湯 恒， 張 娟， 堵國(guó)成

（江南大學(xué) 生物工程學(xué)院/工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫214122）

人乳的蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度與動(dòng)物源乳制品有較大差異（見(jiàn)表1），這使得免疫系統(tǒng)容易將非人源的蛋白質(zhì)判定為過(guò)敏原因子，并引起一系列超敏反應(yīng)[1]。酪蛋白作為牛乳蛋白質(zhì)的主要成分大約占總蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)的80%，其中許多組分并不存在于母乳之中，如αs1酪蛋白、αs2酪蛋白和γ酪蛋白，這些組分很難被人體內(nèi)蛋白酶消化水解，并可能以完整的結(jié)構(gòu)進(jìn)入人體血液中引起過(guò)敏反應(yīng)[2]。目前普遍認(rèn)為αs1酪蛋白是主要的過(guò)敏原[3]，從表1也可以看出，αs1酪蛋白是人乳和牛乳中差別最大的蛋白質(zhì)。

表1 人乳和牛乳的成分比較Table 1 Composition of human and bovine milk

αs1酪蛋白作為過(guò)敏原極難被降解的原因在于乳制品中酪蛋白相互之間極易形成酪蛋白膠粒，一般由αs1酪蛋白、αs2酪蛋白、β酪蛋白和κ酪蛋白組成，這些多為分散的、大的、近似球形的膠體粒子，直徑一般在50~600 nm之間[4]。有研究表明，酪蛋白膠粒中β酪蛋白和κ酪蛋白可形成大量分子間二硫鍵，而巴氏滅菌的高溫可使得這些二硫鍵更為復(fù)雜，這使得膠粒更難被蛋白酶降解[5]。

一般破壞二硫鍵需要合適的堿性環(huán)境和二硫還原酶或與二硫還原酶功能相似的化學(xué)還原劑。二硫還原酶包括烷基過(guò)氧化氫還原酶[6]、硫氧還原蛋白還原酶[7]和二氫硫辛酸脫氫酶[8]等；化學(xué)還原劑包括β-巰基乙醇、巰乙酸和二硫蘇糖醇等。此外在生物水解中，許多角蛋白分解菌可生成亞硫酸鹽破壞角蛋白酶中的二硫鍵，從而輔助水解過(guò)程的進(jìn)行[9]。

過(guò)氧化氫酶主要存在于細(xì)胞及組織內(nèi)的過(guò)氧化體中，參與許多重要反應(yīng)，是生物體維持穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵酶，也被廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)，如維持還原環(huán)境防止食物被氧化[10]?？莶菅挎邨U菌中的植物過(guò)氧化氫酶是為數(shù)不多的胞外分泌型過(guò)氧化氫還原酶，可以催化過(guò)氧化氫分解成氧和水。David等[11]的研究表明，其主要功能為協(xié)助細(xì)胞及細(xì)胞分泌的胞外酶對(duì)抗環(huán)境中的氧化應(yīng)激。本研究中結(jié)合ELISA和質(zhì)譜鑒定，比對(duì)兩株種屬相同的野生菌發(fā)酵液酶活，以及胞外酶的差異，發(fā)現(xiàn)了枯草芽孢桿菌植物過(guò)氧化氫酶除已報(bào)道功能外，還具有破壞酪蛋白膠粒的二硫鍵，協(xié)助蛋白酶高效水解過(guò)敏原αs1酪蛋白。此外，我們還將過(guò)氧化氫酶與蛋白酶混合水解脫脂奶粉，使用HPLC和LC-MS/MS分析了水解產(chǎn)物的口感和所生成的功能性多肽，為未來(lái)使用混合酶制劑制備脫敏奶制品提供一定理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種與載體E.coliDH5α和E.coliBL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞：生工生物工程（上海）股份有限公司產(chǎn)品；枯草芽孢桿菌S7（菌種保藏編號(hào)CCTCC NO.M2016532）：中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心；原核表達(dá)載體pET-24a（+）：Novagen公司產(chǎn)品。

1.1.2 主要試劑 細(xì)菌小量質(zhì)粒提取試劑盒、細(xì)菌基因組提取試劑盒、卡那霉素和Taq DNA聚合酶：生工生物工程 （上海）股份有限公司產(chǎn)品；PrimerSTAR DNA聚合酶、SYBR Premix Ex Taq Kit和DNA連接酶：大連寶生物工程有限公司產(chǎn)品；Human casein alpha s1（CSN1S1）ELISA試劑盒：武漢華美生物工程有限公司產(chǎn)品；NuPAGE Bis-Tris蛋白質(zhì)預(yù)制膠和脫脂奶粉：賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司產(chǎn)品；其余試劑均為分析純。

1.1.3 儀器與設(shè)備 高通量全自動(dòng)菌種篩選及蛋白質(zhì)結(jié)晶工作站（移液工作站）：瑞士帝肯公司產(chǎn)品；MALDI-TOF/TOF基質(zhì)輔助激光解析電離串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜儀：美國(guó)布魯克·道爾頓公司產(chǎn)品；游離氨基酸分析專(zhuān)用高效液相色譜儀：美國(guó)安捷倫科技有限公司產(chǎn)品；Q ExactiveTMPlus混合四極軌道質(zhì)譜儀：美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 目標(biāo)菌的高通量篩選 將從奶牛牧場(chǎng)收集到的土樣處理后，初步獲得3 000株野生菌，使用高通量全自動(dòng)菌種篩選工作站將野生菌轉(zhuǎn)移至篩選平板（200 g/L馬鈴薯煮爛后經(jīng)6層紗布過(guò)濾獲得的濾過(guò)液，20 g/L葡萄糖，15 g/L脫脂奶粉，15 g/L瓊脂粉），挑選產(chǎn)生水解圈的野生菌劃線轉(zhuǎn)移至新的平板（見(jiàn)圖1）。

圖1 脫脂奶粉平板篩選Fig.1 Skim milk plate screening

1.2.2 針對(duì)底物αs1酪蛋白選擇性的ELISA分析將各野生菌編號(hào)并轉(zhuǎn)移至PDA液體培養(yǎng)基（200 g/L馬鈴薯煮爛后經(jīng)6層紗布過(guò)濾獲得的濾過(guò)液，20 g/L葡萄糖）中，30℃恒溫培養(yǎng)至指數(shù)生長(zhǎng)期，取發(fā)酵液上清液測(cè)定酶活進(jìn)行復(fù)篩鑒定。先通過(guò)OPA法測(cè)定針對(duì)脫脂奶粉的酶活，再逐步稀釋各個(gè)野生菌發(fā)酵液上清液，使其針對(duì)脫脂奶粉的酶活達(dá)到同一水平，以減少發(fā)酵液復(fù)雜成分帶來(lái)的影響，此后繼續(xù)以脫脂奶粉作為底物重復(fù)相同的水解過(guò)程，但使用針對(duì)αs1酪蛋白的ELISA試劑盒檢測(cè)各個(gè)發(fā)酵液上清液對(duì)于特定過(guò)敏原的酶活，以確定各個(gè)野生菌對(duì)于過(guò)敏原的選擇性高低。

1.2.3 發(fā)酵液上清液蛋白質(zhì)的肽指紋圖譜分析將各個(gè)野生菌發(fā)酵液上清液進(jìn)行SDS-PAGE分析，對(duì)不同相對(duì)分子質(zhì)量大小的膠條進(jìn)行預(yù)處理后，與胰蛋白酶混合，37℃酶解過(guò)夜，處理后點(diǎn)靶進(jìn)行質(zhì)譜分析，質(zhì)譜結(jié)果與mascot數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行肽段比對(duì)鑒定。

1.2.4 重組植物過(guò)氧化氫酶的構(gòu)建 以提取的枯草芽孢桿菌S7基因組為模板，根據(jù)飛行質(zhì)譜結(jié)果獲得的植物過(guò)氧化氫酶基因序列設(shè)計(jì)引物（見(jiàn)表2），PCR擴(kuò)增從而獲取目的基因片段。隨后將載體pET-24a（+）與PCR產(chǎn)物分別與相對(duì)應(yīng)的限制性內(nèi)切酶混合，在37℃下孵育1.5 h，兩者酶切產(chǎn)物經(jīng)過(guò)膠回收純化后用DNA連接酶連接，在16℃下連接6~8 h，連接產(chǎn)物通過(guò)熱激法轉(zhuǎn)化E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞，在LB卡那霉素抗性平板上挑取陽(yáng)性克隆子，菌落PCR驗(yàn)證后提取質(zhì)粒，經(jīng)過(guò)測(cè)序鑒定，最終獲得含有目的基因的重組質(zhì)粒pET-24a（+）/katA。將質(zhì)粒pET-24a（+）/katA轉(zhuǎn)化E.coliBL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，最終獲得重組植物過(guò)氧化氫酶表達(dá)菌株。

表2 PCR引物序列Table 2 PCR primers sequence

1.2.5 重組蛋白的純化 純化過(guò)程全部在4℃下進(jìn)行，將離心收集的重組菌充分倒入培養(yǎng)基。將菌體重懸于25 mL緩沖液A（200 mmol/L Tris-HCl（pH 7.4），500 mmol/L NaCl，5 mmol/Lβ-mercaptoethanol）中，使用Branson Sonifier 450對(duì)細(xì)胞進(jìn)行了超聲破壁處理，高速離心后收集破碎液上清液。再采用AKTA Start（GE Healthcare）和HisTrap親和柱對(duì)目標(biāo)蛋白質(zhì)進(jìn)行純化，在經(jīng)緩沖液A平衡后接入上清液，先使用含5 mmol/L咪唑的緩沖液A進(jìn)行清洗后，使用含300 mmol/L咪唑的緩沖液A進(jìn)行洗脫，獲得重組植物過(guò)氧化氫酶。

1.2.6 脫脂奶粉水解產(chǎn)物的LC-MS/MS活性多肽鑒定 水解產(chǎn)物經(jīng)過(guò)超濾、脫鹽等預(yù)處理后，直接加載到反相預(yù)柱（Acclaim PepMap RSLC）進(jìn)行肽段分離，分離后肽段經(jīng)Q ExactiveTMPlus混合四極軌道質(zhì)譜儀分析，收集的串聯(lián)質(zhì)譜結(jié)果上傳至mascot搜索引擎進(jìn)行分析，比對(duì)后獲得對(duì)應(yīng)的肽段序列。

2 結(jié)果與分析

2.1 針對(duì)底物αs1酪蛋白高選擇性的野生菌篩選與鑒定

將篩選獲得的野生菌進(jìn)行16S rRNA和功能基因gyrA鑒定，以確定各個(gè)野生菌的種屬，再分別進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，獲得其發(fā)酵液上清液。由于不同野生菌蛋白酶表達(dá)量不同，無(wú)法直接使用發(fā)酵液上清液進(jìn)行橫向比較。而OPA法可檢測(cè)整個(gè)體系水解程度，ELISA可以檢測(cè)水解反應(yīng)體系中針對(duì)某一特定底物的水解程度，利用此特點(diǎn)設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，首先通過(guò)OPA法確定各個(gè)發(fā)酵液的酶活，再分別稀釋?zhuān)蛊溽槍?duì)整體底物脫脂奶粉的酶活達(dá)到相同水平。此后，將調(diào)整濃度后的發(fā)酵液對(duì)脫脂奶粉進(jìn)行水解反應(yīng)，并通過(guò)ELISA分析對(duì)底物αs1酪蛋白的酶活。如此可篩選出對(duì)混合底物脫脂奶粉的酶活相同時(shí)，對(duì)過(guò)敏原αs1酪蛋白選擇性更高的蛋白酶產(chǎn)生菌。如圖2所示，橫坐標(biāo)為各個(gè)野生菌的種屬名和篩選編號(hào)，縱坐標(biāo)為調(diào)整后發(fā)酵液上清液的水解αs1酪蛋白酶活。其中酶活最高的為枯草芽孢桿菌S7（Bacillus subtilisS7）發(fā)酵液上清液，而作為對(duì)照的商業(yè)酶A-2SD和NY-10酶活較低。在總酶活調(diào)整一致的情況下，其他野生菌針對(duì)過(guò)敏原酶活水平不高，如嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌S2、綠膿假單胞菌S8（非食品安全菌），故選擇枯草芽孢桿菌S7為去除過(guò)敏原的主要研究對(duì)象，并進(jìn)行菌種保藏（CCTCC NO.M2016532）。同時(shí)被鑒定為枯草芽孢桿菌的還有S21和S23，值得關(guān)注的是S21和S23酶活水平接近，但與S7有顯著差異。

圖2 針對(duì)αs1酪蛋白作為底物的酶活性比較Fig.2 Activities of each enzyme usingαs1-casein as the substrate

2.2 關(guān)鍵酶鑒定

通過(guò)比對(duì)S7和S21的發(fā)酵液上清液進(jìn)行SDS-PAGE分析發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌S7在5.5×104位置分泌的一種蛋白質(zhì)在S21發(fā)酵液中分泌量極少。此后使用MALDI-TOF/TOF對(duì)各個(gè)條帶進(jìn)行肽指紋圖譜分析，如圖3所示，以3.2×104的鞭毛蛋白（UniProtKB：P02968，含量最高條帶）作為對(duì)比參照，主要蛋白酶為2.8×104的枯草芽孢桿菌蛋白酶E（UniProtKB：P04189），而表達(dá)量差異最大是5.5×104的植物過(guò)氧化氫酶（UniProtKB：P26901）。

圖3 S7和S21發(fā)酵液上清液SDS-PAGE分析Fig.3 SDS-PAGE analysis of the supernatants after S7 and S21 fermentation

2.3 植物過(guò)氧化氫酶的重組表達(dá)及功能驗(yàn)證

通過(guò)從枯草芽孢桿菌S7中調(diào)取植物過(guò)氧化氫酶基因，并構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒，獲得異源表達(dá)菌株。再通過(guò)誘導(dǎo)表達(dá)和鎳柱親和層析法，獲得了重組植物過(guò)氧化氫酶。如圖4中SDS-PAGE所示，泳道1為鎳柱純化流穿峰，泳道2為5 mmol/L咪唑洗脫峰，泳道3為300 mmol/L咪唑洗脫峰，在5.5×104左右可見(jiàn)明顯條帶，證明獲得可融性表達(dá)的重組酶。

圖4 重組枯草芽孢桿菌S7植物過(guò)氧化氫酶的鎳柱純化SDS-PAGE分析Fig.4 SDS-PAGE analysis of recombinant vegetative catalase from Bacillus subtilis S7 nickel column purification

通過(guò)將純化后的重組植物過(guò)氧化氫酶回補(bǔ)至S21發(fā)酵液上清液中，S21水解αs1酪蛋白的酶活從75.43 U/L提升至106.18 U/L達(dá)到與S7的119.43 U/L相近水平，從而證明了S7和S21的酶活差異主要是由植物過(guò)氧化氫酶的表達(dá)量差異導(dǎo)致的。據(jù)此，我們發(fā)現(xiàn)植物過(guò)氧化氫酶不僅可以水解過(guò)氧化氫，維持更好的還原環(huán)境，協(xié)助枯草芽孢桿菌蛋白酶E抵抗氧化應(yīng)激，保護(hù)其結(jié)構(gòu)不被自由基破壞，增加蛋白酶作用時(shí)間；可能還具有破壞蛋白膠粒中的二硫鍵，將其中的過(guò)敏原αs1酪蛋白釋放出來(lái)，使蛋白酶可以更高效地進(jìn)行水解反應(yīng)，增強(qiáng)蛋白酶的選擇性脫敏效果（見(jiàn)圖5）。

2.4 植物過(guò)氧化氫酶對(duì)風(fēng)味的影響

采用已報(bào)道的高效液相色譜法[12]測(cè)定S7和S21發(fā)酵液上清液水解脫脂奶粉后水解產(chǎn)物中游離氨基酸的濃度，并比對(duì)二者差別。如圖6所示，兩種枯草芽孢桿菌的發(fā)酵液上清液可水解脫脂奶粉生成氨基酸比例相似的水解產(chǎn)物，如均可生成較多親水氨基酸，如谷氨酸（E）和酪氨酸（Y），以及較多的疏水氨基酸，如纈氨酸（V）、亮氨酸（L）和苯丙氨酸（F）。但由于S7發(fā)酵液上清液中含有較多的植物過(guò)氧化氫酶，可打開(kāi)二硫鍵使得更多的水解位點(diǎn)得以暴露，有效增加蛋白酶對(duì)酪蛋白膠粒，特別是其中αs1酪蛋白的水解，同時(shí)也就形成了對(duì)風(fēng)味更為有利的水解產(chǎn)物，如相比于S21生成了較多親水氨基酸賴氨酸（K），且生成的疏水氨基酸濃度和比例也呈顯著下降。

圖6 S7和S21發(fā)酵液上清液水解脫脂奶粉后水解產(chǎn)物中游離氨基酸對(duì)比Fig.6 Comparison of free amino acids in the skim milk hydrolysate between S7 and S21

水解產(chǎn)物中的苦澀風(fēng)味主要來(lái)自各類(lèi)疏水氨基酸，如亮氨酸（L）和苯丙氨酸（F），而甲硫氨酸（M）則會(huì)帶來(lái)類(lèi)似肉類(lèi)、蛋類(lèi)的不良風(fēng)味[13]，這對(duì)于奶粉的制備是不利影響。為驗(yàn)證其風(fēng)味，邀請(qǐng)5位品鑒人對(duì)微量S7和S21水解5 h后的脫脂奶粉水解液進(jìn)行感官評(píng)定實(shí)驗(yàn)，并給予0~5分的打分。如表3所示，相比于未處理的脫脂奶粉，兩種水解液苦味均有增加，但S7的水解液苦味較低更易被接受。由于植物過(guò)氧化氫酶的加入，水解產(chǎn)物中的親水氨基酸增多且疏水氨基酸減少，這使得水解后的脫敏奶制品具有更易接受的風(fēng)味及應(yīng)用價(jià)值。

表3 感官評(píng)定Table 3 Sensory evaluation

2.5 脫脂奶粉水解產(chǎn)物的功能性多肽鑒定

將枯草芽孢桿菌S7的脫脂奶粉水解產(chǎn)物進(jìn)行LC-MS/MS活性多肽鑒定，在獲得肽段序列后與已報(bào)道的文獻(xiàn)進(jìn)行比對(duì)。如表4所示，水解產(chǎn)物中含有抗高血壓活性多肽5種，以及抗菌活性多肽、礦物質(zhì)結(jié)合活性多肽、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制活性多肽、免疫調(diào)制活性多肽和抗癌活性多肽各1種，這些肽在天然蛋白質(zhì)中并無(wú)活性，在被水解釋放后才具有活性。他們可以以完整的形式被吸收，在腸道局部發(fā)揮各種生理作用，也可以在進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)后產(chǎn)生全身作用[14]。進(jìn)一步證明植物過(guò)氧化氫酶和枯草芽孢桿菌蛋白酶E混合水解的脫敏奶制品具有更好應(yīng)用價(jià)值。

表4 功能性多肽鑒定Table 4 Identification of functional peptides

3 結(jié)語(yǔ)

αs1酪蛋白是奶制品的主要過(guò)敏原，人體自身消化系統(tǒng)難以水解，從而導(dǎo)致該過(guò)敏原可完整的通過(guò)消化系統(tǒng)進(jìn)入血液從而誘發(fā)人體過(guò)敏反應(yīng)。αs1酪蛋白難以被水解的主要原因在于各種酪蛋白容易通過(guò)疏水作用和分子間二硫鍵相互交聯(lián)形成酪蛋白膠粒，使得過(guò)敏原αs1酪蛋白被包裹其中，蛋白酶難以接觸其水解位點(diǎn)?；瘜W(xué)還原劑可有效破壞各類(lèi)二硫鍵，但難以應(yīng)用于食品工業(yè)中。相比而言，生物還原劑則具有用量少、可高溫滅活去除等優(yōu)點(diǎn)，如烷基過(guò)氧化氫還原酶、硫氧還原蛋白還原酶和二氫硫辛酸脫氫酶等均被報(bào)道可有效破壞二硫鍵，但這些二硫還原酶均為胞內(nèi)酶難以適應(yīng)胞外復(fù)雜環(huán)境；Sri等[22]報(bào)道了來(lái)自Bacillussp.MTS的一種分泌型二硫還原酶，但其原始菌非食品安全菌。此外，使用其他來(lái)源的分泌型二硫還原酶極可能與篩選獲得的枯草芽孢桿菌蛋白酶E不適配，導(dǎo)致其被蛋白酶水解而無(wú)法發(fā)揮作用，故挑選枯草芽孢桿菌植物過(guò)氧化氫酶輔助水解。在此前的報(bào)道中，此酶已被多次證實(shí)可幫助細(xì)胞和分泌酶對(duì)抗氧化應(yīng)激[11，22]，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在其存在的情況下，枯草芽孢桿菌蛋白酶E對(duì)于水解αs1酪蛋白的酶活可增強(qiáng)約1.5倍，從而推測(cè)該酶可促進(jìn)蛋白酶水解富含二硫鍵的底物。將獲得的枯草芽孢桿菌蛋白酶E和枯草芽孢桿菌植物過(guò)氧化氫酶混合，應(yīng)用于脫敏奶制品制備，其產(chǎn)品除了具有低過(guò)敏原，還有相對(duì)容易接受的口感并含有一定的生物功能性多肽，具有較好的食品工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。