在不同CNV-2738282 基因型PBMCs 間存在顯著差異，攜帶≤1-copy 基因型的PAH 患者中ANRIL 表達(dá)水平顯著低于2-copy 基因型的患者（P＜0.001，圖1）。

圖1 CNV-2738282 基因型與ANRIL 表達(dá)的關(guān)系Fig.1 The relationship between CNV-2738282 genotype and ANRIL expression

2.3 ANRIL 在PAH 病例中呈高表達(dá)水平qPCR法檢測(cè)了150 對(duì)PAH 和健康對(duì)照外周血PBMCs ANRIL 的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)ANRIL 在60.7%（91/150）的病例PBMCs 中的表達(dá)高于健康對(duì)照者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001，圖2A）。

2.4 ANRIL 與CARD8 表達(dá)相關(guān)基于物信息學(xué)分析LncRNA ANRIL 可能通過與靶基因CARD8 啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合而調(diào)控其表達(dá)，繼而在PAH 外周血檢測(cè)了CARD8 基因的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)兩者表達(dá)呈正相關(guān)（r= 0.354，P＜0.001，圖2B）。并且，CARD8 在PAH 病例外周血的表達(dá)高于健康者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P= 0.002，圖2C）。此外，過表達(dá)ANRIL的血管內(nèi)皮細(xì)胞系相較于對(duì)照細(xì)胞系，其CARD8的表達(dá)顯著上調(diào)（圖2D）。

2.5 ANRIL 通過Trans-acting 機(jī)制在轉(zhuǎn)錄水平影響CARD8 的表達(dá)亞細(xì)胞定位實(shí)驗(yàn)顯示ANRIL主要在胞核表達(dá)，提示其可能在轉(zhuǎn)錄水平參與基因表達(dá)調(diào)控（圖2E）。生物信息學(xué)分析顯示ANRIL 可通過結(jié)合CARD8啟動(dòng)子區(qū)而調(diào)控CARD8的表達(dá)，故通過構(gòu)建CARD8 啟動(dòng)子熒光素酶報(bào)告基因，將報(bào)告基因和pcDNA3.1-ANRIL 或空載體共轉(zhuǎn)染血管內(nèi)皮細(xì)胞系；過表達(dá)ANRIL 能明顯上調(diào)CARD8 基因的轉(zhuǎn)錄水平（圖2F）。ChIRP 實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，ANRIL 可與CARD8 基因啟動(dòng)子特異性結(jié)合（圖2G、H）。RNA Pull-down 實(shí)驗(yàn)結(jié)果則顯示，在蛋白水平ANRIL 未與CARD8 蛋白特異性結(jié)合。上述結(jié)果提示ANRIL 是通過特異性結(jié)合CARD8 基因啟動(dòng)子而參與CARD8 的轉(zhuǎn)錄調(diào)控（圖2I）。

圖2 ANRIL 與CARD8 表達(dá)的關(guān)聯(lián)及其分子Fig.2 The relationship between ANRIL and CARD8 expression and its molecules

2.6 ANRIL 介導(dǎo)的細(xì)胞生物學(xué)表型變化見圖3，相較于對(duì)照細(xì)胞系，過表達(dá)ANRIL 能顯著促進(jìn)THP-1 細(xì)胞對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞EA.hy926 的黏附和定植能力；此外，過表達(dá)ANRIL 的EA.hy926 細(xì)胞的遷移能力亦明顯增加。

圖3 ANRIL 過表達(dá)對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的生物學(xué)功能影響Fig.3 The effect of ANRIL overexpression on the biological function of vascular endothelial cells

3 討論

PAH 是一種進(jìn)行性致死性血管疾病，其特征是肺動(dòng)脈壓升高，血管重塑［11］，并最終導(dǎo)致右心室心力衰竭［12-13］。而有證據(jù)表明LncRNAs 變異在PAH 發(fā)病機(jī)制中扮演著重要的角色［14-15］。但是關(guān)于ANRIL CNVs與PAH關(guān)系的研究至今鮮有報(bào)道。

CNVs 可直接造成位于該區(qū)段的基因拷貝數(shù)發(fā)生變化，影響基因表達(dá)水平，導(dǎo)致表型差異［16］，已成為目前研究的熱點(diǎn)之一。YANG 等［17］研究發(fā)現(xiàn)攜帶BMPR2 變異的PAH 患者臨床上表現(xiàn)為肺動(dòng)脈血流動(dòng)力受阻及心功能受損。本研究發(fā)現(xiàn)ANRIL 在PAH 病例中表達(dá)水平增多，同時(shí)ANRIL與CNV-2738282 表達(dá)成正相關(guān)，提示ANRIL 表達(dá)水平越高，PAH 發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)升高。

近年來發(fā)現(xiàn)ANRIL 參與心血管疾病的發(fā)病機(jī)制是通過調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。LU 等［18］研究發(fā)現(xiàn)ANRIL 基因型rs10757278 調(diào)節(jié)CARD8 促進(jìn)心血管疾病發(fā)生。而CARD8 也參與肺部疾病的發(fā)病機(jī)制［19-21］。本研究發(fā)現(xiàn)PAH 患者中ANRIL、CARD8表達(dá)呈正相關(guān)，而且ANRIL 與CARD8 特異性結(jié)合基因啟動(dòng)子而參與CARD8 的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。利用生物功能分析表明，ANRIL 是通過特異性結(jié)合CARD8 基因啟動(dòng)子影響血管內(nèi)皮細(xì)胞的各項(xiàng)功能。

經(jīng)查閱國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)，暫未發(fā)現(xiàn)國(guó)內(nèi)外ANRIL拷貝數(shù)分布差異的相關(guān)報(bào)道，因此也遺憾的未能進(jìn)一步研究。綜上，本研究在國(guó)內(nèi)較先發(fā)現(xiàn)ANRIL CNV-2738282 與我國(guó)人群PAH 發(fā)病存在顯著關(guān)聯(lián)，該CNV 通過調(diào)控ANRIL 的表達(dá)，影響ANRIL 對(duì)下游靶基因CARD8 的轉(zhuǎn)錄激活，繼而影響PAH 疾病的發(fā)生，可作為人群PAH 易感評(píng)估的生物標(biāo)志物。