潘風光， 蔡轉(zhuǎn)章， 伍海波， 劉靜波， 劉博群， 張 婷*

（1.吉林大學 食品科學與工程學院，吉林 長春130062；2.吉林大學 吉林省營養(yǎng)與功能食品重點實驗室，吉林長春130062）

豆粕，是豆油加工的主要副產(chǎn)物，含有豐富的蛋白質(zhì)，且80%以上為水溶性蛋白質(zhì)[1]。然而在國內(nèi)通常用于飼料加工，少部分用于發(fā)酵食品加工[2-3]，造成了極大的蛋白質(zhì)資源浪費。研究表明，將豆粕進行酶解，可制備出具有良好生物活性的功能肽[4]，包括抗氧化肽[5-6]、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（ACE）抑制肽[7-8]、金屬螯合肽[9-10]等，并且隨著自由基理論的提出，天然抗氧化劑的需求量與日俱增[11]。因此，利用豆粕制備抗氧化肽，不僅能減少資源浪費，還能提高豆粕的附加值，在食品工業(yè)中具有廣闊的應用前景。

目前國內(nèi)外對于抗氧化肽的研究，僅局限于制備和活性檢測，以及肽序列的鑒定及表征[12-14]層面。HE Shudong等[15]使用胰蛋白酶水解假鮑魚制備抗氧化肽，并鑒定得到八肽序列DTETGVPT；WANG Xueqin等[16]經(jīng)過分離純化太平洋鯡魚抗氧化肽，鑒定出LHDELT和KEEKFE 2條六肽序列；SHENG Jianyong等[17]從脫脂核桃中鑒定得到序列為DWMH的抗氧化肽。多肽結構與其抗氧化活性之間有著密切關系，因此鑒定抗氧化肽的序列結構是揭示構效關系的基礎，也是后續(xù)定向大規(guī)模生產(chǎn)應用的前提。

本研究中以大豆粕為原料，采用超聲輔助酶解法制備抗氧化肽并優(yōu)化制備工藝，利用超濾進行分離純化獲得相對分子質(zhì)量<1 000組分，應用LCMS/MS確證高活性組分中肽序列，最后合成上述肽序列進行活性表征。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豆粕：市售；堿性蛋白酶：長春市天佳生物技術有限公司產(chǎn)品；氫氧化鈉、鹽酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉：北京化工廠制造；過硫酸鉀：天津市華東試劑廠制造；ABTS、Trolox、AAPH、熒光素鈉：美國Sigma-Aldrich公司產(chǎn)品；甲酸、乙腈：美國Fisher Scientific公司產(chǎn)品；羥自由基測定試劑盒：南京建成有限公司產(chǎn)品。

1.2 儀器與設備

Starter2C pH計：奧豪斯儀器（上海）有限公司產(chǎn)品；SynergyHT酶標儀：BioTek公司產(chǎn)品；CR20B2高速冷凍離心機：日立有限公司產(chǎn)品；XX8200230小型切向流超濾系統(tǒng)：Millipore有限公司產(chǎn)品；FD-1C-50凍干機：北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司產(chǎn)品；Orbitrap Elite高場靜電場軌道離子肼質(zhì)譜儀：美國Thermo Scientific公司產(chǎn)品。

1.3 方法

1.3.1 豆粕酶解工藝 將豆粕進行粉碎并經(jīng)60目篩子篩分，得到豆粕粉用于后續(xù)實驗：

豆粕粉+蒸餾水→超聲處理→90℃變性10 min→酶解（保持溫度及pH波動范圍在±0.1）→90℃滅酶10 min→4℃、4 000 r/min離心20 min→取上清液。

1.3.2 豆粕抗氧化肽制備單因素實驗 按照上述步驟，分別考察酶解條件及超聲條件對制備豆粕抗氧化肽的活性影響，以ABTS自由基清除率為評價指標，如表1所示。在各單因素條件下，其他因素條件均選擇中間條件，若條件已得到優(yōu)化，則選擇最優(yōu)條件。

表1 單因素設計因素水平表Table 1 Factors and levels of single factor design

1.3.3 豆粕抗氧化肽制備響應面實驗 根據(jù)單因素實驗結果，選取溫度、加酶量、超聲功率和超聲時間進行Box-Behnken Design（見表2）。

表2 響應面設計因素水平表Table 2 Factors and levels of response surface design

1.3.4 豆粕抗氧化肽的鑒定 通過超濾處理獲得相對分子質(zhì)量<1 000的組分進行LC-MS/MS鑒定。色譜條件：使用C18色譜柱（100μm×2 cm，4μm）；流動相：A相為0.1%（體積分數(shù)）甲酸水，B相為含0.1%（體積分數(shù)）甲酸的乙腈溶液；梯度洗脫：0~60 min，5%~35%B；60~64 min，35%~75%B；64~74 min 75%B；流量為300 nL/min。質(zhì)譜條件：納米ESI源；采用數(shù)據(jù)依賴性采集模式，先在FT模式下以60 000的分辨率進行全MS掃描，然后對初始MS掃描中的15種最豐富離子進行CID MS/MS掃描。

1.3.5 豆粕源抗氧化肽的合成 委托生工生物工程股份有限公司進行合成，純度達98%。

1.3.6 體外抗氧化活性測定

1）ABTS自由基清除能力 參照Heeger等[18]的實驗方法稍做改動。實驗分組：空白組（200μL PBS），對照組（180μL ABTS工作液+20μL PBS），實驗組（180μL ABTS工作液+20μL樣品）。實驗結果以ABTS自由基清除率表示，計算公式如下：

式（1）中：Ac為對照組吸光度，As為實驗組吸光度，Ab為空白組吸光度。

2）氧自由基吸收能力 參照ZHENG Li等[19]的實驗方法并略做改動。實驗分組：空白組（120μL熒光素鈉+20μL PBS+60μL AAPH），對照組（120μL熒光素鈉+20μL Trolox+60μL AAPH），實驗組（120μL熒光素鈉+20μL樣品+60μL AAPH）。相鄰2個測定點的時間間隔為2 min，每次讀數(shù)前振板10 s，連續(xù)測定10 h。實驗結果以ORAC值（mg TE/mg）表示，計算公式如下：

式（2）中：netAUC為對應樣品保護面積，M為對應樣品質(zhì)量濃度，mg/mL。

式（3）中：AUC為對應樣品的熒光衰退曲線面積。

式（4）中：f0為初始0 min時的熒光強度，fi為第i個測定點的熒光強度。

3）羥自由基清除能力 按照試劑盒說明書進行操作，實驗結果用羥自由基清除率表示，計算公式如下：

式（5）中：Ac為對照組吸光度；As為實驗組吸光度；Ab為空白組吸光度。

1.4 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），結果以P<0.05為顯著性差異判斷標準。

2 結果與分析

2.1 豆粕抗氧化肽的單因素實驗

酶解條件主要通過改變酶活性[20-21]來影響酶解反應，從而導致酶解產(chǎn)物的抗氧化能力不同。由圖1（a）可知，隨著pH增大，清除率逐漸增大，在pH為11.0時達到最大值，但通過顯著性分析，在pH為8.0~11.0時，清除能力并沒有太大差異，因此選擇8.0為最優(yōu)pH，此條件更接近中性，不僅能降低成本還能減少后續(xù)處理工作量。隨著底物質(zhì)量分數(shù)增加，清除率亦呈現(xiàn)出不斷增大的趨勢，當?shù)孜镔|(zhì)量分數(shù)超過9%后，底物過量，酶解速率已達到最大，此時產(chǎn)物生成速率相對穩(wěn)定，產(chǎn)物抗氧化活性也趨于穩(wěn)定。加酶量的趨勢變化與底物質(zhì)量分數(shù)一致，當加酶量為7 000 U/g時達到峰值，此后繼續(xù)增大酶量，底物不足，酶解體系達到平衡，酶解產(chǎn)物較為穩(wěn)定，因此抗氧化能力也達到穩(wěn)定。而隨著溫度升高，清除率先增大后減小，在40℃時清除率最大，之后繼續(xù)升溫，酶結構被破壞，酶活性降低[22]，導致產(chǎn)物生產(chǎn)速率減小，抗氧化能力減弱。酶解時間與酶解溫度的變化趨勢相似，剛開始反應時間過短，具有抗氧化活性的氨基酸殘基沒有被充分暴露出來[23]，隨著時間的延長，酶解產(chǎn)物逐漸增多，抗氧化能力增大。4 h后，清除率出現(xiàn)減小，推測可能是反應時間過長，產(chǎn)物之間發(fā)生聚集效應[24]，導致活性位點被掩蓋，抗氧化能力減弱。

圖1 酶解條件對抗氧化能力的影響Fig.1 Effect of enzymatic hydrolysis conditions on antioxidant capacity

適當?shù)某曁幚?，對于豆粕蛋白質(zhì)溶出具有促進作用，并且可改變豆粕蛋白質(zhì)的空間結構，使得豆粕蛋白質(zhì)與酶更容易結合[25]。但底物畢竟有限，當超聲時間和功率達到一定范圍后，再延長時間及增大功率并不能溶出更多的豆粕蛋白質(zhì)，還可能破壞豆粕蛋白質(zhì)的分子構象，導致酶解產(chǎn)物的抗氧化能力降低（見圖2）?？梢?，只有適宜的超聲處理才有利于酶解反應的進行[26]，并使得豆粕肽表現(xiàn)出良好的抗氧化能力。

圖2 超聲條件對抗氧化能力的影響Fig.2 Effect of ultrasonic conditions on antioxidation resistance

2.2 豆粕抗氧化肽的響應面實驗

根據(jù)單因素實驗結果，選取溫度（A）、加酶量（B）、超聲功率（C）和超聲時間（D）4個因素為自變量，以ABTS自由基清除率為響應值（Y），進行Box-Behnken Design，所得結果如表3、圖3所示。其他未考察單因素均為單因素優(yōu)化得到的最優(yōu)條件。

圖3 各因子交互作用的曲面圖和等高線圖Fig.3 Surface map and contour maps for each factor interaction

如表3所示，模型具有極顯著性（P<0.01），因變量與自變量之間的線性關系顯著（R2=0.966 5），并且失擬項（P>0.05）差異不顯著，說明該模型擬合程度良好，所得到的回歸方程可信度較高?；貧w方程：Y=-172.487 02+0.026 556C-1.871 66×10-3AC-0.451 87AD-0.010 954A2-6.406 53B2-1.167 9×10-4C2-0.864 79D2+2.480 67×10-6AC2+0.017 045AD2-6.795 94×10-4CD2。

表3 回歸模型方差分析及回歸方程系數(shù)顯著性檢驗Table 3 Significance test for variance analysis and coefficient constants of regression models

通過模型預測得到最佳工藝條件為：溫度50℃，加酶量6 665.39 U/g，超聲功率300 W，超聲時間9 min，此時模型指標值為16.01%。為檢驗響應面法的可行性，采用所得最佳工藝條件進行驗證實驗，得到ABTS自由基清除率為（15.70±0.06）%，實際值與預測值的誤差小于1%，因此利用響應面法對豆

粕抗氧化肽的制備條件優(yōu)化是可行的，得到的工藝參數(shù)具有實際應用價值。通過與前人研究[27]相比，本實驗中所得的pH和溫度更低、加酶量更少、超聲時間更短，在實際應用中，能有效降低生產(chǎn)成本。

續(xù)表3

2.3 豆粕抗氧化肽的鑒定

大量的研究結果表明[28-30]，當相對分子質(zhì)量較大時，部分活性基團仍存在于大分子聚集體的內(nèi)部，導致抗氧化能力降低[31]，因此本實驗直接超濾得到相對分子質(zhì)量<1 000的組分進行LC-MS/MS鑒定。結合軟件分析及蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（UniProt），確定出氨基酸序列為Ile-Trp-Asn-Leu-Asn（IWNLN），位于大豆蛋白質(zhì)（B2ZF64-1）的639~643殘基位置，其相對分子質(zhì)量為658.75，等電點是6.06，平均親水性-1.3，疏水性較強。如圖4（a）所示，通過CID碰撞斷裂所產(chǎn)生的bn與yn離子系列，除b1、y1離子外，其他離子均成功匹配，匹配度較高。

圖4 IWNLN的二級質(zhì)譜圖和結構式Fig.4 MS/MS and structure formula of IWNLN

2.4 豆粕抗氧化肽的活性表征

由圖5（a）可知，3種樣品對ABTS自由基清除能力均呈現(xiàn)出質(zhì)量濃度依賴性，通過計算，IWNLN的IC50為（0.060±0.003）mg/mL，豆粕抗氧化肽粗提液與豆粕抗氧化肽（相對分子質(zhì)量<1 000）的IC50分別為（0.412±0.022）mg/mL和（0.338±0.005）mg/mL。IWNLN之所以具有較強的ABTS自由基清除能力，是因為IWNLN上具有疏水性氨基酸Ile和Trp，當存在于非極性的N端時可增強抗氧化活性[32-33]，且Trp的側鏈上含有吲哚基，具有供氫能力，可減緩或終止自由基的鏈式反應[34]。

圖5 （b）和圖5（c）為氧自由基吸收能力，由圖可知，在初始質(zhì)量濃度同為0.01 mg/mL時，3種樣品的抗氧化能力均比Trolox強，其中IWNLN活性最強，ORAC值可達（7.614±0.138）mg TE/mg。這是由于IWNLN上有芳香族氨基酸Trp，在ORAC反應中，易失去氫原子而與自由基發(fā)生反應，并且Trp還與Asn相連，可產(chǎn)生共軛效應[35-36]，使得氫質(zhì)子更易釋放。

如圖5（d）所示，3種樣品對羥自由基清除能力均呈現(xiàn)出劑量效應，經(jīng)過計算，3種樣品的IC50分別是（0.051±0.002）、（0.038±0.001）mg/mL和（0.008±0.001）mg/mL。研究表明，芳香族氨基酸和疏水性氨基酸因其特殊的結構，具有非常強的自由基清除能力[37]，而五肽IWNLN上不僅具有芳香族氨基酸Trp，還具有疏水性氨基酸Ile和Leu，占整個肽序列的3/5，因此IWNLN具有較強的羥自由基清除能力。

圖5 豆粕抗氧化肽的抗氧化活性Fig.5 Antioxidant activity of soybean meal antioxidant peptides

3 結 語

以ABTS自由基清除率為主要評價指標，通過單因素和響應面實驗確定了采用超聲輔助酶解法制備大豆抗氧化肽的最優(yōu)工藝參數(shù)為：酶解pH 8.0、底物質(zhì)量分數(shù)9%、加酶量6 665.39 U/g、酶解溫度50℃、酶解時間4.0 h、超聲時間9 min、超聲功率300 W。經(jīng)過超濾處理，獲得相對分子質(zhì)量<1 000的組分進行LC-MS/MS鑒定，獲得豆粕源抗氧化肽Ile-Trp-Asn-Leu-Asn（IWNLN），其ABTS自由基清除能力的IC50值為（0.060±0.003）mg/mL，ORAC值為（7.614±0.138）mg TE/mg，羥自由基清除能力的IC50值為（0.008±0.001）mg/mL。研究表明，豆粕源肽IWNLN具有明確的結構和良好的抗氧化活性，可作為抗氧化功能因子為豆粕抗氧化肽功能食品開發(fā)提供新的思路。