李洋，陳慶良，張帆

1天津醫(yī)科大學研究生院，天津 300070；2天津市胸科醫(yī)院心血管外科，天津 300222；3河北醫(yī)科大學第二醫(yī)院影像科，石家莊 050061

糖尿病是一組以慢性高血糖為特征的全身代謝性疾病，隨著病情進展可出現各種并發(fā)癥，其中糖尿病足壞疽為常見的嚴重并發(fā)癥之一，輕則致足部潰瘍，重則致殘[1]。糖尿病足是一種進行性、慢性、涉及肢體血管與外周神經的特殊疾病，在中醫(yī)學中歸為“脫疽”范疇，臨床表現為肢端疼痛、麻木、潰瘍、感染等。關于糖尿病足壞疽的治療方法，從總體來講是降血糖、控制感染、清創(chuàng)換藥，但從局部來講，皮膚潰瘍治療是炎性細胞與修復細胞等共同參與的復雜生理網絡過程[2]。歷代中醫(yī)學者對脫疽有深入研究，發(fā)現沒藥有祛瘀散血、消腫生肌、止痛活血的功效[3]。Z-沒藥甾酮(Z-guggulsterone，Z-GS)為其主要藥效物質，有消炎、促進創(chuàng)面愈合的作用[4]。本研究通過建立糖尿病皮膚潰瘍大鼠模型，進一步觀察Z-GS治療皮膚潰瘍的作用并探討其可能機制，旨在為相關藥物的開發(fā)提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 7周齡SPF級SD大鼠65只，雌雄各半，體重250～270 g，購自天津市中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院[動物實驗許可證號：SCXK(津)2015-0003；批號：0079418]。實驗前適應性飼養(yǎng)1周，飼養(yǎng)環(huán)境溫度(22±2) ℃，濕度55%～75%，12 h循環(huán)光照，自由攝食、飲水。實驗過程符合國家及單位實驗動物管理規(guī)定。

1.1.2 藥物、主要試劑及儀器 Z-G S(純度≥90%，上海甄準生物科技有限公司)，鏈脲佐菌素(貨號S0130，上海佰世凱化學科技有限公司)，ERK抑制劑PD98059(貨號P215，北京百奧萊博科技有限公司)，復方磺胺嘧啶鋅凝膠劑(批號171203，成都第一藥物研究所有限公司)，白細胞介素-8(interleukin-8，IL-8)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)酶聯免疫試劑盒(上海撫生實業(yè)有限公司)，兔抗鼠CD34單克隆抗體、酶標山羊抗小鼠/兔IgG聚合物(上海碧云天生物技術有限公司)，兔抗大鼠細胞外調節(jié)蛋白激酶(extracellular regulated protein kinase1/2，ERK1/2)、磷酸化ERK1/2(p-ERK1/2)、促絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)、磷酸化MAPK(p-MAPK)、GAPDH單克隆抗體以及辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)標記的山羊抗兔IgG二抗(北京百奧萊博科技有限公司)。HM-200電子天平(上海雙旭電子有限公司)，64R高速冷凍離心機(美國Beckman公司)，Model ELX800酶標儀(美國Bio-Tek公司)，GELDOC2000凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)。

1.2 方法

1.2.1 造模及分組 10只大鼠設為健康組，其余55只大鼠建立糖尿病皮膚潰瘍模型[5]，取0.1 mol/L枸櫞酸鈉緩沖液將鏈脲佐菌素配制成0.45%的溶液，按55 mg/kg體重進行尾靜脈注射，72 h后測定血糖，若空腹血糖值為13.5～25.0 mmol/L，則正式納入皮膚潰瘍造模，即對大鼠腰背兩側去毛，以2 cm×2 cm印筐沾龍膽紫染色后印于皮膚，沿筐壁剪開皮膚，深入至淺筋膜，切除2 cm×2 cm面積的皮膚，造成缺損創(chuàng)面，每日涂抹50%冰醋酸，1周后形成缺損型的皮膚潰瘍大鼠模型。健康組經尾靜脈注射等體積生理鹽水，腰背兩側除毛，不做其他處理，用于對比觀察55只大鼠是否造模成功。造模成功標準：與健康組比較，造模成功大鼠形體偏瘦，毛色發(fā)黃，籠內異味嚴重，進食量、飲水量、排尿量等明顯增多，空腹血糖升高(>16.7 mmol/L)且高于健康組，符合糖尿病的體征與癥狀，不同時間點的創(chuàng)面發(fā)白，分泌物清稀、量少，肉芽生成少且愈合緩慢，符合中醫(yī)陰證瘡瘍的指征。造模期間死亡11只，建模成功44只，隨機分為模型組、Z-GS組、抑制劑+Z-GS組、陽性對照組(n=11)。

1.2.2 干預與取材 造模成功后檢測大鼠空腹血糖值，并于次日開始給藥，先以生理鹽水擦洗創(chuàng)面，拭去分泌物后清潔創(chuàng)面。模型組以凡士林紗條覆蓋創(chuàng)面，陽性對照組予以復方磺胺嘧啶鋅凝膠劑(對應創(chuàng)面在紗條上涂抹3 g軟膏制劑)，Z-GS組予以Z-GS(Z-GS溶于10% DMSO，濃度20 mmol/L)10 μl，抑制劑+Z-GS組予以ERK抑制劑PD98059 300 μg/L+Z-GS 20 mmol/L共計10 μl。1次/d，連續(xù)用藥4周。在給藥1、2、3、4周分別使用透明膜覆蓋創(chuàng)面，以記號筆在邊緣描畫創(chuàng)面大小、形狀，方便計算創(chuàng)面愈合率。創(chuàng)面愈合率(%)=(給藥前創(chuàng)面面積－給藥后創(chuàng)面面積)/給藥前創(chuàng)面面積×100%。給藥4 周后以2%戊巴比妥鈉麻醉大鼠，取創(chuàng)面0.2 cm×0.4 cm大小的肉芽組織，置入4%多聚甲醛溶液中固定。

1.2.3 大鼠血清炎性因子含量測定 在給藥4周后，以2%戊巴比妥鈉麻醉大鼠，腹主動脈取血3 ml，室溫下1500 r/min離心15 min，離心半徑10 cm，取上清液，參考酶聯免疫試劑盒說明書檢測血清IL-8、TNF-α含量，采用酶標儀在492 nm處測定IL-8、TNF-α的光密度值，計算血清IL-8、TNF-α水平。

1.2.4 大鼠潰瘍創(chuàng)面的組織病理學觀察 取已固定的肉芽組織標本進行梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，連續(xù)切片，厚度5 μm。將切片脫蠟至水，浸入蘇木精液染色5 min，自來水沖洗，使切片藍化。蒸餾水沖洗，入伊紅染液復染，脫水、分化、透明、封固，鏡下觀察肉芽組織的形態(tài)學結構，細胞核被蘇木精染成藍色，細胞質、結締組織、嗜酸性顆粒等被染為紅色。

1.2.5 免疫組化法檢測大鼠創(chuàng)面組織中的微血管含量(MVD) 石蠟包埋、切片(5 μm厚)、脫蠟、脫水步驟同上，PBS洗滌，滴加3% H2O2于切片上，室溫靜置10 min，PBS洗滌。切片浸入檸檬酸鹽修復液中，微波抗原修復。滴入一抗(兔抗鼠CD34單克隆抗體)，4 ℃過夜，滴加二抗(酶標山羊抗兔IgG聚合物)，DAB顯色、復染、脫水、封固，以PBS代替一抗作為陰性對照。參考微血管染色試劑盒說明書，染色后切片。光鏡下呈棕褐色或棕黃色顆粒為陽性細胞，隨機選6個視野(×100)，以背景有明確區(qū)別的任意棕褐色或棕黃色的細胞叢為一個血管數量，計算MVD。

1.2.6 Western blotting檢測大鼠潰瘍組織中ERK/MAPK通路相關蛋白的表達 從-80 ℃冰箱中取出已固定的模型組、Z-GS組、抑制劑+Z-GS組大鼠肉芽組織標本20 mg，加入含有蛋白酶抑制劑的細胞裂解液200 μl中研磨，移入1.5 ml EP管內，4 ℃下12 000 r/min離心15 min，取上清，提取含組織總蛋白的蛋白溶液，置于-20 ℃保存。測定蛋白濃度，沸水浴變性10 min，上樣后進行SDS-PAGE電泳，轉PVDF膜。將PVDF膜置入5%脫脂奶粉中封閉，4 ℃過夜后加入一抗(1:1000的兔抗大鼠ERK1/2、p-ERK1/2、MAPK、p-MAPK、GAPDH單克隆抗體)，室溫孵育2 h，TBST洗膜，加入二抗(1:5000的HRP標記的山羊抗兔IgG)，室溫孵育2 h，TBST洗膜后進行ECL顯色反應，曝光、顯影、過水、定影。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以表示，均符合正態(tài)分布；經方差齊性檢驗，創(chuàng)面愈合率、血清炎性因子含量等數據方差齊，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗；ERK/MAPK通路相關蛋白相對表達量數據方差不齊，采用Welch檢驗，進一步比較采用DunnettT3檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 各組大鼠皮膚創(chuàng)面愈合率比較 給藥1、2、3、4周，模型組、抑制劑+Z-GS組、Z-GS組、陽性對照組的皮膚創(chuàng)面愈合率均持續(xù)升高，組間、時間、交互比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。在給藥1、2、3、4周時，與模型組比較，抑制劑+Z-GS組、Z-GS組、陽性對照組皮膚創(chuàng)面愈合率較高(P<0.05)；與陽性對照組比較，抑制劑+Z-GS組、Z-GS組皮膚創(chuàng)面愈合率較低(P<0.05)；與Z-GS組比較，抑制劑+Z-GS組皮膚創(chuàng)面愈合率較低(P<0.05)(表1)。

表1 各組大鼠皮膚創(chuàng)面愈合率比較(%，±s，n=11)Tab.1 Comparison of the healing rate of skin wound of rats in each group (%, ±s, n=11)

表1 各組大鼠皮膚創(chuàng)面愈合率比較(%，±s，n=11)Tab.1 Comparison of the healing rate of skin wound of rats in each group (%, ±s, n=11)

GS. Z-沒藥甾酮；F組間=16.399，P組間<0.001；F時間=25.695，P時間<0.001；F交互=34.785，P交互<0.001；與模型組比較，(1)P<0.05；與陽性對照組比較，(2)P<0.05；與Z-GS組比較，(3)P<0.05；與1周比較，(4)P<0.05；與2周比較，(5)P<0.05；與3周比較，(6)P<0.05。

組別1周2周3周4周FP模型組4.14±0.1610.77±2.1623.97±2.7241.75±2.79607.703＜0.001陽性對照組19.18±1.22(1)30.37±2.16(1)(4)42.75±3.94(1)(4)(5)70.78±4.29(1)(4)(5)(4)(6)541.125＜0.001 Z-GS組10.89±0.75(1)(2)19.56±2.48(1)(2)(4)34.78±3.41(1)(2)(4)(5)51.47±3.14(1)(2)(4)(5)(6)496.821＜0.001抑制劑+Z-GS組6.98±0.24(1)(2)(3)15.34±2.28(1)(2)(3)(4)29.25±2.47(1)(2)(3)(4)(5)46.69±2.88(1)(2)(3)(4)(5)(6)675.968＜0.001

2.2 大鼠血清炎性因子水平變化 大鼠血清IL-8、TNF-α水平組間比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。其中，與模型組比較，抑制劑+Z-GS組、Z-GS組、陽性對照組IL-8、TNF-α水平明顯降低(P<0.05)；與陽性對照組比較，抑制劑+Z-GS組、Z-GS組IL-8、TNF-α水平明顯升高(P<0.05)；與Z-GS組比較，抑制劑+Z-GS組IL-8、TNF-α水平明顯升高(P<0.05)(表2)。

表2 各組血清炎性因子水平(pg/g，±s，n=11)Tab.2 Serum levels of inflammatory factors of rats in each group (pg/g, ±s, n=11)

表2 各組血清炎性因子水平(pg/g，±s，n=11)Tab.2 Serum levels of inflammatory factors of rats in each group (pg/g, ±s, n=11)

Z-GS. Z-沒藥甾酮；與模型組比較，(1)P<0.05；與陽性對照組比較，(2)P<0.05；與Z-GS組比較，(3)P<0.05。

組別IL-8TNF-α模型組258.15±7.9580.21±7.45陽性對照組177.56±5.18(1)50.45±2.12(1)Z-GS組204.11±6.71(1)(2)61.48±3.64(1)(2)抑制劑+Z-GS組233.18±8.48(1)(2)(3)73.16±4.26(1)(2)(3)F 260.10882.646 P<0.001<0.001

2.3 大鼠皮膚潰瘍創(chuàng)面的病理學觀察結果 模型組大鼠新生表皮菲薄，真皮有大量炎性細胞浸潤，散見成纖維細胞，毛細血管、膠原纖維少見。與模型組比較，陽性對照組新生皮膚結構近完整，炎性細胞浸潤少見，毛細血管含量豐富，膠原纖維較粗；抑制劑+Z-GS組、Z-GS組表皮明顯增厚，創(chuàng)面覆蓋較厚痂皮，炎性細胞浸潤減少，毛細血管含量豐富，膠原纖維細少；與陽性對照組比較，抑制劑+Z-GS組、Z-GS組新生皮膚欠完整，炎性細胞浸潤相對較多，毛細血管、膠原纖維欠豐富(圖1)。

圖1 大鼠皮膚潰瘍創(chuàng)面病理學觀察(HE ×40)Fig.1 Pathology of skin ulcer wounds of rats (HE ×40)

2.4 大鼠皮膚潰瘍創(chuàng)面中的MVD CD34為常用的血管內皮細胞特異性標記物，表達于血管內皮細胞的細胞質。給藥4周后，模型組、抑制劑+Z-GS組、Z-GS組、陽性對照組大鼠創(chuàng)面MVD分別為(3.33±0.67)條/mm2、(5.14±0.48)條/mm2、(8.63±0.47)條/mm2、(14.78±0.49)條/mm2，呈逐漸增高趨勢(P<0.05，圖2)。

圖2 大鼠皮膚潰瘍創(chuàng)面中的MVD(免疫組化染色 ×100)Fig.2 Microvessel density in rat skin ulcer wounds (Immunohistochemistry ×100)

2.5 大鼠皮膚潰瘍組織中E R K/M A P K 通路相關蛋白的表達水平 大鼠創(chuàng)面組織中ERK1/2、M A P K 蛋白相對表達量組間比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。與模型組比較，抑制劑+Z-GS組、Z-GS組p-ERK1/2、p-MAPK蛋白表達水平較高(P<0.05)；與Z-GS組比較，抑制劑+Z-GS組p-ERK1/2、p-MAPK蛋白表達水平較低(P<0.05)(表3、圖3)。

圖3 Western blotting檢測大鼠皮膚潰瘍組織ERK/MAPK通路相關蛋白表達Fig.3 Protein expression of ERK/MAPK pathway in rats' skin ulcer tissue by Western blotting

表3 各組大鼠皮膚潰瘍組織中ERK/MAPK通路相關蛋白表達水平(±s，n=11)Tab.3 Expression levels of ERK/MAPK pathway related proteins in skin ulcer tissues of rats in each group (±s, n=11)

表3 各組大鼠皮膚潰瘍組織中ERK/MAPK通路相關蛋白表達水平(±s，n=11)Tab.3 Expression levels of ERK/MAPK pathway related proteins in skin ulcer tissues of rats in each group (±s, n=11)

與模型組比較，(1)P<0.05；與Z-GS組比較，(2)P<0.05。

組別ERK1/2p-ERK1/2MAPKp-MAPK模型組0.75±0.110.22±0.030.56±0.150.12±0.03 Z-GS組0.71±0.110.42±0.06(1)0.52±0.090.35±0.05(1)抑制劑+Z-GS組0.74±0.150.35±0.04(1)(2)0.51±0.110.24±0.02(1)(2)F 0.31083.6590.418152.908 P 0.818<0.0010.741<0.001

3 討 論

慢性皮膚潰瘍多因手術切口、意外創(chuàng)傷、糖尿病、下肢靜脈曲張等引起，屬于臨床難治性疾病。近年來，伴隨糖尿病發(fā)生率的增高，糖尿病所致并發(fā)癥——皮膚潰瘍也隨之增多，國外報道糖尿病患者一生中有25%的概率并發(fā)糖尿病足壞疽，是導致患者截肢的主要原因[6]。糖尿病足壞疽與下肢遠端神經異常、周圍血管病變相關，病因復雜，發(fā)病機制涉及細胞、分子、基因等，但其具體機制目前尚不清楚，目前多認為與骨質異常、外周神經疾病、傷口微循環(huán)障礙、傷口愈合有關蛋白質表達等有關[7]。對于中藥促進創(chuàng)面愈合的作用機制，目前多從促進創(chuàng)面血液循環(huán)、創(chuàng)面修復、細胞信號傳導通路等方面進行探索。Z-GS為中藥沒藥的主要活性成分，具有抗炎、抗氧化、改善血管內皮功能等作用，應用前景廣闊，已證實其在局灶性腦缺血、缺血性腦卒中的治療中有促進新生血管網絡建立等作用，因此推測將其用于皮膚潰瘍的治療具有一定可行性[8]。

本研究采用注射鏈脲佐菌素+皮膚缺損的方法建立糖尿病皮膚潰瘍大鼠模型，其癥狀表現、創(chuàng)面愈合率變化(呈時間依賴性)基本符合慢性皮膚潰瘍的造模要求。在實驗的不同時間點，從模型組到抑制劑+Z-GS組、Z-GS組，大鼠皮膚創(chuàng)面愈合率依次升高，提示Z-GS可促進糖尿病大鼠皮膚潰瘍創(chuàng)面的愈合。HE染色結果顯示，與模型組比較，Z-GS組潰瘍處新生表皮厚度、結構及炎癥浸潤等明顯改善，進一步提示Z-GS在創(chuàng)面愈合中具有祛腐生肌的作用。IL-8、TNF-α是促炎癥反應中最活躍的細胞因子，在創(chuàng)面修復乃至機體生存中均具有重要作用[9-10]。IL-8主要生物學功能為將中性粒細胞、T淋巴細胞趨化到病灶部位，發(fā)揮促炎作用。TNF-α是誘發(fā)感染性疾病的重要炎癥機制，其生物學活性廣泛，既可殺傷或抑制腫瘤細胞，亦可增強中性粒細胞的吞噬功能，刺激IL-8分泌，引發(fā)惡病質、感染性休克等[11]。強烈、持續(xù)的炎癥反應可殺傷正常細胞，阻礙創(chuàng)面修復。本研究結果顯示，Z-GS組大鼠血清IL-8、TNF-α水平均低于模型組，提示Z-GS可通過降低炎性因子水平促進皮膚創(chuàng)面的愈合[12]。創(chuàng)面愈合是一個連續(xù)、復雜的過程，肉芽組織形成是創(chuàng)面修復愈合的關鍵步驟，因此創(chuàng)面新生血管生成具有重要意義[13]。CD34是血管內皮的標志物，選擇性表達于小血管內皮細胞，經免疫組化實驗可標記創(chuàng)面肉芽組織切片中的微血管[14]。本研究發(fā)現，Z-GS組皮膚創(chuàng)面MVD高于模型組，提示Z-GS可促進創(chuàng)面微血管生成，加速肉芽組織生長，改善微循環(huán)，從而發(fā)揮去腐生肌的作用。

ERK/MAPK通路是炎性因子、生長因子、細胞因子等多種因子發(fā)揮作用的主要信號轉導通路，是調節(jié)細胞生長、發(fā)育、分裂的信號網絡核心[15]。MAPK廣泛存在于真核細胞的細胞質中，是高度保守的一類絲氨酸蛋白酶，是多種細胞因子向核內傳導信號的公共途徑，調控機體的諸多生理活動，參與細胞分化、增殖、分裂與凋亡等過程。ERK是MAPK家族中的一員，其觸發(fā)因素包括多種蛋白、激酶、細胞因子、生長因子等[16]。ERK1/2是以脯氨酸為導向的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，具有廣泛的催化活性，激活后可進入細胞核，磷酸化底物，促進細胞增殖。肖敏等[17]發(fā)現，慢性皮膚潰瘍創(chuàng)面長期不愈合與炎癥反應、ERK/MAPK通路有關。近年來，ERK/MAPK通路在潰瘍發(fā)病過程中的作用備受關注，彭海娟等[18]發(fā)現，ERK信號通路可促進潰瘍性結腸炎大鼠腸上皮細胞的分化與增殖，并抑制凋亡，提示ERK信號通路與潰瘍愈合有關。本研究結果顯示，從模型組到抑制劑+Z-GS組、Z-GS組，大鼠創(chuàng)面組織中p-ERK1/2、p-MAPK蛋白表達水平依次升高，提示Z-GS可能是通過激活ERK/MAPK通路來治療皮膚潰瘍的。

綜上所述，Z-GS可能通過激活ERK/MAPK通路對糖尿病大鼠皮膚潰瘍發(fā)揮祛腐生肌作用。因條件受限，本研究樣本量較小，且僅檢測了ERK/MAPK通路蛋白的表達，皮膚潰瘍的病理機制及Z-GS的治療機制均較復雜，該藥物治療皮膚潰瘍是否通過其他信號通路，仍有待進一步深入研究。