劉豪杰 陳雪蕾

〔摘要〕 目的 探討蘆薈大黃素對胃癌SGC-7901細胞Cav-1/PTEN/PI3K/PKB信號通路及侵襲、轉移的影響。方法 將復蘇后胃癌SGC-7901細胞分為空白組、對照組和實驗組，空白組給予滅活胎牛血清的MEM培養(yǎng)基正常培養(yǎng)，對照組及實驗組在空白組基礎上分別加入姜黃素40 μmol/L和蘆薈大黃素50 μmol/L培養(yǎng)，3組細胞均培養(yǎng)24 h。采用劃痕實驗檢測細胞遷移閉合率，采用Transwell小室檢測侵襲細胞個數(shù)，采用Western blot檢測上皮間質化（EMT）相關蛋白E鈣黏蛋白（E-cad）、N鈣黏蛋白（N-cad）、波形蛋白（Vim）以及基質金屬蛋白-9（MMP-9）、小窩蛋白-1（Cav-1）、PTEN磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）、蛋白激酶B（PKB）信號通路的表達。結果 與空白組比較，對照組及實驗組細胞劃痕閉合率及侵襲細胞數(shù)均降低（P<0.05），Vim、N-cad、PI3K、PKB、MMP-9蛋白表達降低（P<0.05），E-cad、Cav-1、PTEN蛋白表達升高（P<0.05）;與對照組比較，實驗組細胞劃痕閉合率、侵襲細胞數(shù)及上述蛋白表達均無明顯差異（P>0.05）。結論 蘆薈大黃素可抑制胃癌SGC-7901細胞遷移及侵襲能力，其機制可能與抑制EMT及改善Cav-1/PTEN/PI3K/PKB信號通路表達有關。

〔關鍵詞〕 蘆薈大黃素;胃癌細胞;SGC-7901;小窩蛋白-1;PTEN磷脂酰肌醇-3激酶;蛋白激酶B;遷移;侵襲

〔中圖分類號〕R285.5? ? ? ?〔文獻標志碼〕A? ? ? ?〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2021.06.002

Effects of Aloe Emodin on Cav-1/PTEN/PI3K/PKB Signaling Pathway， Invasion and

Metastasis of Gastric Cancer SGC-7901 Cells

LIU Haojie， CHEN Xuelei

（Department of Gastroenterology， Ezhou Central Hospital， Ezhou， Hubei 436000， China）

〔Abstract〕 Objective To investigate the effects of aloe emodin on Cav-1/PTEN/PI3K/PKB signaling pathway， invasion and

metastasis of gastric cancer SGC-7901 cells. Methods After resuscitation， SGC-7901 cells were divided into blank group， control group and experimental group， the blank group was treated with MEM medium containing inactivated fetal bovine serum， on the basis of the blank group， the control group and experimental group were cultured with curcumin 40 μmol/L and aloe emodin 50 μmol/L， respectively. The three groups of cells were cultured for 24 hours. The migration and closure rate of cells was detected by scratch test， the number of invasive cells was detected by Transwell chamber， and the expression levels of epithelial mesenchymal transition （EMT） related proteins E-cadherin （E-cad）， N-cadherin （N-cad）， vimentin （Vim）， matrix metalloproteinase-9 （MMP-9）， caveolin-1 （Cav-1）， PTEN phosphatidylinositol-3 kinase （PI3K） and protein kinase B （PKB） signaling pathways were detected by Western blot. Results Compared with the blank group， the wound closure rate and the number of invasive cells in the control group and experimental group were decreased （P<0.05）， and the expression levels of Vim， N-cad， PI3K， PKB and MMP-9 protein were decreased （P<0.05）， while the expression levels of E-cad， Cav-1 and PTEN protein were increased （P<0.05）. Compared with the control group， there were no significant differences in wound closure rate， number of invasive cells and expression of the above proteins in the experimental group （P>0.05）. Conclusion Aloe emodin can inhibit the migration and invasion of gastric cancer SGC-7901 cells， and its mechanism may be related to the inhibition of EMT and the improvement of Cav-1/PTEN/PI3K/PKB signal pathway expression.

〔Keywords〕 aloe emodin; gastric cancer cell; SGC-7901; caveolin-1; PTEN phosphatidylinositol-3 kinase; protein kinase B; migration; invasion

胃癌由于其發(fā)病隱匿，發(fā)現(xiàn)時多為中、晚期，已延誤最佳治療時機，據(jù)報道，我國每年新發(fā)胃癌病例50萬，居惡性腫瘤發(fā)病率第3位[1]。因此，尋找多靶點、高效抗胃癌藥物是目前亟待解決的問題。蘆薈大黃素可從大黃和蘆薈中提取，已被證實有明顯的抗腫瘤作用，并且抗腫瘤靶點廣泛[2-4]。本團隊在前期研究[5-6]中證實，蘆薈大黃素能誘導胃癌細胞自噬及凋亡，并且使癌細胞生物學行為能力降低，雖然已對蘆薈大黃素抑制胃癌細胞增殖的部分機制進行了探索，但該藥抑制胃癌細胞遷移及侵襲能力的機制尚不完全清晰。本研究基于前期研究結果，探索蘆薈大黃素抑制胃癌SGC-7901細胞遷移、增殖的深層機制，并采用姜黃素作為陽性對照藥物，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1? 實驗細胞、試劑及儀器

胃癌細胞SGC-7901由廣西中醫(yī)藥大學陳文禮教授團隊贈送。RPMI 1640培養(yǎng)基二甲基亞砜（沈陽萬類生物科技有限公司，貨號：s368d62、Z65482）;Transwell小室（北京沃凱生物科技有限公司，貨號：LM628Z727，批號2020305）;E鈣黏蛋白（E-cadherin， E-cad）、小窩蛋白-1（caveolin-1， Cav-1）、N鈣黏蛋白（N-cadherin， N-cad）一抗（英國Abcam公司，貨號：ab76319、ab2910、ab18203）;磷脂酰肌醇-3激酶（phosphatidylinositol 3-kinase， PI3K）、蛋白激酶B（protein kinase B， PKB）、波形蛋白（vimentin， Vim）一抗（南京建成生物工程研究所，貨號：KF275、H233-3、KF685）;人第10號染色體缺失的磷酸酶（phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten， PTEN）一抗（武漢艾美捷科技公司，貨號：PAB4118）;基質金屬蛋白酶-9（matrix metalloprotein， MMP-9）一抗（美國BioVision公司，貨號：3969-30T）。muLISKAN-MK3酶標儀（美國賽默飛世爾公司）;Mini-Protean型小垂直板電泳和轉印系統(tǒng)（美國伯樂公司）。

1.2? 細胞培養(yǎng)及分組

取SGC-7901細胞進行復蘇并接種于6孔板，細胞密度為4×103個/孔，培養(yǎng)至對數(shù)期。將細胞分為空白組、對照組及實驗組，空白組細胞給予滅活胎牛血清的MEM培養(yǎng)基正常培養(yǎng)，對照組在空白組基礎上加入姜黃素40 μmol/L培養(yǎng)[7]，實驗組細胞在空白組基礎上加入蘆薈大黃素50 μmol/L培養(yǎng)[5-6]。

1.3? 劃痕實驗檢測細胞遷移能力

取處于對數(shù)生長期SGC-7901細胞，接種并平鋪于6孔板中，注意調整細胞分布密度，每孔約接種5×105個細胞，用手輕搖6孔板，細胞分布均勻后平置于實驗臺5 min，分組方法及加入藥物劑量同“1.2”項，放入細胞恒溫培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，定期觀察細胞生長情況，待細胞長滿后用移液器槍頭縱向劃線，加入PBS溶液清洗劃痕位置3次，繼續(xù)孵育24 h，取出后于光學顯微鏡下拍照，并應用Image J軟件分析劃痕實驗結果。

劃痕閉合率=（劃痕寬度0 h-劃痕寬度24 h）/劃痕寬度0 h×100%

1.4? Transwell小室檢測細胞侵襲能力

取處于對數(shù)生長期的SGC-7901細胞，用無菌血清將SGC-7901細胞調成細胞混懸液接種于6孔板中，分組方法及加入藥物同“1.2”項。再用無菌血清將Matrigel基質膠稀釋為初始濃度的12.5%，取出Transwell小室，將稀釋后的基質膠向每個小室注入30 μL，均勻鋪于底部，待30 min后基質膠凝固，向每孔注入密度為1×104個/孔SGC-7901細胞，種于上層小室，下層小室沿壁緩慢注入500 μL含10% FBS的培養(yǎng)基，在37 ℃條件下，放入細胞恒溫培養(yǎng)箱中24 h，取出小室后用PBS溶液沖洗掉上層細胞，用4% Paraformaldehyde固定30 min，再用PBS溶液進行清洗，加入結晶紫染色液，固定15 min后PBS溶液清漂去多余染色液，顯微鏡下拍照并計算細胞透膜數(shù)量（即為侵襲細胞數(shù)）。

1.5? Western blot法檢測蛋白表達水平

取“1.2”項各組細胞，培養(yǎng)24 h后細胞進行裂解并制備成電泳上樣液，BCA法檢測上樣液濃度后計算具體上樣量，配制10% SDS-PAGE進行電泳，切膠后用PVDF膜進行轉膜，經封閉、洗膜后，孵育Vim、N-cad、E-cad、Cav-1、PTEN、PI3K、PKB及MMP-9一抗（均1∶1 000稀釋）過夜，次日經洗膜后常溫下孵育二抗，時間為90 min，洗膜3次后用吸水紙吸干膜上多余液體，放入暗室內進行化學發(fā)光反應，應用Image J軟件進行分析。實驗獨立重復3次。

目標蛋白表達=目的蛋白灰度值/β-actin灰度值

1.6? 統(tǒng)計學處理

本研究數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0軟件進行分析，計數(shù)資料以“x±s”表示，滿足正態(tài)分布及方差齊性時，使用單因素方差分析及LSD檢驗，不滿足正態(tài)分布及方差齊性時使用秩和檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1? 蘆薈大黃素對SGC-7901細胞遷移能力的影響

對照組[（51.23±5.33）%]及實驗組[（42.37±3.68）%]劃痕閉合率均低于空白組[（83.61±6.29）%]，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;與對照組比較，實驗組劃痕閉合率差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見圖1。

2.2? 蘆薈大黃素對SGC-7901細胞侵襲能力的影響

對照組[（88.25±10.42）個]及實驗組[（72.38±8.26）個]每視野下侵襲細胞數(shù)均低于空白組[（236.84±19.62）個]，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;與對照組比較，實驗組侵襲細胞數(shù)差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見圖2。

2.3? 蘆薈大黃素對SGC-7901細胞EMT相關蛋白表達的影響

與空白組比較，對照組及實驗組Vim、N-cad表達降低，E-cad表達升高，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;與對照組比較，實驗組Vim、N-cad、E-cad蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見圖3、表1。

2.4? 蘆薈大黃素對SGC-7901細胞Cav-1、PTEN、PI3K、PKB、MMP-9蛋白表達的影響

與空白組比較，對照組及實驗組Cav-1、PTEN蛋白表達升高，PI3K、PKB、MMP-9蛋白表達降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;與對照組比較，實驗組Cav-1、PTEN、PI3K、PKB、MMP-9蛋白表達無統(tǒng)計學差異（P>0.05）。見圖4、表2。

3 討論

人體胃部血供豐富，給胃癌細胞的生長、增殖提供了便利環(huán)境，導致胃癌發(fā)展迅速，且易轉移[8]。據(jù)統(tǒng)計，胃癌患者的死因主要源于腫瘤細胞的遠端轉移及淋巴結轉移[9]。已有研究[10]證實，腫瘤組織的大小及浸潤程度是腫瘤發(fā)生轉移的重要因素，并且其對周圍組織浸潤深度的增加與是否發(fā)生淋巴結轉移存在明顯相關性。因此，抑制胃癌細胞轉移及侵襲能力有可能成為降低患者死亡率的有效方法。

中藥及中藥單體的抗腫瘤作用已成為目前的研究熱點之一，已有研究[11]顯示，姜黃素、白三草酮、黃芩素及白藜蘆醇均可抑制腫瘤細胞EMT的發(fā)生，并可通過多靶點及信號通路，降低腫瘤細胞的遷移能力。其中，姜黃素已被證實可通過抑制β-catenin/EMT，抑制腫瘤細胞遷移能力[12]，同時抑制JAK/STAT3信號通路，以降低腫瘤細胞的侵襲能力[13]，其抗腫瘤靶點與本研究主要內容相似，故而將姜黃素作為本研究的陽性對照藥物。本團隊在前期研究[6]中已證實，蘆薈大黃素濃度為50 μmol/L時是抑制胃癌SGC-7901細胞生物學行為的最佳濃度，故而在本研究中繼續(xù)沿用。本研究中細胞劃痕實驗及Transwell小室證實，蘆薈大黃素可有效降低胃癌SGC-7901細胞劃痕閉合率及侵襲細胞數(shù)，說明其對SGC-7901細胞遷移能力和侵襲能力均具有較好的抑制作用。EMT是腫瘤細胞移行“種植”的第一步，當EMT發(fā)生時，腫瘤細胞去除自己原有并未“發(fā)育”完全的上皮細胞特性，轉化為與“種植”處組織或器官相關的間充表型特征，獲得侵襲和遷移能力，隨著血液循環(huán)或體液循環(huán)，侵襲其他組織、器官，定植增殖，實現(xiàn)遠端或近端轉移[14]。因此，EMT相關蛋白Vim、N-cad、E-cad也被視為腫瘤細胞發(fā)生遷移及侵襲的分子學水平標記物。本團隊通過Western blot檢測證實，蘆薈大黃素可有效降低SGC-7901細胞中Vim、N-cad表達，提高E-cad表達水平，從蛋白層面說明蘆薈大黃素對SGC-7901細胞侵襲及遷移能力具有抑制作用，這與細胞劃痕實驗及Transwell小室實驗結果趨勢相同。

小窩蛋白與脂類共同形成細胞質膜小窩，對細胞間信號傳導及信號調節(jié)起關鍵作用[15]。細胞質膜小窩中Cav-1是主要支架蛋白，可橫跨細胞質膜，同時對細胞外微環(huán)境刺激具有抵抗作用[16]。已有研究[17]證實，Cav-1是人體細胞中重要的抗癌蛋白之一，對腫瘤相關成纖維細胞增殖、細胞外基質及腫瘤新生血管均有抑制作用。此外，Cav-1被證實與PTEN存在結合序列，是細胞質膜PTEN表達水平的決定因素，二者共同發(fā)揮抑制腫瘤細胞遷移的作用[18]。臨床研究[19]證實，PTEN在胃癌腫瘤組織中呈低表達，與腫瘤分期明顯呈負相關，從臨床角度說明PTEN的缺失可能是胃癌進展的關鍵因素。PI3K/PKB是PTEN下游的經典信號通路，當PTEN表達升高時，可使磷脂酰肌醇-3去磷酸化，從而使PI3K及PKB活性降低，抑制下游MMPs表達，實現(xiàn)抑制腫瘤細胞遷移及侵襲的目的;另外，PTEN/PI3K/PKB信號通路與胃癌細胞增殖、凋亡及細胞周期的調控均明顯相關，對于抑制胃癌細胞生長具有重要意義[20]。本研究通過Western blot檢測Cav-1/PTEN/PI3K/PKB信號通路及下游MMP-9蛋白表達，結果表明蘆薈大黃素可使SGC-7901細胞中Cav-1、PTEN表達升高，PI3K、PKB、MMP-9表達降低，說明Cav-1是蘆薈大黃素抑制胃癌細胞遷移的作用靶點之一，其可能通過提高Cav-1、PTEN表達，抑制PI3K/PKB通路蛋白及下游MMP-9蛋白表達，從而抑制細胞基質的形成，改善腫瘤細胞微環(huán)境，抑制SGC-7901細胞遷移能力及侵襲能力。本研究亦有不足之處，由于技術條件及經費的限制，并未對Cav-1其他下游信號通路采用相應阻斷劑進行干擾，結論的嚴謹性欠佳，本研究的不足之處，將在下一步研究中加以完善。

綜上所述，蘆薈大黃素可抑制胃癌SGC-7901細胞遷移及侵襲能力，其機制可能與抑制腫瘤細胞EMT及改善Cav-1/PTEN/PI3K/PKB信號通路表達有關。

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