林也　廖菁　戴宗順　張婷　胡勝濤　張二兵　易歐陽　張逢　王莘智　李鑫　蔡雄

〔摘要〕 目的 明確風寒濕外邪作用于促紅細胞生成素（EPO）影響痹證（類風濕關(guān)節(jié)炎）的發(fā)生機制。方法 （1） 30只雄性SD大鼠隨機分為正常對照組、單純完全弗氏佐劑（CFA）組、風寒濕+CFA組，每組10只大鼠。單純CFA組大鼠正常飼養(yǎng)14 d，風寒濕+CFA組大鼠風寒濕刺激14 d，再尾根部皮下注射0.1 mL含100 μg熱滅活結(jié)核桿菌（Mtb）的CFA誘導佐劑性關(guān)節(jié)炎（AIA）。分別于實驗前、風寒濕刺激14 d及CFA免疫后7 d尾動脈取血，采用ELISA法檢測血清EPO含量。（2） 30只雄性SD大鼠隨機分為單純CFA組、風寒濕+CFA組、風寒濕+CFA+rhEPO組，每組10只大鼠。單純CFA組正常飼養(yǎng)14 d，風寒濕+CFA組、風寒濕+CFA+rhEPO組，風寒濕刺激14 d，再尾根部皮下注射0.1 mL含100 μg Mtb的CFA誘導AIA。風寒濕+CFA+rhEPO組自風寒濕刺激第1天起，尾靜脈注射重組人促紅細胞生成素（rhEPO）。觀察大鼠的發(fā)病時間和發(fā)病率;CFA免疫后8 d，腹主動脈取血，采用ELISA法檢測血清TNF-α含量。（3） 選取RA寒濕痹阻證伴慢性疾病性貧血患者、RA寒濕痹阻證伴缺鐵性貧血患者、RA寒濕痹阻證無貧血患者及健康志愿者各20例，取靜脈血，采用ELISA法檢測血清EPO含量。結(jié)果 （1）風寒濕刺激14 d及CFA免疫后7 d，風寒濕+CFA組大鼠血清EPO水平明顯低于正常對照組大鼠和單純CFA組大鼠（P<0.05）。（2）風寒濕+CFA+rhEPO 組大鼠AIA發(fā)病時間和發(fā)病率與單純CFA組相比無顯著差異;風寒濕+CFA+rhEPO組大鼠血清TNF-α含量顯著低于風寒濕+CFA組大鼠（P<0.01），而與單純CFA組相比無顯著性差異。（3）RA寒濕痹阻證伴慢性病貧血患者血清EPO含量顯著高于健康志愿者（P<0.01），但卻顯著低于RA寒濕痹阻證伴缺鐵性貧血組（P<0.05）。結(jié)論 風寒濕外邪通過抑制EPO表達而影響痹證（類風濕關(guān)節(jié)炎）的發(fā)生。

〔關(guān)鍵詞〕 痹證;類風濕關(guān)節(jié)炎;風寒濕外邪;佐劑性關(guān)節(jié)炎;EPO

〔中圖分類號〕R285.5? ? ? ?〔文獻標志碼〕A? ? ? ?〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2021.03.004

〔Abstract〕 Objective To clarify the mechanism of the effect of exogenous wind-cold-damp on erythropoietin （EPO） on Bi syndrome （rheumatoid arthritis， RA）. Methods （1） 30 male SD rats were randomly assigned into control group， alone complete Freunds adjuvant （CFA） group and wind-cold-damp+CFA group， 10 rats in each group. Alone CFA group was routinely fed for 14 days. The wind-cold-damp+CFA group was received wind-cold-damp stimulation for 14 days， 0.1 mL CFA comtaining 100 μg Mycobactrium tuberculosis （Mtb） was subcutaneously injected into the base of the tails root to induce adjuvant-induced arthritis （AIA）. Blood samples were collected from tails artery before the experiment， 14 days after wind-cold-damp stimulation， and 7 days after the CFA immunization. EPO expression was detected by ELISA. （2） 30 male SD rats were randomly assigned into alone CFA group， wind-cold-damp+CFA group and wind-cold-damp+CFA+recombinant human erythropoietin （rhEPO） group， 10 rats in each group. The alone CFA group was routinely fed for 14 days. The wind-cold-damp+CFA group and wind-cold-damp+CFA+rhEPO group were received wind-cold-damp stimulation for 14 days， 0.1 mL CFA comtaining 100 μg Mtb was subcutaneously injected into the base of the tails root to induce AIA. The wind-cold-damp+CFA+rhEPO group was injected into rhEPO through tail vein from the first day of wind-cold-damp stimulation. The morbidity was daily observed， and the incidence was calculated. On day 8 after CFA immunization， blood samples were collected from abdominal aorta， and serum TNF-level was measured by ELISA. （3） Each twenty patients of the RA cold-dampness syndrome combine with chronic anaemia， the RA cold-damp syndrome combine with iron-deficiency anaemia， the RA cold-damp syndrome without anemia and healthy volunteers were selected， and collected those venous blood. The content of EPO in serum was detected by ELISA. Results （1） The EPO expression in wind-cold-damp+CFA group that in 14 days after wind-cold-damp stimulation， and 7 days after the CFA immunization were obviously below than that in control group and alone CFA group （P<0.05）. （2） The morbidity and incidence of AIA were no significant differences between the wind-cold-damp+CFA+rhEPO group and alone CFA group. TNF-level in wind-cold-damp+CFA+rhEPO group was significantly lower than that in wind-cold-damp+CFA group （P<0.01）， but had no significant difference from that in alone CFA group. （3） The serum EPO in RA cold-damp syndrome combine with chronic anaemia was significantly higher than that of healthy volunteers （P<0.01）， it was significantly lower than that of RA cold dampness syndrome combine with iron deficiency anemia group （P<0.05）. Conclusion Exogenous wind-cold-damp stimulation promotes the onset and incidence of Bi syndrome （RA） through inhibiting erythropoietin expression.

〔Keywords〕 Bi syndrome; rheumatoid arthritis; exogenous wind-cold-damp; adjuvant-induced arthritis; EPO

痹證是以肢體關(guān)節(jié)、筋骨肌肉疼痛、重著、麻木甚或屈伸不利、強直僵硬、腫脹變形為主要癥狀的臨床常見病證[1]。對其病因病機認識，《黃帝內(nèi)經(jīng)·痹論篇》謂：“風寒濕三氣雜至，合而為痹也”，“不與風寒濕合，故不為痹”，被后世醫(yī)家奉為圭皋[2-3]。類風濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis， RA）是以關(guān)節(jié)滑膜慢性炎癥反應(yīng)、進行性關(guān)節(jié)骨質(zhì)破壞和關(guān)節(jié)功能喪失為臨床特征的自身免疫疾病[4]。RA屬于中醫(yī)學“痹證”范疇，與“歷節(jié)”“鶴膝風”“尪痹”等病證相似，中醫(yī)學認為其主要由于機體正氣不足，又合時重感于風寒濕之邪氣，三氣挾雜入侵，痹阻經(jīng)絡(luò)、筋骨、關(guān)節(jié)而發(fā)病[5]。現(xiàn)代研究亦證實，長期居住或工作在潮濕、陰冷等環(huán)境因素與RA發(fā)病密切相關(guān)[6-7]。由此可見，風寒濕太過的環(huán)境因素（外邪）是類風濕關(guān)節(jié)炎發(fā)生的基本病理因素。

基于“風寒濕三氣雜至合而為痹也”的中醫(yī)經(jīng)典理論和現(xiàn)代醫(yī)學對于環(huán)境因素在RA發(fā)病機制中重要作用的認識，我們前期研究[8]發(fā)現(xiàn)，風寒濕刺激顯著影響佐劑性關(guān)節(jié)炎（adjuvant-induced arthritis， AIA）的發(fā)病時間及發(fā)病率，但其作用機制尚不明確。

研究[9-11]表明，貧血是RA患者常見的關(guān)節(jié)外表現(xiàn)，RA患者體內(nèi)促紅細胞生成素（erythropoietin， EPO）水平相對不足，其貧血程度與病情活動及嚴重程度密切相關(guān)，且與血紅蛋白水平的關(guān)系比抗腫瘤壞死因子-α（TNF-α）或白細胞介素-6（IL-6）受體的作用更密切。有研究[12]顯示，EPO作用于巨噬細胞而發(fā)揮較強的抗炎和免疫抑制效應(yīng)。因此，基于課題組前期研究基礎(chǔ)，進一步研究風寒濕外邪對EPO的影響，以期明確風寒濕外邪影響痹證發(fā)生的分子機制。

1 材料

1.1? 動物

雄性SD系大鼠，體質(zhì)量90～110 g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學實驗動物中心，許可證號SYXK（湘）2019-0009，溫度22～25 ℃，相對濕度40%～70%，12 h∶12 h晝夜交替。

1.2? 病例

研究病例來源于2016年11月至2017年12月在湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院風濕內(nèi)科就診且確診的RA寒濕痹阻證患者。

1.3? 試劑

熱滅活結(jié)核分枝桿菌H37Ra （Mycobacterium tuberculosis， Mtb）（美國Sigma Aldrich公司，20170320）;礦物油（美國Sigma Aldrich公司，M8410）;異氟烷氣體麻醉劑（深圳市瑞沃德生命科技有限公司，084989）;大鼠EPO、人EPO、TNF-α ELISA檢測試劑盒（天津安諾瑞康生物技術(shù)有限公司，20170615，

20171225、20170720）;重組人促紅細胞生成素（recombinant human erythropoietin， rhEPO）（上海凱茂生物醫(yī)藥有限公司，批號：20170712）。

1.4? 儀器

PRX-150B改良的智能人工氣候箱（上海汗諾公司）;ATY224電子天平（日本島津公司）;CDS9000氣體麻醉機（美國SurgiVet公司）;5810R高速冷凍離心機（德國Eppendorf公司）;酶標儀（美國Bio-Rad公司）。

2方法

2.1? 風寒濕刺激對大鼠血清EPO含量影響

2.1.1? 造模及分組? 參考文獻[8]建立動物模型，雄性SD大鼠隨機分為正常對照組（10只）、單純CFA組（10只）、風寒濕+CFA組（10只）。單純CFA組大鼠正常飼養(yǎng)14 d天，風寒濕+CFA組大鼠風寒濕刺激14 d，尾根部皮內(nèi)注射0.1 mL含100 μg Mtb的CFA誘導AIA。風寒濕刺激采用改良的智能人工氣候箱，刺激條件：風速5 m/s，溫度 0～2 ℃、相對濕度90%～95%。

2.1.2? 大鼠血清EPO檢測? 分別于實驗開始前、風寒濕刺激或正常飼養(yǎng)14 d以及CFA免疫后7 d尾動脈取血，4 ℃、3 000 r/min離心15 min，取血清，采用ELISA檢測血清EPO含量。

2.2? 注射rhEPO對大鼠發(fā)病時間和發(fā)病率的影響

2.2.1? 造模及分組? 雄性SD大鼠隨機分為單純CFA組（10只）、風寒濕+CFA組（10只）、風寒濕+CFA+rhEPO組（10只）。單純CFA組大鼠正常飼養(yǎng)14 d，風寒濕+CFA組、風寒濕+CFA+rhEPO組大鼠風寒濕刺激14 d，刺激條件及方法同上。三組大鼠分別于尾根部皮下注射0.1 mL含100 μg Mtb的CFA誘導AIA。風寒濕+CFA+rhEPO組大鼠自風寒濕刺激第1天起，尾靜脈注射2 000 IU/kg的rhEPO，每天1次，共21 d。

2.2.2? 觀察大鼠發(fā)病時間與發(fā)病率? 自注射CFA起，每天觀察并記錄大鼠的發(fā)病時間和發(fā)病率。

2.2.3? 大鼠血清含量TNF-α檢測? CFA免疫后第8天，腹主動脈取血，4 ℃、3 000 r/min離心15 mim，取血清，采用ELISA法檢測血清TNF-α含量。

2.3? 臨床實驗觀察

2.3.1? 病例納入情況? RA寒濕痹阻證伴慢病貧血患者20例，男10例，女10例，年齡（43.75±8.47）歲，病程（4.27±1.51）年;RA寒濕痹阻證伴缺鐵性貧血患者20例，男8例，女12例，年齡（44.15±7.89）歲，病程（4.15±2.32）年;RA寒濕痹阻證無貧血患者20例，男9例，女11例，年齡（44.02±8.85）歲，病程（4.48±2.80）年。健康志愿者20例，男10例，女10例，年齡（43.05±6.25）歲，來源于體檢科體檢報告顯示健康者。

2.3.2? 診斷標準? RA診斷標準[13]：依據(jù)美國風濕病協(xié)會/歐洲風濕病防治聯(lián)合會（American Rheumatism Association/ European League Against Rheumatism， ACR/EULAR） RA分類標準和評分系統(tǒng)（2010）：（1）至少一個關(guān)節(jié)腫痛，并有滑膜炎證據(jù);同時排除了其他疾病引起的關(guān)節(jié)炎，并有常規(guī)放射學RA 骨破壞改變證據(jù)，即可確診。（2）根據(jù)關(guān)節(jié)受累情況、血清學指標、滑膜炎持續(xù)時間和急性時相反應(yīng)物4個部分進行評分，總分≥6分，即可確診。

RA寒濕痹阻證診斷標準[14]： 依據(jù)《中藥新藥臨床研究指導原則（2002版）》之寒濕痹阻證辨證標準，主癥：關(guān)節(jié)冷痛而腫，遇寒痛增，得熱痛減，關(guān)節(jié)屈伸不利，晨僵，關(guān)節(jié)畸形。次癥：口淡不渴，惡風寒，陰雨天加重，肢體沉重。舌脈：舌質(zhì)淡，苔白，脈弦緊;具備主癥兼次癥三項、參照舌脈即辨證為寒濕痹阻證。

貧血診斷標準：依據(jù)成年男性Hb<120 g/L、RBC<4.5×1012及（或）HCT<0.42;女性Hb<110 g/L、RBC<4.0×1012及（或）HCT<0.37，即可診斷。

RA寒濕痹阻證伴慢性疾病性貧血診斷標準[15]：符合RA及寒濕痹阻證診斷標準及貧血診斷標準，血清鐵蛋白（SF）>60 μg/L，且所有患者肝腎功能均正常，無出血，網(wǎng)織紅細胞計數(shù)正常，溶血相關(guān)檢查正常，葉酸、維生素B12檢查正常，進而排除缺鐵性貧血、巨幼細胞性貧血、溶血性貧血和肝腎功能嚴重損害所致的貧血等。

RA寒濕痹阻證伴缺鐵性貧血診斷標準[15]：血清鐵降低，總鐵結(jié)合率增高，SF<60 μg/L，即可確診。

2.3.3? 人血清EPO含量檢測? 患者及健康志愿者分別取清晨空腹靜脈血，4 ℃、3 000 r/min離心15 min，取血清，采用ELISA法檢測血清EPO含量。

2.4? 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計學分析，計量資料描述用“x±s”表示，采用t檢驗和方差分析的統(tǒng)計學方法;計數(shù)資料的統(tǒng)計分析采用卡方檢驗的統(tǒng)計學方法，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1? 風寒濕刺激對大鼠血清EPO含量影響

風寒濕+CFA組大鼠風寒濕刺激14 d及CFA免疫后7 d時血清EPO水平明顯低于單純CFA組（P<0.05）。見表1。

3.2? 注射rhEPO對大鼠發(fā)病時間及發(fā)病率的影響

與單純CFA組比較，風寒濕+CFA組大鼠發(fā)病時間縮短（P<0.01），發(fā)病率明顯增加（P<0.05），而風寒濕+CFA+rhEPO組大鼠發(fā)病時間及發(fā)病率均無統(tǒng)計學意義。與風寒濕+CFA組比較，風寒濕+CFA+rhEPO組大鼠發(fā)病時間延遲（P<0.01），發(fā)病率顯著降低（P<0.05）。見表2。

3.3? 注射rhEPO對大鼠血清TNF-α含量影響

風寒濕+CFA組大鼠血清TNF-α含量顯著高于單純CFA組（P<0.01）。與風寒濕+CFA組比較，風寒濕+CFA+rhEPO 組大鼠血清TNF-α含量明顯降低（P<0.01），且與單純CFA組大鼠血清TNF-α含量無顯著性差異。見表3。

3.4? RA患者血清EPO含量檢測

RA寒濕痹阻證伴慢性病貧血及RA寒濕痹阻證伴缺鐵性貧血組患者血清EPO含量顯著高于健康志愿者（P<0.01），但RA寒濕痹阻證伴慢性病貧血組患者血清EPO含量顯著低于RA寒濕痹阻證伴缺鐵性貧血組（P<0.05）。見表4。

4 討論

EPO是成人腎皮質(zhì)腎小管周圍間質(zhì)細胞和胎兒肝臟分泌的激素樣造血生長因子。其主要作用是阻斷紅細胞前體細胞的凋亡，促進紅系祖細胞增殖、分化為成熟的紅細胞[16]。EPO在多種非造血組織也表達，可通過與巨噬細胞表面的異源二聚體EPO受體結(jié)合，而發(fā)揮抗炎和免疫抑制效應(yīng)[12，16]。此外，EPO亦能通過阻斷NF-kB p65的活化，抑制活化巨噬細胞中促炎基因的表達，從而發(fā)揮抗炎和免疫抑制作用[17]。另有研究[18]顯示，巨噬細胞特異性EPO受體缺陷型小鼠和慢性肉芽腫性疾病小鼠缺乏呼吸爆發(fā)的能力，炎癥反應(yīng)減弱，而rhEPO在EPO受體缺陷型小鼠和慢性肉芽腫性疾病小鼠中增強了炎癥作用。從機制上講，EPO通過過氧化物酶體增殖劑激活受體-γ增加凋亡中性粒細胞的巨噬細胞吞噬，促進巨噬細胞清除碎片并增強巨噬細胞遷移至引流淋巴結(jié)。

滑膜巨噬細胞異常活化介導促炎性細胞因子TNF-α、IL-1β大量生成，引發(fā)介導關(guān)節(jié)滑膜炎癥反應(yīng)及關(guān)節(jié)破壞的信號通路級聯(lián)反應(yīng)導致RA的發(fā)生發(fā)展[19]。研究顯示，風寒濕刺激14 d及CFA免疫后7 d時，大鼠血清EPO表達顯著降低，提示風寒濕外邪刺激可能抑制EPO的表達。注射外源性rhEPO后，大鼠發(fā)病時間顯著延遲，發(fā)病率顯著降低，且與單純CFA組相當，提示EPO能抑制風寒濕刺激導致的痹證發(fā)生，也佐證風寒濕外邪促進痹證的發(fā)生可能與抑制EPO的表達有關(guān)。

臨床檢測也顯示，RA寒濕痹阻證伴慢性病貧血患者血清EPO含量顯著高于健康組，但顯著低于RA寒濕痹阻證伴缺鐵性貧血組，提示其體內(nèi)EPO含量相對不足，與實驗動物研究結(jié)果相一致。究其原因，可能與RA細胞因子引起腎小管細胞周圍血管損傷，導致EPO產(chǎn)生不足有關(guān)。

TNF-α是介導RA發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵促炎性細胞因子，也是EPO的抑制效應(yīng)分子[10，20]。風寒濕刺激14 d大鼠TNF-α顯著升高，腫脹度和關(guān)節(jié)炎評分顯著增加[8]，給予rhEPO治療后TNF-α顯著降低，提示風寒濕刺激可能通過抑制EPO的生產(chǎn)與表達，進而抑制其抗炎和免疫抑制效應(yīng)，介導TNF-α等關(guān)鍵促炎性細胞因子大量增殖與釋放，從而促進痹證發(fā)生。但其確切的作用機制，尚有待進一步研究。

參考文獻

[1] 霍易飛，吳? 彬，楊宇峰，等.論明清時期對痹證病因病機認識[J]. 遼寧中醫(yī)藥大學學報，2019，21（8）：79-81.

[2] 龔? 雪，汪? 元.類風濕關(guān)節(jié)炎中醫(yī)病因病機研究進展[J].風濕病與關(guān)節(jié)炎，2020，9（6）：62-65.

[3] 楊麗萍，張江華，楊? 劍，等.痹證的病因病機及證型研究現(xiàn)狀[J]. 遼寧中醫(yī)藥大學學報，2008，10（8）：68-70.

[4] FIRESTEIN G S， MCINNES I B. Immunopathogenesis of rheumatoid arthritis[J]. Immunity， 2017， 46（2）： 183-196.

[5] 潘胡丹，劉? 良.類風濕關(guān)節(jié)炎中醫(yī)治療經(jīng)驗探討[J].中醫(yī)雜志， 2016，57（2）：173-175.

[6] R?NNELID J， HANSSON M， MATHSSON-ALM L， et al. Anticitrullinated protein/peptide antibody multiplexing defines an extended group of ACPA-positive rheumatoid arthritis patients with distinct genetic and environmental determinants[J]. Annals of the Rheumatic Diseases， 2018， 77（2）： 203-211.

[7] ZENG P L， BENGTSSON C， KLARESKOG L， et al. Working in cold environment and risk of developing rheumatoid arthritis： Results from the Swedish EIRA case-control study[J]. RMD Open， 2017， 3（2）： e000488.

[8] 李? 鑫，魏艷霞，林? 也，等.風寒濕外邪對痹證（佐劑性關(guān)節(jié)炎）發(fā)生發(fā)展的影響[J].中國中西醫(yī)結(jié)合雜志，2017，37（12）：1496-1501.

[9] OSONG S N J， IWAHASHI M， TOMOSUGI N， et al. Comparative evaluation of the effects of treatment with tocilizumab and TNF-α inhibitors on serum hepcidin， Anemia response and disease activity in rheumatoid arthritis patients[J]. Arthritis Research & Therapy， 2013， 15（5）： R141.

[10] SCHOLZ G A， LEICHTLE A B， SCHERER A， et al. The links of hepcidin and erythropoietin in the interplay of inflammation and iron deficiency in a large observational study of rheumatoid arthritis[J]. British Journal of Haematology， 2019， 186（1）： 101-112.

[11] 余麗君.類風濕關(guān)節(jié)炎伴慢性疾病性貧血患者血清白介素1和促紅細胞生成素水平及其意義[J].中國全科醫(yī)學，2012，15（20）：2265-2267.

[12] NAIRZ M， SONNWEBER T， SCHROLL A， et al. The pleiotropic effects of erythropoietin in infection and inflammation[J]. Microbes and Infection， 2012， 14（3）： 238-246.

[13] ALETAHA D， NEOGI T， SILMAN A J， et al. 2010 Rheumatoid arthritis classification criteria： An American College of Rheumatology/European League Against Rheumatism collaborative initiative[J]. Arthritis and Rheumatism， 2010， 62（9）： 2569-2581.

[14] 國家食品藥品監(jiān)督管理局.中藥新藥臨床研究指導原則（試行）[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社， 2002：115-119.

[15] 國家中醫(yī)藥管理局.尪痹（類風濕關(guān)節(jié)炎）中醫(yī)臨床路徑[M].北京：中國中醫(yī)藥出版社， 2010：247-252.

[16] BIMM H F. Erythropoietin[J]. Cold Spring Harb Perspect Med， 2013， 3（3）： a011619.

[17] NAIRZ M， SCHROLL A， MOSCHEN A R， et al. Erythropoietin contrastingly affects bacterial infection and experimental colitis by inhibiting nuclear factor-κB-inducible immune pathways[J]. Immunity， 2011， 34（1）： 61-74.

[18] LUO B W， WANG J S， LIU Z W， et al. Phagocyte respiratory burst activates macrophage erythropoietin signalling to promote acute inflammation resolution[J]. Nature Communications， 2016， 7： 12177.

[19] DAVIGNON J L， HAYDER M， BARON M， et al. Targeting

monocytes/macrophages in the treatment of rheumatoid arthritis[J]. Rheumatology， 2013， 52（4）： 590-598.

[20] CHANG Z Y， YEH M K， CHIANG C H， et al. Erythropoietin protects adult retinal ganglion cells against NMDA-， trophic factor withdrawal-， and TNF-α-induced damage[J]. PLoS One， 2013， 8（1）： e55291.